JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

שלפוחיות חוץ-תאיות טומנות בחובן הבטחה עצומה ליישומים ביו-רפואיים, אך שיטות הבידוד הנוכחיות גוזלות זמן רב ואינן מעשיות לשימוש קליני. במחקר זה אנו מציגים מכשיר מיקרופלואידי המאפשר בידוד ישיר של בועיות חוץ-תאיות מכמויות גדולות של נוזלים ביולוגיים באופן רציף ובמינימום צעדים.

Abstract

שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) טומנות בחובן פוטנציאל עצום ליישומים ביו-רפואיים שונים, כולל אבחון, אספקת תרופות ורפואה רגנרטיבית. עם זאת, המתודולוגיות הנוכחיות לבידוד כלי רכב חשמליים מציבות אתגרים משמעותיים, כגון מורכבות, צריכת זמן והצורך בציוד מגושם, המעכב את תרגומם הקליני. כדי להתמודד עם מגבלות אלה, שאפנו לפתח מערכת מיקרופלואידית חדשנית המבוססת על קופולימר או-סטויכיומטריה מחזורי של אולפין תיול-אן (COC-OSTE) לבידוד יעיל של כלי רכב חשמליים מדגימות בנפח גדול באופן רציף. על ידי ניצול הפרדה מבוססת גודל וציפה, הטכנולוגיה ששימשה במחקר זה השיגה התפלגות גודל צרה משמעותית בהשוואה לגישות קיימות מדגימות שתן ומדיה תאית, ואפשרה מיקוד של שברים ספציפיים בגודל EV ביישומים עתידיים. תכנון ההתקן המיקרופלואידי החדשני COC-OSTE שלנו, המשתמש בטכנולוגיית שבר זרימת שדה זרימה אסימטרית מפוצלת, מציע גישה פשוטה ורציפה לבידוד EV עבור דגימות בנפח גדול. יתר על כן, הפוטנציאל לייצור המוני של התקן מיקרופלואידי זה מציע מדרגיות ועקביות, מה שהופך את שילוב בידוד הרכב החשמלי לאפשרי באבחון קליני שגרתי ובתהליכים תעשייתיים, שבהם עקביות ותפוקה גבוהות הן דרישות חיוניות.

Introduction

שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) הן חלקיקים הקשורים לקרום התא הכוללים שני סוגים עיקריים: אקסוזומים (30-200 ננומטר) ומיקרו-שלפוחיות (200-1000 ננומטר)1. אקסוזומים נוצרים באמצעות ניצנים פנימיים של הממברנה האנדוזומלית בתוך גוף רב-שלפוחית (MVB), ומשחררים שלפוחיות תוך-לומינליות (ILVs) לתוך החלל החוץ תאי באיחוי עם קרום פלזמה1. לעומת זאת, מיקרובועיות נוצרות על ידי ניצנים חיצוניים וביקוע של קרום התא2. כלי רכב חשמליים ממלאים תפקיד מכריע בתקשורת בין-תאית על ידי הובלת חלבונים, חומצות גרעין, שומנים ומטבוליטים, המשקפים את המצב הפיזיולוגי של התא, כולל גדילה, אנגיוגנזה, גרורות, שגשוג ועמידות לטיפול3. כתוצאה מכך, הם התגלו כסמנים ביולוגיים מבטיחים וכמטרות טיפוליות למחלות, כולל סרטן, תוך הדגשת הפוטנציאל שלהם במערכות אבחון ואספקת תרופות4.

כדי לנצל באופן מלא את כלי הרכב החשמליים באבחון מחלות וטיפולים, בידוד יעיל מנוזלים ביולוגיים שונים הוא חיוני5. שיטות נפוצות כוללות אולטרה-צנטריפוגה (UC), צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות, כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל (SEC), סינון ובידוד חיסוני6. UC היא טכניקה נפוצה אך עשויה להניב חלקיקים בעלי צפיפות דומה שאינם EVs ויכולה ליצור אגרגטים של EV7. SEC צברה פופולריות בשל יכולתה לספק דגימות טוהר גבוהות יותר על ידי אי הכללת חלקיקים על בסיס גודל ולא צפיפות8. עם זאת, בחירה זהירה של גודל הנקבוביות המתאים לעמודת SEC ואופטימיזציה של תנאי הכרומטוגרפיה חיוניים כדי למזער בידוד משותף של חלקיקים לא רצויים כמו כילומיקרונים וליפופרוטאינים בצפיפות נמוכה8. למרות יעילותן, שתי השיטות גוזלות זמן רב ומאתגרות לאוטומציה, במיוחד עבור דגימות בנפח גדול יותר כמו מדיה סלולרית או שתן, מה שמגביל את יכולת ההרחבה שלהן עבור יישומים תעשייתיים9.

בשנים האחרונות, שבר שדה זרימת שדה אסימטרי (A4F) התפתח כטכניקת הפרדה רבת עוצמה עבור גודל וציפה מבוססת מיקרו וציפה חלקיקים בגודל מיקרו וננומטר10. עקרון הפעולה של A4F מסתמך על תעלה מיקרופלואידית בעלת קרום נקבובי בבסיסה, המייצרת כוח המופעל כלפי הממברנה הנקרא זרימה צולבת10. בשילוב עם תנועה בראונית וזרימת פואזיל הטבועה במערכת, זרימה צולבת מאפשרת הפרדת חלקיקים יעילה עקב מיקום חלקיקים משתנה בתוך דינמיקת הזרימה11. למרות היתרונות, שיטה זו מוגבלת לנפחי דגימה בטווח המיקרוליטר12 ודורשת שלב מיקוד נוסף, המאריך את משך התהליך10.

במהלך העשור האחרון, מיקרופלואידיקה צברה בולטות ככלי להפרדה מהירה, יעילה ואמינה קלינית של EV13. עם זאת, רוב השיטות המיקרופלואידיות המתוכננות להפרדת EV ממוטבות עבור דגימות EV בנפח קטן ובריכוז גבוה או תלויות בהליכי הפרדה מורכבים14. יתר על כן, בתחום המיקרופלואידיקה, פולידימתילסילוקסאן (PDMS) מוכר כחומר תקן הזהב בשל השקיפות האופטית שלו, תאימות ביולוגית וקלות השימוש15. עם זאת, נטייתו הידועה לספוג מולקולות ליפופיליות קטנות, כולל כלי רכב חשמליים, עלולה להיות בעייתית ליישומו בתחום הרכב החשמלי13.

קופולימר אולפין מחזורי (COC) הוא חומר נפוץ במיקרופלואידיקה עקב תאימות ביולוגית, ספיגה קטנה של מולקולות ועמידות כימית גבוהה15. עם זאת, ייצור של מכשירי COC כרוך לעתים קרובות בתהליכים מורכבים או ציוד מיוחד16. לחלופין, off-stoichiometry thiol-ene (OSTE) הוא חלופה מבטיחה PDMS בשל ספיגה מופחתת של מולקולות קטנות, יציבות כימית מעולה, קלות ייצור, תהליך ייצור מדרגי17,18. עם זאת, בשל חיבורים מורכבים לצנרת, מכשירים עלולים להיות מועדים לדליפה19.

מטרת מחקר זה הייתה להנדס ולייצר מכשיר מיקרופלואידי המשלב OSTE ו-COC ועקרון A4F מפוצל להפרדת EV מדגימות בנפח גדול כגון שתן או מדיה תאית.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

איסוף הדגימות אושר על ידי ועדת האתיקה למחקר מדעי החיים ומדעי הרפואה של אוניברסיטת לטביה (החלטה N0-71-35/54)

הערה: החומרים ששימשו במחקר זה כלולים בקובץ טבלת החומרים .

1. ייצור עובש מודפס תלת מימדי (3D)

  1. עצבו תבנית נגטיב כפול בצורת סרפנטין בתוכנת CAD עם המידות הבאות עבור הערוץ העליון: גובה של 0.5 מ"מ, רוחב של 1 מ"מ ואורך של 210 מ"מ. עבור הערוץ התחתון, השתמש באותו עיצוב עם רוחב של 1.5 מ"מ, גובה של 0.6 מ"מ ואורך של 210 מ"מ. מידות כגון רוחב, אורך, גובה ואיור איזומטרי של עיצוב מוצגים באיור 1. שמור את העיצוב כקובץ .stl.
  2. הכן את הקובץ ב- Z-Suite; אין צורך להוסיף תמיכה. הדפס את התבניות באמצעות מדפסת תלת-ממד Ultraviolet liquid Crystal Display (UV LCD) עם שרף שחור קשיח.
  3. לאחר ההדפסה, הסר בזהירות את התבניות משטח המדפסת. שטפו את התבניות באיזופרופנול (IPA) בסוניקציה במשך 20 דקות.
  4. לייבש את התבניות עם N2.
  5. חשפו את התבניות לחשיפה להצפה באמצעות מסנן ND33 למשך 810 שניות, ולאחר מכן הכניסו אותן לתנור בטמפרטורה של 60°C למשך 48 שעות.

2. הכנת תבניות PDMS

  1. משקל PDMS ביחס של 10:1 w/w (עבור כל תבנית, השתמש ב-16 גרם של בסיס אלסטומר ו-1.6 גרם של חומר cross-linking). מערבבים את הרכיבים במערבל צנטריפוגלי פלנטרי, מערבבים במשך דקה אחת ב-500 סל"ד.
  2. יצקו את ה-PDMS המעורב לתוך התבניות המודפסות בתלת-ממד ודגהו במייבש ואקום במהירות של -800 mbar למשך 30 דקות או עד שלא נצפו בועות.
  3. הניחו בזהירות תוחם פוליוויניל כלוריד בעובי 100 מיקרומטר על גבי PDMS נוזלי.
    הערה: יש למרוח את התוחם באיטיות מצד אחד לאחר כדי למנוע היווצרות בועות.
  4. הכנס את התבנית עם PDMS לתוך ג'יג Mold-in-Place והדק את הג'יג באמצעות מפתח מומנט המוגדר ל- 0.3 ננומטר.
  5. הכניסו את הג'יג לתנור בטמפרטורה של 60°C למשך 3 שעות כדי לרפא PDMS.
  6. לפרק את הג'יג באמצעות מקש hex ולהסיר את התבנית המודפסת בתלת-ממד מהג'יג.
  7. בטלו בזהירות תבניות PDMS מתבניות האב המודפסות בתלת-ממד, רצו סביב קצוות התבנית עם אזמל, ולאחר מכן הסירו את התבנית בפינצטה.
    הערה: להסרת עובש קלה יותר, ניתן להשתמש ב- IPA; עם זאת, יש לחמם את התבניות ב -60 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לאחר מכן כדי לאדות עודף IPA.

3. הכנת ערוץ OSTE-COC עליון

  1. משקל OSTE ביחס של 1.09:1 ואט/ואט (עבור 5 מכשירים, נדרשים 1.56 גרם של חלק A ו-1.44 גרם של חלק B). ערבבו את הרכיבים במערבל צנטריפוגלי פלנטרי: ערבבו במשך 5 דקות ב-750 סל"ד, ואז הורידו גז למשך 5 דקות ב-750 סל"ד.
  2. מעבירים את ה-OSTE המעורב לצינור צנטריפוגה ומפיגים ב-800mbar במייבש ואקום למשך 30 דקות.
  3. נקו את מגלשות COC עם 2 מחברי mini Luer בגודל 16 x באמצעות סוניקציה ב-IPA למשך 10 דקות. יבשו בזהירות את המגלשות עם N2.
  4. הניחו את מחליקי ה-COC הנקיים לתוך משטח הפלזמה כך שהמשטח השטוח יונח כלפי מעלה, וטפלו במשטח עם פלזמה חמצן של 800 SCCM למשך 2 דקות בהספק של 700 W עם לחץ של 0.133 mbar.
  5. הניחו את שקופית ה-COC המחומצנת על תבנית PDMS עבור התעלה העליונה, כך שהמשטח המטופל יהיה במגע עם המשטח המובנה של PDMS. הכניסו את המכלול לתוך ג'יג Mold-in-Place, הדקו את הג'יג עם מפתח מומנט שנקבע ל-0.3 ניוטון מטר.
  6. חבר את מערכת הלחץ לקו האוויר הדחוס ב- 6 בר. קח את צינור הצנטריפוגה עם OSTE נטול גז והרכיב אותו לפי הוראות מערכת לחץ באמצעות צינורות פוליטטרה-פלואוראתילן (PTFE) בקוטר פנימי של 0.8 מ"מ (ID).
  7. חבר את צינור ה- PTFE לכניסה של תבנית PDMS, ובאמצעות לחץ של 1000 mbar המתוחזק על ידי משאבה פיאזואלקטרית הממוקמת במערכת הלחץ, מלא את המכשיר. הניחו את הג'יג עם צד הזכוכית כלפי מעלה לתוך מיישר המסכה וחשפו במינון של 850 mJ באמצעות מסנן ND33.
  8. לאחר החשיפה, יש לפרק את הג'יג באמצעות מקש hex ולהסיר בזהירות את שקופית COC עם שכבת OSTE מובנית מתבנית PDMS.
  9. יש להביא את ה-OSTE המובנה במגע עם קרום בגודל 25 מ"מ x 75 מ"מ עם נקבוביות של 50 ננומטר וצפיפות נקבוביות של 11.8%, כך שהתעלות יכוסו במלואן בקרום.
    הערה: חשוב במיוחד לשמור על הממברנה ישרה ככל האפשר במהלך תהליך היישום.
  10. הניחו את המכלול על פלטה חמה המוגדרת לטמפרטורה של 60°C כאשר צד הממברנה כלפי מעלה, הניחו מגלשת זכוכית נקייה על גבי הממברנה והפעילו לחץ של 1.6 kPa מהחלק העליון כדי להבטיח הדבקה אחידה. מחממים את האסיפה למשך הלילה.
    הערה: לאחר שלב זה, חשוב במיוחד להעריך את ביצועי ההדבקה ואת עיוות הערוץ.

4. הכנת ערוץ OSTE-COC תחתון ומכלול התקנים

  1. יש לערבב OSTE ביחס של 1.09:1 ואט/ואט (עבור 5 מכשירים נדרשים 1.56 גרם של חלק A ו-1.44 גרם של חלק B). ערבבו את הרכיבים במערבל צנטריפוגלי פלנטרי: ערבבו במשך 5 דקות ב-750 סל"ד, ואז הורידו גז למשך 5 דקות ב-750 סל"ד.
  2. מעבירים את ה-OSTE המעורב לצינור בז ומנטרלים את הגז ב-800mbar במייבש ואקום למשך 30 דקות.
  3. נקה את שקופיות COC על ידי סוניקציה ב- IPA למשך 10 דקות. יבשו בזהירות את המגלשות עם N2.
  4. הניחו את מחליקי ה-COC הנקיים לתוך משטח הפלזמה וטפלו במשטח עם פלזמה חמצן של 800 SCCM למשך 2 דקות בהספק של 700 ואט ובלחץ של 0.133 mbar.
  5. הניחו את מגלשת ה-COC המחומצנת על תבנית PDMS עבור התעלה התחתונה, כך שהמשטח המטופל יהיה במגע עם המשטח המובנה של PDMS. הכניסו את המכלול לתוך ג'יג Mold-in-Place, הדקו את הג'יג עם מפתח מומנט שנקבע ל-0.3 ניוטון מטר.
  6. קח את צינור הבז עם OSTE נטול גז והרכיב אותו לפי הוראות מערכת הלחץ באמצעות צינורות PTFE עם מזהה 0.8 מ"מ.
  7. חבר את צינור ה- PTFE לכניסה של תבנית PDMS ובאמצעות לחץ של 1000 mbar מלא את המכשיר. הניחו את הג'יג עם צד הזכוכית כלפי מעלה לתוך מיישר המסכה וחשפו במינון של 1100 mJ באמצעות מסנן ND33.
  8. לאחר החשיפה, יש לפרק את הג'יג באמצעות מקש hex ולהסיר בזהירות את שקופית COC עם שכבת OSTE מובנית מתבנית PDMS.
  9. שלבו את שכבת ה-OSTE המובנית עם מכלול הערוצים העליון, כך שעיצוב השכבה העליונה והתחתונה מיושר זו עם זו ושהשכבה התחתונה של OSTE תהיה במגע עם הממברנה.
  10. הכנס את העיצוב לתוך ג'יג Mold-in-Place ובאמצעות אטבי בולדוג, הפעל לחץ של 1.6 kPa על המכשיר באופן שווה. הכניסו את הג'יג לתנור בטמפרטורה של 60 מעלות למשך הלילה.
    הערה: מיקום לא אחיד של הקליפים עלול להוביל לחיבור לא אחיד.

5. הערכת מכשיר

  1. לאחר מליטה, להעריך חזותית את המכשירים עם מיקרוסקופ עבור פגמים חזותיים, למשל, עיוות של הערוץ או מליטה לא מוצלחת.
  2. בדוק את המכשירים ללא פגמים על ידי העברת מים מסוננים מסוננים 0.02 מיקרומטר דרך התעלות בלחץ של 30 mbar. שימו לב לדליפות ערוץ זרימה ויציאת Luer וזרימת מים.
    הערה: אם לא ניתן לזהות דליפה וזרימת הערוץ רציפה, התקנים נחשבים שמישים לניסויים נוספים.

6. הגדרת המכשיר

  1. מלא שני מזרקים 5 מ"ל עם 2 מ"ל של 20 ננומטר מסונן 3% H2O2 ולהתאים אותם על משאבת מזרק (להשתמש בחצים התנועה עבור המרחק הדרוש, להכניס מזרקים, ולתקן אותם במקום עם הסרגל העליון).
    זהירות! היזהר תמיד בעת הטיפול ב- H2O2. יש ללבוש מעיל מעבדה, כפפות גומי מגנות והגנה על העיניים.
  2. חבר צינורות PTFE ID ID באורך 14 ס"מ 800 מיקרומטר למזרקים באמצעות מחטי המזרק ולפתחי המכשיר באמצעות מחברי Luer.
  3. חבר צינורות קטון (PEEK) באורך 20 ס"מ מזהה פוליאתר מזהה (PEEK) לשקעים.
  4. חבר את הקצה השני של צינור PEEK למיכל פסולת. ניתן לראות את ההגדרה באיור 3.
  5. הפעל את משאבת המזרק במהירות זרימה של 500 מיקרוליטר/דקה עבור כל כניסה (במסך המכשיר: הגדרות > הגדרת מערכת > מזרק (יצרן: מזרק רפואי, מזרק: 5 מ"ל) > לחצן 'הקודם ' > פרמטרים (בחר: להחדיר, לחזור: 1, נפח: 1.5 מ"ל, זרימה: 500 מיקרוליטר/דקה) > לחצן 'הקודם ' > לחצן 'חזרה '). יש לאסוף את הזרימה במיכל פסולת.
  6. מלא שני מזרקים חדשים 5 מ"ל עם 2 מ"ל של 20 ננומטר מסונן 70% אתנול.
  7. החלף את המזרקים הקודמים במזרקים מלאי אתנול והפעל את משאבת המזרק באמצעות אותם פרמטרים המתוארים בשלב 6.5.
  8. השתמש מזרקים חדשים 5 מ"ל ומלא אותם עם 5 מ"ל של 20 ננומטר מסונן פוספט חוצץ מלוחים (PBS).
  9. החלף את המזרקים הקודמים במזרקים המלאים ב- PBS ושטוף את המכשיר ב- 4 מ"ל PBS על ידי חזרה על שלבים 6.1. ו-6.5.
    הערה: הקפד לשנות את פרמטרי הגדרת המערכת לעוצמת קול: 4 מ"ל (במסך המכשירים: הגדרות > פרמטרים > (בחר: נפח: 4 מ"ל).
  10. נתק את הצינור מהמכשיר וסגור כל כניסה ושקע באמצעות תקעי Luer.
    הערה: השאר PBS במכשיר והימנע מלכידת אוויר על-ידי הוספת PBS נוסף בכל כניסה ושקע באמצעות מיקרופיפטה לפני הסגירה.
  11. השאירו את המכשיר למשך הלילה במקום חשוך בטמפרטורת החדר (RT).
  12. למחרת, שטוף את ההתקן המלא PBS עם 4 מ"ל של PBS מסונן 20 ננומטר (כמתואר בשלב 6.8).
  13. אסוף את 1 מ"ל האחרונים של הזרימה משני השקעים בצינור קשירה נמוכה של חלבון 2 מ"ל ואחסן ב -4 ° C כריק עבור חלקיקים שהוכנסו על ידי המכשיר.
  14. הסר את המזרקים המלאים ב- PBS והחלף אותם במזרקים חדשים של 5 מ"ל מלאים באוויר.
  15. נקו את המכשיר עם 4 מ"ל אוויר עד שכל הנוזל יצא מהמכשיר והצינורות.

7. בדיקת מכשירים עם חרוזי לטקס מתוקננים

  1. הכינו דוגמת חרוזים מתוקננת באמצעות חרוזי פוליסטירן 1.0 מיקרומטר וחרוזי קרבוקסילט 0.1 מיקרומטר. לצינור של 15 מ"ל, הוסף 500 μL של תקני חרוזי פוליסטירן של 1.0 מיקרומטר, 1 μL של תקני חרוזי קרבוקסילט 0.1 מיקרומטר, ו- 9499 μL של PBS מסונן של 20 ננומטר (הריכוז הסופי של תערובת חרוזים של 1.0 ו- 0.1 מיקרומטר יהיה 5 × 108 חרוזים / מ"ל ו- 3.6 × 1010 חרוזים / מ"ל בצורה מכובדת).
  2. מערבלו את דגימת החרוז למשך 30 שניות ואחסנו אותה בטמפרטורה של +4°C בזמן שאינה בשימוש.
  3. מלא מזרק חדש אחד של 5 מ"ל עם 1.5 מ"ל של תערובת החרוזים הסטנדרטית ועוד אחד עם 1.5 מ"ל של PBS מסונן 20 ננומטר.
  4. הסר את המזרקים שחוברו בעבר וחבר את מזרק תערובת החרוזים לצינור הכניסה הראשון ואת השני לכניסה השנייה.
  5. הסר את מיכל הפסולת והכן לפחות חמישה צינורות מיקרוצנטריפוגות 0.5 מ"ל לכל צינור יציאה.
  6. שנה את פרמטרי ההפעלה של מערכת משאבת מזרק לנפח: 1 מ"ל; זרימה: 250 מיקרוליטר/דקה.
    הערה: בהתאם לצרכי המשתמש, ניתן להגדיר מהירויות זרימה שונות כגון 250 μL/min, 200 μL/min, 150 μL/min, 100 μL/min ו-50 μL/min. מומלץ לבצע מחקר ראשוני לבחירת המהירות הטובה ביותר לתוצאה הרצויה.
  7. הפעל את משאבת המזרק ואסוף את הזרימה - 5 עד 6 טיפות בכל צינור מיקרוצנטריפוגה.
    הערה: אם נעשה שימוש באותו התקן מספר פעמים, רוקן את ההתקן כמתואר בשלב 6.8 והחלף את כל המחברים, התקעים והמחטים. שטפו את המחברים, התקעים והמחטים המשומשים על ידי השארתם באתנול 70% מסונן 20 ננומטר למשך 30 דקות לפחות. לאחר מכן, העבירו את כל החלקים לצינור המכיל 20 ננומטר מים מסוננים שעברו דה-יוניזציה, נערו את הצינור ביסודיות והעבירו אותם לצלחת פטרי המכילה 20 מ"ל של מים מסוננים ב-20 ננומטר. השאירו את צלחת הפטרי על השייקר למשך 30 דקות לפחות ב-100 סל"ד, ואז השאירו את הדברים לייבוש בצלחת פטרי יבשה (למשך 12 שעות לפחות) לפני שימוש חוזר.

8. בדיקת מכשיר עם דגימות שתן

  1. הכן את ההתקן כמתואר בשלבים 6.1-6.15.
  2. לאסוף 100 מ"ל של שתן בוקר לכל תורם באמצעות מיכלי שתן סטריליים ולהעביר אותו למעבדה לעיבוד בתוך 2 שעות של איסוף.
  3. הפרד כל דגימת שתן לשני צינורות 50 מ"ל וצנטריפוגה ב 2,000 x גרם למשך 15 דקות ב- RT.
  4. אספו את הסופרנאטנט והשליכו את הכדור.
  5. צנטריפוגה את הסופרנאטנט במהירות של 10,000 x גרם למשך 30 דקות ב-RT כדי להיפטר מחלקיקים גדולים ומפסולת תאים.
  6. אספו את הסופרנאטנט והשליכו את הכדור.
  7. שטוף את המכשיר כמתואר ב- 6.6.
  8. שנה את מזרקי 5 מ"ל למזרק 20 מ"ל מלא בדגימת השתן המוכנה לכניסת הדגימה ועוד מזרק 20 מ"ל מלא 20 מ"ל של 20 ננומטר מסונן DEPC-PBS עבור כניסת החיץ. שנה את הגדרות משאבת המזרק ל - BDPlastipak; מזרק: סמ"ק; נפח: 20 מ"ל; זרימה: 250 מיקרוליטר/דקה (קצב זרימה אופטימלי), בדומה למתואר בשלב 6.2. הפעל את משאבת המזרק ואסוף את הזרימה מכל שקע בצינורות נפרדים של 50 מ"ל.
  9. רכז כל זרימה בנפרד באמצעות 100,000 צינורות ריכוז חתך משקל מולקולרי ל -100 μL כל אחד ב 3,000 x גרם ב 4 ° C.
  10. מעבירים את התרכיזים לצינורות מיקרוצנטריפוגות 0.5 מ"ל.
  11. מערבלים את הדגימות המרוכזות במשך 30 שניות, ואז מסתובבים במשך 10 שניות.
  12. Aliquot את הדגימות על ידי העברת 25 μL של דגימה לכל צינור, לתייג אותם, ולהקפיא ב -80 ° C לאחסון לטווח ארוך.

9. בדיקת מכשיר עם מדיה מותנית

  1. הכן את ההתקן כמתואר בשלבים 6.1- 6.15.
  2. תאי תרבית בסביבה לחה, 5% CO2 ב 37 ° C עד הספירה הכוללת מגיע 100 מיליון, על פי Bajo-Santos et al.20 מעבר התאים לבקבוק תרחיף T175 יחיד ב 100 מ"ל של מדיה ללא סרום בתוספת 2% B-27 תחליף סרום תוספת תרבית בסביבה 5% CO2 לח ב 37 ° C למשך 48 שעות נוספות.
  3. אספו את מתלה התא וצנטריפוגו אותו במהירות של 300 x גרם למשך 5 דקות ב-RT כדי להיפטר מהתאים.
  4. אספו וצנטריפוגו את הסופרנאטנט שוב בטמפרטורה של 3,000 x גרם למשך 30 דקות בטמפרטורה של +4°C כדי להיפטר מחלקיקים גדולים ומפסולת תאים.
  5. אספו את הסופרנאטנט ואחסנו אותו בטמפרטורה של +4°C עד שההפרדה יכולה להתרחש, אך לא יותר מ-3 שעות.
  6. שנה את מזרקי 5 מ"ל עם מזרקים 20 מ"ל מלאים במדיה הממוזגת המוכנה עבור כניסת הדגימה ומלאים ב 20 מ"ל של PBS מסונן 20 ננומטר עבור כניסת החיץ.
  7. הגדר את ההגדרות בתחנת השאיבה כמתואר בשלב 7.8.
  8. הפעל את משאבת המזרק ואסוף את הזרימה מכל שקע בצינור נפרד של 50 מ"ל.
  9. רכז כל זרימה בנפרד באמצעות 100,000 צינורות ריכוז חתך משקל מולקולרי ל -150 μL כל אחד ב 3,000 x גרם ב +4 ° C.
  10. מעבירים את התרכיזים לצינורות מיקרוצנטריפוגות 0.5 מ"ל.
  11. וורטקס ריכז דגימות במשך 30 שניות.
  12. ספין דגימות מרוכזות במשך 10 שניות.
  13. Aliquot את הדגימות על ידי העברת 25 μL של דגימה לכל צינור, לתייג אותם, ולהקפיא אותם ב -80 ° C לאחסון לטווח ארוך.

10. בידוד כלי רכב חשמליים באמצעות אולטרה-צנטריפוגה

  1. צנטריפוגה 20 מ"ל של שתן או מדיה סלולרית מותנית ב 100,000 x גרם במשך 70 דקות ב +4 ° C באמצעות צנטריפוגה עם רוטור זווית קבועה.
  2. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את הגלולה ב-20 מ"ל של PBS מסונן ב-20 ננומטר.
  3. שוב צנטריפוגה, כפי שמוסבר ב-10.1.
  4. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את הגלולה ב-12 מ"ל של PBS מסונן ב-20 ננומטר.
  5. צנטריפוגה ב 100,000 x גרם במשך 70 דקות ב +4 ° C באמצעות רוטור נדנדה.
  6. השליכו את הסופרנטנט.
    הערה: היזהרו כשאתם משליכים את הסופרנאטנט הפעם. מומלץ לעשות זאת עם פיפטה.
  7. השהה מחדש את הגלולה ב 100 μL של PBS מסונן 20 ננומטר.
  8. עליץ את המדגם והמשך לסשן 12 לאפיון EV. אחרת, יש לאחסן בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש נוסף.

11. בידוד כלי רכב חשמליים באמצעות כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל (SEC)

  1. רכז 20 מ"ל של שתן או מדיה תאית מותנית ל-500 מיקרוליטר באמצעות יחידות מסנן צנטריפוגליות בנפח 100 kDa (MWCO) ב-3,000 x גרם ב-+4 °C למשך 15 דקות.
  2. העבר את התרכיז לעמודת SEC (טווח עומס של 35 ננומטר).
  3. יוצקים את PBS המסונן 20 ננומטר על העמוד ולאסוף 15 שברים של 0.5 מ"ל.
  4. נתח שברים באמצעות מערכת פיזור אור דינמית (DLS) בהתאם להוראות היצרן.
  5. אחסן יחד את השברים שנבחרו. בחר שברים עם מנחת נמוך מ- 11 ולפחות 30% מכלל החלקיקים גדולים מ- 40 ננומטר.
  6. רכז שברים נבחרים ל- 100 μL באמצעות יחידות מסנן צנטריפוגליות של 3 kDa לחיתוך משקל מולקולרי (MWCO) ב- 14,000 x גרם ב- +4 ° C למשך 15 דקות.
  7. עלי-ציטוט המדגם והמשך לסעיף 12 לאפיון רכב חשמלי. אחרת, יש לאחסן בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש נוסף.

12. אפיון רכב חשמלי

  1. קח את הדגימה להיות מאופיין מהמקפיא והפשיר אותו לאט (על גוש קרח או ב +4 ° C).
  2. בצע ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים (NTA) כדי לקבוע את התפלגות גודל החלקיקים ואת הכמות13. בצע בדיקת אימונוסורבנט מקושרת לאנזים תאי T 4 (TIM-4) בזיקה גבוהה (dsELISA)14 כדי לאשר נוכחות EV בדגימות.

13. נת"ע

  1. מערבלים את דגימת ה-EV המופשרת למשך 30 שניות ומסתובבים במשך 10 שניות, ואז מעבירים 1 μL ל-999 μL של PBS מסונן 20 ננומטר בצינור מיקרוצנטריפוגה של 2 מ"ל כדי לדלל אותו פי 1000. שמור 1 מ"ל של PBS נוסף המשמש לדילול כדי לבדוק שהוא אינו מכיל חלקיקים. אחסן הכל ב +4 ° C עד למדידה.
    הערה: סנן PBS דרך מסנן 0.02 ננומטר לפני השימוש.
  2. מערבלים את דגימת EV או ריק במשך 30 שניות ומכניסים אותו למודול באמצעות מזרק. מלא את המודול בכ- 0.7 מ"ל דגימה והנח אותה במכשיר.
  3. מדוד את הדגימה באמצעות מכשיר מנתח הננו-חלקיקים בהתאם להוראות היצרן.

14. dsELISA לסמני EV

  1. הכינו תמיסה של 1 מיקרוגרם/מ"ל חלבון TIM4-Fc. מצפים את הבארות של צלחת ELISA 96 בארות על ידי העברת 100 μL של תמיסה לכל באר הכרחית ודגרים לילה ב +4 ° C רועד ב 200 סל"ד.
  2. למחרת, להכין פתרון כביסה (1x כפות + 0.05% Tween20 + 2 mM CaCl2).
  3. יש להשליך את כל הנוזלים שבכל באר. שטפו היטב כל באר על ידי הוספת 200 מיקרוליטר של תמיסת כביסה, ניעור ב-200 סל"ד למשך 5 דקות ב-RT והשלכה. חזור על שלב זה פעמיים.
  4. הכינו פתרון חסימה (1x כף + 0.05% טווין20 + אלבומין בסרום בקר 1%. הוסף 200 μL של תמיסת חסימה לכל באר ודגר ב- RT למשך שעה אחת תוך רעידה ב- 200 סל"ד.
  5. שטפו כל באר כמתואר בשלב 14.3.
  6. הכינו 220 μL מכל דילול דגימה במאגר הכביסה (ריכוז EV אופטימלי הוא 2.7 × 105 EVs/μL). הוסף 100 μL של מדגם מדולל לכל באר ולבצע שני העתקים. יש לדגור ב-RT במשך 90 דקות תוך כדי רעידות ב-200 סל"ד.
  7. שטפו כל באר כמתואר בשלב 14.3.
  8. הוסף 100 μL של נוגדנים המתאימים לכל באר. השתמש בסמני EV מתאימים לאישור כלי רכב חשמליים ומזהמים4. דוגרים ב-RT במשך שעתיים תוך כדי רעידות ב-200 סל"ד. הערה: אם נעשה שימוש בנוגדנים משניים, חזור על שלבים 14.7-14.8. עם זאת, להפחית את תקופת הדגירה של נוגדנים משניים ל 1 שעות.
  9. שטפו כל באר כמתואר בשלב 14.3.
  10. מוסיפים 100 μL של מצע חזרת peroxidase לכל באר, מערבבים את הצלחת במשך 1 דקות, ולדגור על RT במשך 30 דקות.
  11. הוסף 1 M H2SO4 לכל באר כדי לעצור את התגובה.
  12. באמצעות קורא microplate, למדוד את הספיגה ב 450 ננומטר.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

יצרנו מכשיר מיקרופלואידי באמצעות תבנית שלילית כפולה מודפסת בתלת-ממד (איור 1) באמצעות ליתוגרפיה רכה (איור 2A) להפרדת EV בתפוקה גבוהה בהתבסס על עקרון A4F המפוצל (איור 2B,C). ההתקנה דורשת משאבה ותחנת זרימה, כפי שניתן לראות באיור 3

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

המכשיר המיקרופלואידי המוצג מציע שיטה מבטיחה לבידוד וחילוץ של כלי רכב חשמליים מנוזלים ביולוגיים, תוך מתן מענה לחלק מהמגבלות הקריטיות של שיטות תקן הזהב הקיימות כגון UC ו- SEC12. UC ו-SEC ידועות כעתירות עבודה, גוזלות זמן רב וסובלות מתשואה נמוכה, מה שהופך אותן לפחות מתאימות ליישומים בעל...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

A.A., G.M. ו-R.R. הם מייסדים, חברי דירקטוריון ובעלי מניות ב-Cellbox Labs, LLC

Acknowledgements

אנו מודים לכל התורמים שהשתתפו במחקר זה, לצוות מאגר הגנום הלטבי על מסירת הדגימות. המכון לפיסיקה של מצב מוצק, אוניברסיטת לטביה כמרכז המצוינות קיבל מימון מתוכנית המסגרת Horizon 2020 של האיחוד האירופי H2020-WIDESPREAD-01-2016-2017-TeamongPhase2 תחת הסכם מענק מס '739508, פרויקט CAMART2. עבודה זו נתמכה על ידי המועצה הלטבית למדע פרויקט מס '. lzp-2019/1-0142 ומספר פרויקט: lzp-2022/1-0373.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.1 µm carboxylate FluoSpheresInvitrogen#F8803Stock concentration: 3.6 x 1013 beads/mL (LOT dependent)
0.5 mL microcentrifuge tubesStarstedt72.704
1 mL Luer cone syringe single use without needleRAYSTUB1ML
1.0 µm polystyrene FluoSpheresInvitrogen#F13083Stock concentration: 1 x 1010 beads/mL (LOT dependent)
10 mL Serological pipettesSarstedt86.1254.001
15 mL (100k) Amicon Ultra centrifugal filtersMerck MilliporeUFC910024
2.0 mL Protein LoBind tubesEppendorf30108132
20 mL syringesBD PlastikPak10569215
250 µm ID polyether ether ketone tubingDarwin MicrofluidicsCIL-1581
3 kDa MWCO centrifugal filter unitsMerck Millipore,UFC200324
5 mL Medical Syringe without NeedleAnhui Hongyu Wuzhou Medical159646
50 mL conical tubesSarstedt62.547.254
70 Ti fixed angle ultracentrifuge rotorBeckman Coulter337922
800 µm ID polytetrafluoroethylene tubingDarwin MicrofluidicsLVF-KTU-15
96 well microplate, f-bottom, med. bindingGreiner Bio-One655001ELISA plate
B-27 Supplement (50x), serum freeThermo Fisher Scientific17504044
Bovine serum albuminSigmaAldrichA7906-100G
COC Topas microscopy slide platformMicrofluidic Chipshop10000002
COC Topas microscopy slide platform 2 x 16 Mini Luer Microfluidic Chipshop10000387
Elveflow OB1 pressure controllerElvesys Group
Luer connectorsDarwin Microfluidics CS-10000095
Mask aligner Suss MA/BA6SUSS MicroTec Group
Mixer Thinky ARE-250Thinky Corporation
NanoSight NS300Malvern PanalyticalNS300nanoparticle analyzer 
Optical microscope Nikon Eclipse LV150NNikon Metrology NV
OSTE 322 Crystal ClearMercene Labs
PBS TABLETS.Ca/Mg free. Fisher Bioreagents. 100 gFisher ScientificBP2944-100
PC membrane (50 nm pore diameter, 11.8% density)it4ip S.A., Louvain-La Neuve, Belgium
Petri dishes, sterileSarstedt82.1472.001
Plasma Asher GIGAbatch 360 MPVA TePla America, LLC
qEVoriginal/35 nm columnIzonSP5SEC column
QSIL 216 Silicone Elastomer KitPP&S
Resin Tough BlackZortrax
SW40 Ti swing ultracentrifuge rotorBeckman Coulter331301
Syringe pumpDK InfusetekISPLab002
T175 suspension flaskSarstedt83.3912.502
TIM4-Fc proteinAdipogen LifeSciencesAG-40B-0180B-3010
TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine)SigmaAldrichT0440-100MLHorseradish peroxidase substrate
Tween20SigmaAldrichP1379-100ML
Ultracentrifuge Optima L100XPBeckman Coulter
Ultrasonic cleaning unit P 60 HElma Schmidbauer GmbH
Universal Microplate SpectrophotometerBio-Tek instruments71777-1
Urine collection cup, 150mL, sterileAPTACA2120_SG
Whatman Anotop 25 Syringe FilterSigmaAldrich68092002
Zetasizer Nano ZSMalvern Panalyticaldynamic light scattering (DLS) system 
Zortrax InkspireZortrax

References

  1. Colombo, M., et al. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 255-289 (2014).
  2. Tricarico, C., et al. Biology and biogenesis of shed microvesicles. Small GTPases. 8 (4), 220-232 (2017).
  3. Yáñez-Mó, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4 (1), 27066(2015).
  4. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  5. Wang, Z. Extracellular vesicles as an emerging drug delivery system for cancer treatment: Current strategies and recent advances. Biomed Pharmacother. 153, 113480(2022).
  6. Royo, F., et al. Methods for separation and characterization of extracellular vesicles: Results of a Worldwide Survey Performed by the ISEV Rigor and Standardization Subcommittee. Cells. 9 (9), 1955(2020).
  7. Sidhom, K., et al. A review of exosomal isolation methods: Is size exclusion chromatography the best option. Int J Mol Sci. 21 (18), 6466(2020).
  8. Reshi, Q. U. A., et al. Isolation of extracellular vesicles (EVs) using benchtop size exclusion chromatography (SEC) columns. Methods Mol Biol. 2273, 201-206 (2021).
  9. Liangsupree, T., Multia, E., Riekkola, M. L. Modern isolation and separation techniques for extracellular vesicles. J Chromatogr A. 1636, 461773(2021).
  10. Priedols, M., et al. Bifurcated asymmetric field flow fractionation of nanoparticles in PDMS-free microfluidic devices for applications in label-free extracellular vesicle separation. Polymers. 15 (4), 789(2023).
  11. Zhang, H., Lyden, D. Asymmetric-flow field-flow fractionation technology for exomere and small extracellular vesicle separation and characterization. Nat Protoc. 14 (4), 1027-1053 (2019).
  12. Talebjedi, B., et al. Exploiting microfluidics for extracellular vesicle isolation and characterization: Potential use for standardized embryo quality assessment. Front Vet Sci. 7, 620809(2020).
  13. van Meer, B. J., et al. Small molecule absorption by PDMS in the context of drug response bioassays. Biochem Biophys Res Commun. 482 (2), 323-328 (2017).
  14. Jia, Y., et al. Small extracellular vesicles isolation and separation: Current techniques, pending questions and clinical applications. Theranostics. 12 (15), 6548-6575 (2022).
  15. Bussooa, A., et al. Real-time monitoring of oxygen levels within thermoplastic Organ-on-Chip devices. Biosensors and Bioelectronics: X. 11, 100198(2022).
  16. Tang, L., Lee, N. Y. A facile route for irreversible bonding of plastic-PDMS hybrid microdevices at room temperature. Lab Chip. 10 (10), 1274-1280 (2010).
  17. Borda, E., et al. Conformable neural interface based on off-stoichiometry thiol-ene-epoxy thermosets. Biomaterials. 293, 121979(2023).
  18. Sandström, N., et al. Reaction injection molding and direct covalent bonding of OSTE+ polymer microfluidic devices. Journal of Micromechanics and Microengineering. 25 (7), 075002(2015).
  19. Sticker, D., et al. Thiol-ene based polymers as versatile materials for microfluidic devices for life sciences applications. ACS Appl Mater Interfaces. 12 (9), 10080-10095 (2020).
  20. Bajo-Santos, C., et al. Extracellular vesicles isolation from large volume samples using a polydimethylsiloxane-free microfluidic device. Int J Mol Sci. 24 (9), 7971(2023).
  21. Claridge, B., et al. Development of extracellular vesicle therapeutics: Challenges, considerations, and opportunities. Front Cell Dev Biol. 9, 734720(2021).
  22. Rezaie, J., et al. Review on exosomes application in clinical trials: Perspective, questions, and challenges. Cell Commun Signal. 20 (1), 145(2022).
  23. Aragón, I. M., et al. The urinary tract microbiome in health and disease. Eur Urol Focus. 4 (1), 128-138 (2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE204

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved