JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Внеклеточные везикулы имеют огромные перспективы для биомедицинских применений, но современные методы выделения отнимают много времени и непрактичны для клинического использования. В этом исследовании мы представляем микрофлюидное устройство, которое позволяет напрямую выделять внеклеточные везикулы из больших объемов биожидкостей в непрерывном режиме с минимальными шагами.

Аннотация

Внеклеточные везикулы (ВВ) обладают огромным потенциалом для различных биомедицинских применений, включая диагностику, доставку лекарств и регенеративную медицину. Тем не менее, существующие методики изоляции электромобилей представляют собой значительные проблемы, такие как сложность, затраты времени и необходимость громоздкого оборудования, что затрудняет их клиническую трансляцию. Чтобы устранить эти ограничения, мы стремились разработать инновационную микрофлюидную систему на основе тиол-ена с циклическим сополимером олефинов вне стехиометрии (COC-OSTE) для эффективной изоляции ВВ из образцов большого объема в непрерывном режиме. Используя разделение на основе размера и плавучести, технология, использованная в этом исследовании, позволила добиться значительно более узкого распределения по размерам по сравнению с существующими подходами на основе образцов мочи и клеточных сред, что позволило нацеливаться на конкретные размерные фракции EV в будущих приложениях. Наша инновационная конструкция микрофлюидного устройства COC-OSTE, использующая технологию фракционирования с раздвоением асимметричного потока в поле, предлагает простой и непрерывный подход к изоляции EV для образцов большого объема. Кроме того, потенциал для массового производства этого микрофлюидного устройства обеспечивает масштабируемость и согласованность, что делает возможным интеграцию изоляции электромобилей в рутинную клиническую диагностику и промышленные процессы, где высокая согласованность и пропускная способность являются важными требованиями.

Введение

Внеклеточные везикулы (ВВ) представляют собой клеточные мембраносвязанные частицы, состоящие из двух основных типов: экзосомы (30-200 нм) и микровезикулы (200-1000 нм)1. Экзосомы образуются путем почкования эндосомальной мембраны внутрь в мультивезикулярном теле (МВБ), высвобождая внутрипросветные везикулы (РКН) во внеклеточное пространство при слиянии с плазматической мембраной1. Напротив, микровезикулы образуются в результате почкования наружу и деления клеточной мембраны2. ВВ играют решающую роль в межклеточной коммуникации, транспортируя белки, нуклеиновые кислоты, липиды и метаболиты, отражая физиологическое состояние клетки, включая рост, ангиогенез, метастазирование, пролиферацию и резистентность к терапии3. В результате они стали многообещающими биомаркерами и терапевтическими мишенями для лечения заболеваний, включая рак, что подчеркивает их потенциал в системах диагностики и доставки лекарств4.

Для полноценного использования электромобилей в диагностике и лечении заболеваний решающее значение имеет эффективная изоляция от различных биожидкостей5. К распространенным методам относятся ультрацентрифугирование (UC), центрифугирование с градиентом плотности, эксклюзионная хроматография (SEC), фильтрация и иммуноизоляция6. UC является широко используемым методом, но может давать частицы аналогичной плотности, которые не являются ВВ, и могут генерировать агрегаты ВВ7. Компания SEC завоевала популярность благодаря своей способности предоставлять образцы более высокой чистоты, исключая частицы на основе размера, а не плотности8. Тем не менее, тщательный выбор подходящего размера пор для колонки SEC и оптимизация условий хроматографии имеют важное значение для минимизации совместного выделения нежелательных частиц, таких как хиломикроны и липопротеины низкой плотности8. Несмотря на свою эффективность, оба метода отнимают много времени и сложны в автоматизации, особенно для образцов большого объема, таких как клеточные среды или моча, что ограничивает их масштабируемость для промышленного применения9.

В последние годы асимметричное фракционирование поля потока (A4F) превратилось в мощный метод разделения частиц микро- и нанометровых размеров на основе размера и плавучести10. Принцип действия A4F основан на микрофлюидном канале, в основании которого находится пористая мембрана, создающая силу, действующую на мембрану, называемую поперечным потоком10. В сочетании с броуновским движением и потоком Пуазейля, присущими системе, поперечный поток способствует эффективному разделению частиц за счет изменения положения частиц в динамике потока11. Несмотря на преимущества, этот метод ограничен объемами образцов в пределах микролитрового диапазона12 и требует дополнительной стадии фокусировки, что увеличивает продолжительность процесса10.

За последнее десятилетие микрофлюидика приобрела известность как инструмент для быстрого, эффективного и клинически надежного разделения EV13. Однако большинство микрофлюидных методов, предназначенных для разделения ВВ, оптимизированы для образцов ВВ небольшого объема с высокой концентрацией или зависят от сложных процедур разделения14. Кроме того, в области микрофлюидики полидиметилсилоксан (ПДМС) признан золотым стандартом благодаря своей оптической прозрачности, биосовместимости и простоте использования15. Тем не менее, его известная склонность поглощать небольшие липофильные молекулы, включая ВВ, может быть проблематичной для его применения в области ВВ13.

Циклический сополимер олефинов (КОК) является часто используемым материалом в микрофлюидике из-за биосовместимости, малого поглощения молекул и высокой химической стойкости15. Однако изготовление устройств КОК часто связано со сложными процессами или специализированным оборудованием16. В качестве альтернативы, внестехиометрический тиол-ен (ОСТЭ) является многообещающей альтернативой PDMS из-за снижения абсорбции малых молекул, превосходной химической стабильности, простоты изготовления и масштабируемого процесса изготовления17,18. Однако из-за сложных соединений с трубками устройства могут быть подвержены утечкам19.

Целью данного исследования было спроектировать и изготовить микрофлюидное устройство, сочетающее в себе OSTE и COC и раздвоенный принцип A4F для отделения EV от образцов большого объема, таких как моча или клеточные среды.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Отбор проб был одобрен Комиссией по этике исследований в области жизни и медицины Латвийского университета (решение N0-71-35/54)

ПРИМЕЧАНИЕ: Материалы, использованные в этом исследовании, включены в файл Table of Materials .

1. Изготовление трехмерных (3D) печатных пресс-форм

  1. Спроектируйте в программном обеспечении САПР двойную негативную форму в форме змея со следующими размерами для верхнего канала: высота 0,5 мм, ширина 1 мм и длина 210 мм. Для нижнего канала используйте такую же конструкцию шириной 1,5 мм, высотой 0,6 мм и длиной 210 мм. Такие размеры, как ширина, длина, высота и изометрическая иллюстрация конструкции, показаны на рисунке 1. Сохраните дизайн в формате .stl.
  2. Подготовьте файл в Z-Suite; Поддержка не требуется. Напечатайте формы с помощью 3D-принтера на ультрафиолетовом жидкокристаллическом дисплее (УФ-ЖК) с прочной черной смолой.
  3. После печати осторожно снимите формы с поверхности принтера. Вымойте формы в изопропаноле (IPA) при ультразвуковой обработке в течение 20 мин.
  4. Высушите формы феном с помощью N2.
  5. Подвергните формы воздействию воды с помощью фильтра ND33 в течение 810 с, затем поместите их в духовку при температуре 60 °C на 48 часов.

2. Подготовка пресс-форм PDMS

  1. Весьте PDMS в соотношении 10:1 (для каждой формы используйте 16 г эластомерной основы и 1,6 г сшивающего агента). Смешайте компоненты в планетарном центробежном смесителе, перемешивая в течение 1 мин при 500 об/мин.
  2. Разлить смешанный PDMS в формы, напечатанные на 3D-принтере, и дегазировать в вакуумном эксикаторе при давлении -800 мбар в течение 30 минут или до тех пор, пока не исчезнут пузырьки.
  3. Осторожно поместите поливинилхлоридный вкладыш толщиной 100 мкм поверх жидкого PDMS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Наносите лайнер медленно с одной стороны на другую, чтобы избежать образования пузырьков.
  4. Вставьте пресс-форму с PDMS в приспособление для пресс-формы и затяните зажимной приспособление с помощью динамометрического ключа, установленного на 0,3 Нм.
  5. Поместите приспособление в духовку при температуре 60 °C на 3 часа для отверждения PDMS.
  6. Разберите приспособление с помощью шестигранного ключа и извлеките из него напечатанную на 3D-принтере форму.
  7. Осторожно извлеките пресс-формы PDMS из мастер-форм, напечатанных на 3D-принтере, проведя по краям формы скальпелем, затем удалив форму пинцетом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для более легкого удаления пресс-формы можно использовать IPA; однако после этого формы необходимо нагревать до 60 °C в течение 10 минут, чтобы испарить излишки изопропилового спирта.

3. Подготовка верхнего канала OSTE-COC

  1. Масса ОСТЭ при соотношении 1,09:1 w/w (для 5 приборов необходимо 1,56 г части А и 1,44 г части B). Смешайте компоненты в планетарном центробежном смесителе: перемешивайте в течение 5 минут при 750 об/мин, затем дегазируйте в течение 5 мин при 750 об/мин.
  2. Переложите смешанный ОСТЭ в центрифужную пробирку и дегазируйте при -800 мбар в вакуумном эксикаторе в течение 30 мин.
  3. Очистите предметные стекла COC с помощью 2 x 16 мини-коннекторов Луэра с помощью ультразвуковой обработки в изопропиловом спирте в течение 10 минут. Тщательно просушите предметные стекла с помощью N2.
  4. Поместите чистые предметные стекла COC в плазменный ашер так, чтобы плоская поверхность была размещена вверх, и обработайте поверхность кислородной плазмой 800 SCCM в течение 2 минут при мощности 700 Вт и давлении 0,133 мбар.
  5. Поместите предметное стекло окисленного КОК на форму PDMS для верхнего канала так, чтобы обработанная поверхность соприкасалась со структурированной поверхностью PDMS. Поместите узел в приспособление Mold-in-Place, затянув его динамометрическим ключом на 0,3 Нм.
  6. Подключите систему давления к трубопроводу сжатого воздуха под давлением 6 бар. Возьмите центрифужную трубку с дегазированной OSTE и соберите ее в соответствии с инструкциями по напорной системе с помощью трубки из политетрафторэтилена (ПТФЭ) с внутренним диаметром (ID) 0,8 мм.
  7. Подсоедините трубку из ПТФЭ ко входному отверстию пресс-формы PDMS и, используя давление 1000 мбар, поддерживаемое пьезоэлектрическим насосом, расположенным в системе давления, заполните устройство. Поместите приспособление стеклянной стороной вверх в выравниватель маски и экспонируйте с дозой 850 мДж с помощью фильтра ND33.
  8. После выдержки разберите приспособление с помощью шестигранного ключа и осторожно извлеките предметное стекло COC со структурированным слоем OSTE из пресс-формы PDMS.
  9. Приведите структурированный OSTE в контакт с мембраной размером 25 мм x 75 мм с порами 50 нм и плотностью пор 11,8% так, чтобы каналы были полностью покрыты мембраной.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Особенно важно, чтобы мембрана была как можно более прямой в процессе нанесения.
  10. Поместите узел на горячую плиту, установленную на 60 ° C, стороной мембраны вверх, поместите чистый предметной стекло поверх мембраны и приложите сверху давление 1,6 кПа, чтобы обеспечить равномерное склеивание. Нагревайте сборку в течение ночи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После этого шага особенно важно оценить характеристики склеивания и деформацию канала.

4. Подготовка донного канала OSTE-COC и сборка устройства

  1. Смешайте ОСТЭ в соотношении 1,09:1 (для 5 устройств необходимо 1,56 г части А и 1,44 г части В). Смешайте компоненты в планетарном центробежном миксере: перемешивайте в течение 5 минут при 750 об/мин, затем дегазируйте в течение 5 минут при 750 об/мин.
  2. Переложите смешанный ОСТЭ в трубку Falcon и дегазируйте при -800 мбар в вакуумном эксикаторе в течение 30 мин.
  3. Очистите предметные стекла COC ультразвуком в изопропиловом спирте в течение 10 минут. Тщательно просушите предметные стекла с помощью N2.
  4. Поместите чистые предметные стекла COC в плазменный ашер и обработайте поверхность кислородной плазмой 800 SCCM в течение 2 минут при мощности 700 Вт и давлении 0,133 мбар.
  5. Поместите окисленный предметный стеклопластик на форму PDMS для нижнего канала так, чтобы обработанная поверхность соприкасалась со структурированной поверхностью PDMS. Поместите узел в приспособление Mold-in-Place, затянув его динамометрическим ключом на 0,3 Нм.
  6. Возьмите трубку Falcon с дегазированной OSTE и соберите ее в соответствии с инструкциями по системе давления с помощью трубки из ПТФЭ с внутренним диаметром 0,8 мм.
  7. Подсоедините трубку из ПТФЭ ко входному отверстию пресс-формы PDMS и, используя давление 1000 мбар, заполните устройство. Поместите приспособление стеклянной стороной вверх в выравниватель маски и экспонируйте с дозой 1100 мДж с помощью фильтра ND33.
  8. После выдержки разберите приспособление с помощью шестигранного ключа и осторожно извлеките предметное стекло COC со структурированным слоем OSTE из пресс-формы PDMS.
  9. Комбинируйте структурированный слой OSTE с верхним канальным узлом так, чтобы конструкция верхнего и нижнего слоев были выровнены друг с другом, а нижний слой OSTE находился в контакте с мембраной.
  10. Вставьте конструкцию в приспособление Mold-in-Place и с помощью зажимов-бульдогов равномерно приложите к устройству давление 1,6 кПа. Поместите отсадку в духовку при температуре 60°C на ночь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Неравномерное расположение зажимов может привести к неравномерному склеиванию.

5. Оценка устройства

  1. После склеивания визуально оцените приборы с помощью микроскопа на предмет визуальных дефектов, например, деформации канала или неудачного склеивания.
  2. Проверьте устройства на отсутствие дефектов, пропустив через каналы отфильтрованную деионизированную воду размером 0,02 мкм с давлением 30 мбар. Следите за утечками в проточном канале и порту Луэра, а также за потоком воды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если утечка не обнаружена и поток в канале не прерывается, устройства считаются пригодными для дальнейших экспериментов.

6. Настройка устройства

  1. Наполните два шприца по 5 мл 2 мл 20 нм, отфильтрованного 3%H2O2 и установите их на шприцевой насос (используйте стрелки движения на необходимое расстояние, вставьте шприцы и зафиксируйте их на месте с помощью верхней планки).
    ОСТОРОЖНОСТЬ! Всегда будьте осторожны при обращении сH2O2. Наденьте лабораторный халат, защитные резиновые перчатки и средства защиты глаз.
  2. Подсоедините трубку из ПТФЭ длиной 14 см длиной 800 мкм к шприцам с помощью игл для шприцев и к входным отверстиям устройства с помощью соединителей Луэра.
  3. Подсоедините к выходным отверстиям трубку длиной 200 мкм с внутренним диаметром 200 мкм.
  4. Подсоедините другой конец трубки PEEK к контейнеру для отходов. Настройка показана на рисунке 3.
  5. Запустите шприцевой насос со скоростью потока 500 мкл/мин для каждого входного отверстия (на экране прибора: Настройки > Набор системы > Шприц (производитель: медицинский шприц, шприц: 5 мл) > Кнопка «Назад » > Параметры (Выберите: настаивать, Повторить: 1, Объем: 1,5 мл, Расход: 500 мкл/мин) > Кнопка «Назад » > кнопка «Назад »). Соберите проточный контейнер в контейнер для отходов.
  6. Наполните два новых шприца объемом 5 мл 2 мл 20 нм отфильтрованного 70% этанола.
  7. Замените предыдущие шприцы шприцами, заполненными этанолом, и запустите шприцевой насос, используя те же параметры, что описаны в шаге 6.5.
  8. Используйте новые шприцы объемом 5 мл и наполните их 5 мл 20 нм фильтрованного фосфатно-солевого буфера (PBS).
  9. Замените предыдущие шприцы шприцами, наполненными PBS, и промойте устройство 4 мл PBS, повторив шаги 6.1. и 6.5.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно измените параметры настройки системы на Объем: 4 мл (на экране прибора: Настройки > Параметры > (Выберите: Объем: 4 мл).
  10. Отсоедините трубку от устройства и закройте каждый вход и выход заглушками Люэра.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оставьте PBS в устройстве и избегайте захвата воздуха, добавив дополнительный PBS на каждое входное и выходное отверстие с помощью микропипетки перед закрытием.
  11. Оставьте устройство на ночь в темном месте при комнатной температуре (RT).
  12. На следующий день промойте устройство, заполненное PBS, 4 мл PBS с длиной волны 20 нм (как описано в шаге 6.8).
  13. Соберите последний 1 мл проточной жидкости из обоих выходов в пробирку объемом 2 мл с низким связыванием белка и храните при температуре 4 °C в качестве заготовки для частиц, вводимых устройством.
  14. Извлеките шприцы, наполненные PBS, и замените их новыми шприцами объемом 5 мл, наполненными воздухом.
  15. Продувайте устройство 4 мл воздуха до тех пор, пока вся жидкость не выйдет из устройства и трубки.

7. Тестирование устройства со стандартизированными латексными шариками

  1. Подготовьте стандартизированный образец валика, используя гранулы полистирола размером 1,0 мкм и карбоксилатные гранулы размером 0,1 мкм. В пробирку объемом 15 мл добавьте 500 мкл стандартов полистирольных шариков 1,0 мкм, 1 мкл стандартов карбоксилатных шариков 0,1 мкм и 9499 мкл 20-нм фильтруемого PBS (конечная концентрация смеси 1,0 и 0,1 мкм будет 5 × 108 шариков/мл и 3,6 × 1010 шариков/мл соответственно).
  2. Встряхните образец шарика в течение 30 секунд и храните его при температуре +4 °C, когда он не используется.
  3. Наполните один новый шприц объемом 5 мл 1,5 мл стандартизированной смеси гранул, а другой – 1,5 мл 20 нм, отфильтрованного PBS.
  4. Снимите ранее прикрепленные шприцы и присоедините шприц с шариковой смесью к первой входной трубке, а другую — ко второй.
  5. Снимите контейнер для отходов и подготовьте не менее пяти пробирок для микроцентрифуг объемом 0,5 мл для каждой выпускной трубки.
  6. Измените параметры запуска системы шприцевого насоса на Объем: 1 мл; Расход: 250 мкл/мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от потребностей пользователя можно установить различные скорости потока, такие как 250 мкл/мин, 200 мкл/мин, 150 мкл/мин, 100 мкл/мин и 50 мкл/мин. Рекомендуется провести предварительное исследование, чтобы выбрать наиболее благоприятную скорость для желаемого результата.
  7. Запустите шприцевой насос и соберите отток - от 5 до 6 капель в каждую пробирку микроцентрифуги.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если одно и то же устройство используется несколько раз, промойте устройство, как описано в шаге 6.8, и замените все разъемы, вилки и иглы. Вымойте использованные разъемы, вилки и иглы, оставив их в 20 нм отфильтрованном 70% этаноле не менее чем на 30 минут. Затем переместите все части в пробирку с отфильтрованной деионизированной водой 20 нм, тщательно встряхните пробирку и перенесите их в чашку Петри, содержащую 20 мл отфильтрованной деионизированной воды 20 нм. Оставьте чашку Петри на шейкере не менее чем на 30 минут при 100 оборотах в минуту, затем дайте вещам высохнуть в сухой чашке Петри (не менее 12 часов) перед повторным использованием.

8. Тестирование прибора с образцами мочи

  1. Подготовьте устройство, как описано в шагах 6.1-6.15.
  2. Собрать 100 мл утренней мочи на одного донора с помощью стерильных контейнеров для мочи и доставить в лабораторию для обработки в течение 2 часов после сбора.
  3. Разделите каждый образец мочи на две пробирки по 50 мл и центрифугируйте при 2'000 x g в течение 15 мин при RT.
  4. Соберите надосадочную жидкость и выбросьте гранулу.
  5. Центрифугируйте надосадочную жидкость при 10'000 x g в течение 30 минут при RT, чтобы избавиться от крупных частиц и клеточного мусора.
  6. Соберите надосадочную жидкость и выбросьте гранулу.
  7. Вымойте устройство, как описано в 6.6.
  8. Замените шприцы объемом 5 мл на шприц объемом 20 мл, заполненный подготовленным образцом мочи для входа в образец, и еще один шприц объемом 20 мл, заполненный 20 мл фильтра DEPC-PBS с длиной волны 20 нм, для входного отверстия буфера. Измените настройки шприцевого насоса на BDPlastipak; Шприц: cc; Объем: 20 мл; Расход: 250 мкл/мин (оптимальный расход), аналогично описанному в шаге 6.2. Запустите шприцевой насос и соберите проточную жидкость из каждого выпускного отверстия в отдельные пробирки по 50 мл.
  9. Концентрируйте каждую проточную пробирку отдельно, используя 100 000 молекулярных отсечных концентрационных пробирок по 100 мкл каждая при 3 000 x g при 4 °C.
  10. Перелейте концентраты в пробирки для микроцентрифуг объемом 0,5 мл.
  11. Концентрированные образцы встряхивайте в течение 30 секунд, затем вращайте в течение 10 секунд.
  12. Аликвотируют образцы, перенося 25 мкл образца на пробирку, маркируют их и замораживают при -80 °C для длительного хранения.

9. Тестирование устройств на кондиционированных средах

  1. Подготовьте устройство, как описано в шагах 6.1–6.15.
  2. Культивирование клеток в 5%-ной среде с содержаниемCO2 при 37 °C до тех пор, пока общее количество не достигнет 100 миллионов, согласно Bajo-Santos et al.20 Проведите клетки в одну суспензионную колбу T175 в 100 мл среды, не содержащей сыворотки, с добавлением 2% добавки заменителя сыворотки B-27 и культивирование в 5%-ной среде с содержаниемCO2 при 37 °C в течение дополнительных 48 ч.
  3. Соберите клеточную суспензию и центрифугируйте ее при 300 x g в течение 5 мин при RT, чтобы избавиться от клеток.
  4. Соберите и снова центрифугируйте надосадочную жидкость при 3 000 x g в течение 30 минут при +4 °C, чтобы избавиться от крупных частиц и клеточного мусора.
  5. Соберите надосадочную жидкость и храните ее при температуре +4°C до момента отделения, но не более 3 ч.
  6. Замените шприцы объемом 5 мл на шприцы по 20 мл, заполненные подготовленной кондиционированной средой для входа в образец и заполненные 20 мл 20 мл фильтруемой PBS для входа в буфер.
  7. Установите настройки на насосной станции, как описано в шаге 7.8.
  8. Запустите шприцевой насос и соберите проточную жидкость из каждого выпускного отверстия в отдельную пробирку объемом 50 мл.
  9. Концентрируйте каждую проточную пробирку отдельно, используя 100 000 пробирок для концентрации с отсечкой молекулярной массы по 150 мкл каждая при 3 000 x g при +4 °C.
  10. Перелейте концентраты в пробирки для микроцентрифуг объемом 0,5 мл.
  11. Вихревые концентрированные образцы в течение 30 с.
  12. Отжим концентрированные образцы в течение 10 с.
  13. Аликвотируйте образцы, перенося 25 мкл образца на пробирку, маркируйте их и замораживайте при -80 °C для длительного хранения.

10. Изоляция электромобилей с помощью ультрацентрифугирования

  1. Центрифуга 20 мл мочи или кондиционированной клеточной среды при 100 000 x g в течение 70 мин при +4 °C с помощью центрифуги с ротором с фиксированным углом наклона.
  2. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 20 мл 20 нм отфильтрованного PBS.
  3. Снова центрифуга, как описано в 10.1.
  4. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 12 мл 20 нм отфильтрованного PBS.
  5. Центрифуга при 100 000 x g в течение 70 мин при +4 °C с помощью поворотного ротора.
  6. Выбросьте надосадочную жидкость.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этот раз будьте осторожны при выбросе надосадочной жидкости. Делать это рекомендуется с помощью пипетки.
  7. Повторно суспендируйте гранулу в 100 мкл PBS, отфильтрованной с длиной волны 20 нм.
  8. Аликвотируют образец и переходят к настройке 12 для определения характеристик EV. В противном случае хранить при температуре -80 °C до дальнейшего использования.

11. Изоляция электромобилей с помощью эксклюзионной хроматографии (SEC)

  1. Концентрируйте 20 мл мочи или кондиционированной клеточной среды до 500 мкл с помощью центробежных фильтров с молекулярной массой 100 кДа (MWCO) при 3 000 x g при +4 °C в течение 15 минут.
  2. Перенесите концентрат на колонку SEC (диапазон нагрузки 35 нм).
  3. Вылейте 20 нм отфильтрованный PBS на колонку и соберите 15 фракций по 0,5 мл.
  4. Анализируйте фракции с помощью системы динамического рассеяния света (DLS) в соответствии с инструкциями производителя.
  5. Объедините выбранные дроби. Выбирайте фракции с аттенюатором ниже 11 и не менее 30% от общего количества частиц размером более 40 нм.
  6. Концентратируйте отобранные фракции до 100 мкл с помощью центробежных фильтров с молекулярной массой 3 кДа (MWCO) при 14 000 x g при +4 °C в течение 15 минут.
  7. Аликвотируйте образец и переходите к разделу 12 для определения характеристик EV. В противном случае хранить при температуре -80 °C до дальнейшего использования.

12. Определение характеристик электромобиля

  1. Возьмите образец для характеристики из морозильной камеры и медленно разморозьте его (на блоке льда или при +4 °C).
  2. Выполните анализ отслеживания наночастиц (NTA) для определения распределения частиц по размерам и количества13. Для подтверждения наличия ВВ в образцах проводят двухсэндвич-анализ иммуноферментного анализа с высоким аффинным мембранным белком Т-клеток 4 (TIM-4) (dsELISA)14 .

13. НТА

  1. Вихрь размороженный образец EV в течение 30 с и отжим в течение 10 с, затем переложите 1 мкл на 999 мкл 20 нм отфильтрованного PBS в пробирку микроцентрифуги объемом 2 мл, чтобы разбавить его в 1000 раз. Сохраните 1 мл дополнительного PBS, используемого для разведения, чтобы убедиться, что он не содержит частиц. Храните все при температуре +4 °C до измерения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием отфильтруйте PBS через фильтр 0,02 нм.
  2. Встряхните образец или заготовку EV в течение 30 с и введите ее в модуль с помощью шприца. Заполните модуль примерно 0,7 мл образца и поместите его в прибор.
  3. Измерьте образец с помощью анализатора наночастиц в соответствии с инструкциями производителя.

14. dsELISA для маркеров EV

  1. Приготовьте раствор 1 мкг/мл белка TIM4-Fc. Покрыть лунки 96-луночного ИФА-планшета, перенеся 100 мкл раствора в каждую необходимую лунку, и инкубировать в течение ночи при +4 °С, встряхивая при 200 об/мин.
  2. На следующий день приготовьте промывочный раствор (1x TBS + 0,05% Tween20 + 2 мМ CaCl2).
  3. Выбросьте всю жидкость в каждую лунку. Промыть каждую лунку, добавив 200 мкл промывочного раствора, встряхнуть при 200 об/мин в течение 5 мин при RT и выбросить. Повторите этот шаг дважды.
  4. Приготовьте блокирующий раствор (1x TBS + 0,05% Tween20 + 1% бычий сывороточный альбумин. Добавьте 200 мкл раствора для блокировки в каждую лунку и инкубируйте при RT в течение 1 ч при встряхивании при 200 об/мин.
  5. Промойте каждую лунку, как описано в шаге 14.3.
  6. Приготовьте 220 мкл каждого разведения образца в промывочном буфере (оптимальная концентрация ЭВ 2,7 ×10,5 ЭВ/мкл). Добавьте 100 мкл разбавленного образца на лунку и выполните два повторения. Инкубируют при RT в течение 90 мин при встряхивании при 200 об/мин.
  7. Промойте каждую лунку, как описано в шаге 14.3.
  8. Добавьте 100 мкл соответствующих антител в каждую лунку. Используйте надлежащие маркеры EV для подтверждения EV и загрязняющих веществ4. Инкубируют при RT в течение 2 ч при встряхивании при 200 об/мин. ПРИМЕЧАНИЕ: Если используются вторичные антитела, повторите шаги 14.7-14.8. Однако сократите инкубационный период вторичных антител до 1 ч.
  9. Промойте каждую лунку, как описано в шаге 14.3.
  10. Добавьте в каждую лунку по 100 мкл субстрата пероксидазы хрена, перемешайте планшет в течение 1 мин и инкубируйте при RT в течение 30 мин.
  11. Добавьте 1 M H2SO4 в каждую лунку, чтобы остановить реакцию.
  12. С помощью микропланшетного ридера измерьте поглощение на длине волны 450 нм.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Мы изготовили микрофлюидное устройство с использованием напечатанной на 3D-принтере пресс-формы с двойным негативом (рис. 1) с помощью мягкой литографии (рис. 2A) для высокопроизводительного разделения EV на основе принципа раздвоения A4F (рис. 2B

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Представленное микрофлюидное устройство предлагает многообещающий метод выделения и экстракции электромобилей из биологических жидкостей, устраняя некоторые критические ограничения существующих методов золотого стандарта, таких как UC и SEC12. UC и SEC, как известно, трудоем...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

А.А., Г.М. и Р.Р. являются учредителями, членами совета директоров и акционерами Cellbox Labs, LLC

Благодарности

Благодарим всех доноров, принявших участие в этом исследовании, сотрудников Латвийской геномной базы данных за предоставленные образцы. Институт физики твердого тела Латвийского университета в качестве Центра передового опыта получил финансирование в рамках рамочной программы Европейского Союза «Горизонт 2020» H2020-WIDESPREAD-01-2016-2017-TeamongPhase2 в рамках грантового договора No 739508, проект CAMART2. Работа выполнена при поддержке Латвийского совета по науке Проект No. lzp-2019/1-0142 и номер проекта: lzp-2022/1-0373.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.1 µm carboxylate FluoSpheresInvitrogen#F8803Stock concentration: 3.6 x 1013 beads/mL (LOT dependent)
0.5 mL microcentrifuge tubesStarstedt72.704
1 mL Luer cone syringe single use without needleRAYSTUB1ML
1.0 µm polystyrene FluoSpheresInvitrogen#F13083Stock concentration: 1 x 1010 beads/mL (LOT dependent)
10 mL Serological pipettesSarstedt86.1254.001
15 mL (100k) Amicon Ultra centrifugal filtersMerck MilliporeUFC910024
2.0 mL Protein LoBind tubesEppendorf30108132
20 mL syringesBD PlastikPak10569215
250 µm ID polyether ether ketone tubingDarwin MicrofluidicsCIL-1581
3 kDa MWCO centrifugal filter unitsMerck Millipore,UFC200324
5 mL Medical Syringe without NeedleAnhui Hongyu Wuzhou Medical159646
50 mL conical tubesSarstedt62.547.254
70 Ti fixed angle ultracentrifuge rotorBeckman Coulter337922
800 µm ID polytetrafluoroethylene tubingDarwin MicrofluidicsLVF-KTU-15
96 well microplate, f-bottom, med. bindingGreiner Bio-One655001ELISA plate
B-27 Supplement (50x), serum freeThermo Fisher Scientific17504044
Bovine serum albuminSigmaAldrichA7906-100G
COC Topas microscopy slide platformMicrofluidic Chipshop10000002
COC Topas microscopy slide platform 2 x 16 Mini Luer Microfluidic Chipshop10000387
Elveflow OB1 pressure controllerElvesys Group
Luer connectorsDarwin Microfluidics CS-10000095
Mask aligner Suss MA/BA6SUSS MicroTec Group
Mixer Thinky ARE-250Thinky Corporation
NanoSight NS300Malvern PanalyticalNS300nanoparticle analyzer 
Optical microscope Nikon Eclipse LV150NNikon Metrology NV
OSTE 322 Crystal ClearMercene Labs
PBS TABLETS.Ca/Mg free. Fisher Bioreagents. 100 gFisher ScientificBP2944-100
PC membrane (50 nm pore diameter, 11.8% density)it4ip S.A., Louvain-La Neuve, Belgium
Petri dishes, sterileSarstedt82.1472.001
Plasma Asher GIGAbatch 360 MPVA TePla America, LLC
qEVoriginal/35 nm columnIzonSP5SEC column
QSIL 216 Silicone Elastomer KitPP&S
Resin Tough BlackZortrax
SW40 Ti swing ultracentrifuge rotorBeckman Coulter331301
Syringe pumpDK InfusetekISPLab002
T175 suspension flaskSarstedt83.3912.502
TIM4-Fc proteinAdipogen LifeSciencesAG-40B-0180B-3010
TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine)SigmaAldrichT0440-100MLHorseradish peroxidase substrate
Tween20SigmaAldrichP1379-100ML
Ultracentrifuge Optima L100XPBeckman Coulter
Ultrasonic cleaning unit P 60 HElma Schmidbauer GmbH
Universal Microplate SpectrophotometerBio-Tek instruments71777-1
Urine collection cup, 150mL, sterileAPTACA2120_SG
Whatman Anotop 25 Syringe FilterSigmaAldrich68092002
Zetasizer Nano ZSMalvern Panalyticaldynamic light scattering (DLS) system 
Zortrax InkspireZortrax

Ссылки

  1. Colombo, M., et al. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 255-289 (2014).
  2. Tricarico, C., et al. Biology and biogenesis of shed microvesicles. Small GTPases. 8 (4), 220-232 (2017).
  3. Yáñez-Mó, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4 (1), 27066(2015).
  4. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  5. Wang, Z. Extracellular vesicles as an emerging drug delivery system for cancer treatment: Current strategies and recent advances. Biomed Pharmacother. 153, 113480(2022).
  6. Royo, F., et al. Methods for separation and characterization of extracellular vesicles: Results of a Worldwide Survey Performed by the ISEV Rigor and Standardization Subcommittee. Cells. 9 (9), 1955(2020).
  7. Sidhom, K., et al. A review of exosomal isolation methods: Is size exclusion chromatography the best option. Int J Mol Sci. 21 (18), 6466(2020).
  8. Reshi, Q. U. A., et al. Isolation of extracellular vesicles (EVs) using benchtop size exclusion chromatography (SEC) columns. Methods Mol Biol. 2273, 201-206 (2021).
  9. Liangsupree, T., Multia, E., Riekkola, M. L. Modern isolation and separation techniques for extracellular vesicles. J Chromatogr A. 1636, 461773(2021).
  10. Priedols, M., et al. Bifurcated asymmetric field flow fractionation of nanoparticles in PDMS-free microfluidic devices for applications in label-free extracellular vesicle separation. Polymers. 15 (4), 789(2023).
  11. Zhang, H., Lyden, D. Asymmetric-flow field-flow fractionation technology for exomere and small extracellular vesicle separation and characterization. Nat Protoc. 14 (4), 1027-1053 (2019).
  12. Talebjedi, B., et al. Exploiting microfluidics for extracellular vesicle isolation and characterization: Potential use for standardized embryo quality assessment. Front Vet Sci. 7, 620809(2020).
  13. van Meer, B. J., et al. Small molecule absorption by PDMS in the context of drug response bioassays. Biochem Biophys Res Commun. 482 (2), 323-328 (2017).
  14. Jia, Y., et al. Small extracellular vesicles isolation and separation: Current techniques, pending questions and clinical applications. Theranostics. 12 (15), 6548-6575 (2022).
  15. Bussooa, A., et al. Real-time monitoring of oxygen levels within thermoplastic Organ-on-Chip devices. Biosensors and Bioelectronics: X. 11, 100198(2022).
  16. Tang, L., Lee, N. Y. A facile route for irreversible bonding of plastic-PDMS hybrid microdevices at room temperature. Lab Chip. 10 (10), 1274-1280 (2010).
  17. Borda, E., et al. Conformable neural interface based on off-stoichiometry thiol-ene-epoxy thermosets. Biomaterials. 293, 121979(2023).
  18. Sandström, N., et al. Reaction injection molding and direct covalent bonding of OSTE+ polymer microfluidic devices. Journal of Micromechanics and Microengineering. 25 (7), 075002(2015).
  19. Sticker, D., et al. Thiol-ene based polymers as versatile materials for microfluidic devices for life sciences applications. ACS Appl Mater Interfaces. 12 (9), 10080-10095 (2020).
  20. Bajo-Santos, C., et al. Extracellular vesicles isolation from large volume samples using a polydimethylsiloxane-free microfluidic device. Int J Mol Sci. 24 (9), 7971(2023).
  21. Claridge, B., et al. Development of extracellular vesicle therapeutics: Challenges, considerations, and opportunities. Front Cell Dev Biol. 9, 734720(2021).
  22. Rezaie, J., et al. Review on exosomes application in clinical trials: Perspective, questions, and challenges. Cell Commun Signal. 20 (1), 145(2022).
  23. Aragón, I. M., et al. The urinary tract microbiome in health and disease. Eur Urol Focus. 4 (1), 128-138 (2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE204

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены