Isolamento in un'unica fase di vescicole extracellulari da campioni di grande volume con un dispositivo microfluidico A4F biforcato

Riepilogo

Le vescicole extracellulari sono estremamente promettenti per le applicazioni biomediche, ma gli attuali metodi di isolamento richiedono molto tempo e non sono pratici per l'uso clinico. In questo studio, presentiamo un dispositivo microfluidico che consente l'isolamento diretto di vescicole extracellulari da grandi volumi di biofluidi in modo continuo con passaggi minimi.

Abstract

Le vescicole extracellulari (EV) hanno un immenso potenziale per varie applicazioni biomediche, tra cui la diagnostica, la somministrazione di farmaci e la medicina rigenerativa. Tuttavia, le attuali metodologie per isolare i veicoli elettrici presentano sfide significative, come la complessità, il consumo di tempo e la necessità di apparecchiature ingombranti, che ostacolano la loro traduzione clinica. Per affrontare queste limitazioni, abbiamo mirato a sviluppare un innovativo sistema microfluidico basato su copolimero olefinico ciclico fuori stechiometria tiolo-ene (COC-OSTE) per l'isolamento efficiente di EV da campioni di grandi volumi in modo continuo. Utilizzando la separazione basata sulle dimensioni e sulla galleggiabilità, la tecnologia utilizzata in questo studio ha ottenuto una distribuzione dimensionale significativamente più stretta rispetto agli approcci esistenti da campioni di urina e terreni cellulari, consentendo il targeting di specifiche frazioni di dimensioni EV in applicazioni future. Il nostro innovativo design del dispositivo microfluidico COC-OSTE, che utilizza la tecnologia di frazionamento del flusso di campo a flusso asimmetrico biforcato, offre un approccio di isolamento EV semplice e continuo per campioni di grandi volumi. Inoltre, il potenziale per la produzione di massa di questo dispositivo microfluidico offre scalabilità e coerenza, rendendo fattibile l'integrazione dell'isolamento delle vescicole extracellulari nella diagnostica clinica di routine e nei processi industriali, dove l'elevata coerenza e produttività sono requisiti essenziali.

Introduzione

Le vescicole extracellulari (EV) sono particelle legate alla membrana derivate dalle cellule che comprendono due tipi principali: esosomi (30-200 nm) e microvescicole (200-1000 nm)¹. Gli esosomi si formano attraverso la gemmazione verso l'interno della membrana endosomiale all'interno di un corpo multivescicolare (MVB), rilasciando vescicole intraluminali (ILV) nello spazio extracellulare dopo la fusione con la membrana plasmatica¹. Al contrario, le microvescicole sono generate dalla gemmazione verso l'esterno e dalla fissione della membrana cellulare². Le vescicole extracellulari svolgono un ruolo cruciale nella comunicazione intercellulare trasportando proteine, acidi nucleici, lipidi e metaboliti, riflettendo lo stato fisiologico della cellula, tra cui la crescita, l'angiogenesi, le metastasi, la proliferazione e la resistenza alla terapia³. Di conseguenza, sono emersi come promettenti biomarcatori e bersagli terapeutici per malattie, incluso il cancro, evidenziando il loro potenziale nella diagnostica e nei sistemi di somministrazione dei farmaci⁴.

Per utilizzare appieno le vescicole extracellulari nella diagnostica e nella terapia delle malattie, è fondamentale un isolamento efficiente da vari biofluidi⁵. I metodi comuni includono l'ultracentrifugazione (UC), la centrifugazione a gradiente di densità, la cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC), la filtrazione e l'immunoisolamento⁶. L'UC è una tecnica ampiamente utilizzata, ma può produrre particelle di densità simile che non sono EV e possono generare aggregati EV⁷. La SEC ha guadagnato popolarità grazie alla sua capacità di fornire campioni di purezza più elevata escludendo le particelle in base alle dimensioni piuttosto che alla densità⁸. Tuttavia, un'attenta selezione della dimensione dei pori appropriata per la colonna SEC e l'ottimizzazione delle condizioni cromatografiche sono essenziali per ridurre al minimo il co-isolamento di particelle indesiderate come i chilomicroni e le lipoproteine a bassa densità⁸. Nonostante la loro efficacia, entrambi i metodi richiedono molto tempo e sono difficili da automatizzare, soprattutto per campioni di volume maggiore come i terreni cellulari o le urine, limitandone la scalabilità per le applicazioni industriali⁹.

Negli ultimi anni, il frazionamento asimmetrico del campo di flusso di campo (A4F) si è evoluto come una potente tecnica di separazione per la separazione di particelle di dimensioni micro e nanometriche basata su dimensioni e galleggiabilità¹⁰. Il principio di funzionamento di A4F si basa su un canale microfluidico dotato di una membrana porosa alla sua base, che genera una forza esercitata verso la membrana chiamata cross-flow¹⁰. Se combinato con il moto browniano e il flusso di Poiseuille inerente al sistema, il flusso incrociato facilita un'efficiente separazione delle particelle grazie alla variazione della posizione delle particelle all'interno della dinamica del flusso¹¹. Nonostante i vantaggi, questo metodo è limitato a volumi di campione nell'ordine dei microlitri¹² e richiede un'ulteriore fase di messa a fuoco, prolungando la durata del processo¹⁰.

Nell'ultimo decennio, la microfluidica ha guadagnato importanza come strumento per una separazione rapida, efficiente e clinicamente affidabile^{delle EV 13}. Tuttavia, la maggior parte dei metodi microfluidici progettati per la separazione delle EV sono ottimizzati per campioni di piccole dimensioni e ad alta concentrazione o dipendono da procedure di separazione complesse¹⁴. Inoltre, nel campo della microfluidica, il polidimetilsilossano (PDMS) è riconosciuto come il materiale standard aureo grazie alla sua trasparenza ottica, alla biocompatibilità e alla facilità d'uso¹⁵. Tuttavia, la sua nota propensione ad assorbire piccole molecole lipofile, comprese le vescicole extracellulari, può essere problematica per la sua applicazione nel campo delle vescicole extracellulari¹³.

Il copolimero ciclico di olefine (COC) è un materiale frequentemente utilizzato in microfluidica a causa della biocompatibilità, del piccolo assorbimento delle molecole e dell'elevata resistenza chimica¹⁵. Tuttavia, la fabbricazione di dispositivi COC comporta spesso processi complessi o apparecchiature specializzate¹⁶. In alternativa, il tiolo-ene fuori stechiometria (OSTE) è un'alternativa promettente al PDMS grazie al ridotto assorbimento di piccole molecole, alla stabilità chimica superiore, alla facilità di fabbricazione e al processo di fabbricazione scalabile^17,18. Tuttavia, a causa dei complessi collegamenti ai tubi, i dispositivi possono essere soggetti a perdite¹⁹.

Lo scopo di questo studio è stato quello di ingegnerizzare e fabbricare un dispositivo microfluidico che combinasse OSTE e COC e il principio A4F biforcato per la separazione delle EV da campioni di grandi volumi come urina o terreni cellulari.

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Protocollo

La raccolta dei campioni è stata approvata dal Comitato etico per la ricerca sulle scienze mediche e della vita dell'Università lettone (decisione N0-71-35/54)

NOTA: I materiali utilizzati in questo studio sono inclusi nel file Tabella dei materiali .

1. Fabbricazione di stampi stampati tridimensionali (3D)

1. Progettare uno stampo doppio negativo a forma di serpentina in un software CAD con le seguenti dimensioni per il canale superiore: altezza di 0,5 mm, larghezza di 1 mm e lunghezza di 210 mm. Per il canale inferiore, utilizzare lo stesso design con una larghezza di 1,5 mm, un'altezza di 0,6 mm e una lunghezza di 210 mm. Le dimensioni come la larghezza, la lunghezza, l'altezza dello stampo e l'illustrazione isometrica del design sono mostrate nella Figura 1. Salva il progetto come file .stl.
2. Preparare il file in Z-Suite; Non è necessario aggiungere alcun supporto. Stampa gli stampi utilizzando una stampante 3D con display a cristalli liquidi ultravioletti (UV LCD) con resina nera resistente.
3. Dopo la stampa, rimuovere con cautela gli stampi dalla superficie della stampante. Lavare gli stampini in isopropanolo (IPA) in sonicazione per 20 min.
4. Asciugare gli stampi con N₂.
5. Esporre gli stampi all'esposizione all'allagamento utilizzando un filtro ND33 per 810 s, quindi metterli in forno a 60 °C per 48 h.

2. Preparazione degli stampi PDMS

1. Peso PDMS in rapporto 10:1 p/p (per ogni stampo, utilizzare 16 g di base elastomerica e 1,6 g di agente reticolante). Miscelare i componenti in un mescolatore centrifugo planetario, mescolando per 1 min a 500 RPM.
2. Colare il PDMS misto negli stampi stampati in 3D e degassare in un essiccatore sottovuoto a -800 mbar per 30 minuti o fino a quando non si osservano bolle.
3. Posizionare con cautela un rivestimento in cloruro di polivinile di 100 μm di spessore sopra il PDMS liquido.
   NOTA: Applicare lentamente la fodera da un lato all'altro per evitare la formazione di bolle.
4. Inserire lo stampo con PDMS in una maschera Mold-in-Place e serrare la maschera utilizzando una chiave dinamometrica impostata su 0.3 Nm.
5. Mettere la maschera in forno a 60 °C per 3 ore per polimerizzare il PDMS.
6. Smontare la maschera utilizzando una chiave esagonale e rimuovere lo stampo stampato in 3D dalla dima.
7. Sformare con cura gli stampi PDMS dagli stampi master stampati in 3D, correndo intorno ai bordi dello stampo con un bisturi, quindi rimuovendo lo stampo con una pinzetta.
   NOTA: Per una più facile rimozione della muffa, è possibile utilizzare l'IPA; tuttavia, gli stampi devono essere riscaldati a 60 °C per 10 minuti per far evaporare l'IPA in eccesso.

3. Preparazione del canale superiore OSTE-COC

1. Peso OSTE con rapporto 1,09:1 p/p (per 5 dispositivi sono necessari 1,56 g di parte A e 1,44 g di parte B). Miscelare i componenti in un mescolatore centrifugo planetario: miscelare per 5 min a 750 RPM, quindi degassare per 5 min a 750 RPM.
2. Trasferire l'OSTE miscelato in una provetta da centrifuga e degassare a -800 mbar in un essiccatore sottovuoto per 30 minuti.
3. Pulire i vetrini COC con 2 x 16 connettori mini Luer mediante sonicazione in alcool isopropilico per 10 min. Asciugare accuratamente i vetrini con N₂.
4. Posizionare i vetrini COC puliti nell'asher al plasma in modo che la superficie piana sia posizionata verso l'alto e trattare la superficie con plasma di ossigeno 800 SCCM per 2 minuti a una potenza di 700 W con una pressione di 0.133 mbar.
5. Posizionare il vetrino COC ossidato sullo stampo PDMS per il canale superiore in modo che la superficie trattata sia a contatto con la superficie strutturata del PDMS. Posizionare il gruppo in una dima Mold-in-Place, serrando la dima con una chiave dinamometrica impostata su 0.3 Nm.
6. Collegare il sistema di pressione alla linea dell'aria compressa a 6 bar. Prendere la provetta da centrifuga con OSTE degassata e assemblarla secondo le istruzioni del sistema a pressione utilizzando un tubo in politetrafluoroetilene (PTFE) con diametro interno (ID) di 0.8 mm.
7. Collegare il tubo in PTFE all'ingresso dello stampo PDMS e, utilizzando una pressione di 1000 mbar mantenuta da una pompa piezoelettrica situata nel sistema di pressione, riempire il dispositivo. Posizionare la dima con il lato di vetro rivolto verso l'alto nell'allineatore della maschera ed esporre con una dose di 850 mJ utilizzando il filtro ND33.
8. Dopo l'esposizione, smontare la maschera utilizzando una chiave esagonale e rimuovere con cautela il vetrino COC con lo strato OSTE strutturato dallo stampo PDMS.
9. Portare l'OSTE strutturato a contatto con una membrana di 25 mm x 75 mm con pori di 50 nm e densità dei pori dell'11,8% in modo che i canali siano completamente ricoperti dalla membrana.
   NOTA: È particolarmente importante mantenere la membrana il più dritta possibile durante il processo di applicazione.
10. Posizionare il gruppo su una piastra riscaldante impostata a 60°C con il lato della membrana rivolto verso l'alto, posizionare un vetrino pulito sopra la membrana e applicare una pressione di 1.6 kPa dall'alto per garantire un legame uniforme. Riscaldare il gruppo durante la notte.
    NOTA: Dopo questo passaggio, è particolarmente importante valutare le prestazioni di incollaggio e la deformazione del canale.

4. Preparazione del canale inferiore OSTE-COC e assemblaggio del dispositivo

1. Miscelare OSTE con un rapporto p/p di 1,09:1 (per 5 dispositivi sono necessari 1,56 g di parte A e 1,44 g di parte B). Miscelare i componenti in un mescolatore centrifugo planetario: miscelare per 5 minuti a 750 RPM, quindi degassare per 5 minuti a 750 RPM.
2. Trasferire l'OSTE miscelato in un tubo di falco e degassare a -800 mbar in un essiccatore sottovuoto per 30 minuti.
3. Pulire i vetrini COC mediante sonicazione in alcool isopropilico per 10 minuti. Asciugare accuratamente i vetrini con N₂.
4. Posizionare i vetrini COC puliti nel plasma asher e trattare la superficie con plasma di ossigeno 800 SCCM per 2 minuti a una potenza di 700 W con una pressione di 0,133 mbar.
5. Posizionare il vetrino COC ossidato sullo stampo PDMS per il canale inferiore in modo che la superficie trattata sia a contatto con la superficie strutturata del PDMS. Posizionare il gruppo in una dima Mold-in-Place, serrando la dima con una chiave dinamometrica impostata su 0.3 Nm.
6. Prendere il tubo Falcon con OSTE degassato e assemblarlo secondo le istruzioni del sistema di pressione utilizzando un tubo in PTFE con ID di 0.8 mm.
7. Collegare il tubo in PTFE all'ingresso dello stampo PDMS e utilizzando una pressione di 1000 mbar riempire il dispositivo. Posizionare la maschera con il lato di vetro rivolto verso l'alto nell'allineatore della maschera ed esporre con una dose di 1100 mJ utilizzando il filtro ND33.
8. Dopo l'esposizione, smontare la maschera utilizzando una chiave esagonale e rimuovere con cautela il vetrino COC con lo strato OSTE strutturato dallo stampo PDMS.
9. Combinare lo strato OSTE strutturato con l'assieme del canale superiore in modo che il design dello strato superiore e inferiore sia allineato tra loro e che lo strato inferiore OSTE sia a contatto con la membrana.
10. Inserire il disegno in una dima Mold-in-Place e, utilizzando clip bulldog, applicare una pressione di 1,6 kPa al dispositivo in modo uniforme. Mettere la maschera in forno a 60°C per una notte.
    NOTA: Il posizionamento irregolare delle clip può causare un incollaggio irregolare.

5. Valutazione del dispositivo

1. Dopo l'incollaggio, valutare visivamente i dispositivi con un microscopio per difetti visivi, ad esempio deformazione del canale o incollaggio non riuscito.
2. Testare i dispositivi senza difetti facendo passare acqua deionizzata filtrata da 0,02 μm attraverso i canali con una pressione di 30 mbar. Osservare le perdite del canale di flusso e della porta Luer e il flusso d'acqua.
   NOTA: Se non è possibile rilevare alcuna perdita e il flusso del canale è ininterrotto, i dispositivi sono considerati utilizzabili per ulteriori esperimenti.

6. Configurazione del dispositivo

1. Riempire due siringhe da 5 mL con 2 mL di 20 nm filtrati al 3% H₂O₂ e montarle su una pompa a siringa (utilizzare le frecce di movimento per la distanza necessaria, inserire le siringhe e fissarle in posizione con la barra superiore).
   CAUTELA! Prestare sempre attenzione quando si maneggia H₂O₂. Indossa un camice da laboratorio, guanti di gomma protettivi e protezione per gli occhi.
2. Collegare il tubo in PTFE ID 800 μm lungo 14 cm alle siringhe utilizzando gli aghi della siringa e agli ingressi del dispositivo utilizzando i connettori Luer.
3. Collegare un tubo in polietere etere chetone (PEEK) con ID da 20 cm e 200 μm alle uscite.
4. Collegare l'altra estremità del tubo in PEEK a un contenitore per rifiuti. La configurazione può essere illustrata nella Figura 3.
5. Avviare la pompa a siringa alla velocità di flusso di 500 μL/min per ciascun ingresso (sullo schermo dello strumento: Impostazioni > Sistema Set > Siringa (produttore: siringa medica, siringa: 5 mL) > Pulsante Indietro > Parametri (Selezionare: infusione, Ripetizione: 1, Volume: 1,5 mL, Flusso: 500 μL/min) > Pulsante Indietro > Pulsante Indietro ). Raccogliere il flusso passante in un contenitore per rifiuti.
6. Riempire due nuove siringhe da 5 mL con 2 mL di etanolo filtrato al 70% a 20 nm.
7. Sostituire le siringhe precedenti con le siringhe riempite di etanolo e avviare la pompa a siringa utilizzando gli stessi parametri descritti al punto 6.5.
8. Utilizzare nuove siringhe da 5 mL e riempirle con 5 mL di soluzione salina tamponata con fosfato filtrato (PBS) a 20 nm.
9. Sostituire le siringhe precedenti con le siringhe riempite di PBS e sciacquare il dispositivo con 4 mL di PBS ripetendo i passaggi 6.1. e 6.5.
   NOTA: Assicurarsi di modificare i parametri di configurazione del sistema su Volume: 4 mL (sullo schermo dello strumento: Impostazioni > Parametri > (Selezionare: Volume: 4 mL).
10. Scollegare il tubo dal dispositivo e chiudere ogni ingresso e uscita con spine Luer.
    NOTA: Lasciare il PBS nel dispositivo ed evitare di intrappolare l'aria aggiungendo ulteriore PBS su ciascun ingresso e uscita utilizzando una micropipetta prima della chiusura.
11. Lasciare il dispositivo per una notte in un luogo buio a temperatura ambiente (RT).
12. Il giorno seguente, lavare il dispositivo riempito di PBS con 4 mL di PBS filtrato a 20 nm (come descritto al punto 6.8).
13. Raccogliere l'ultimo 1 mL del flusso da entrambe le uscite in una provetta da 2 mL a basso legame con proteine e conservare a 4 °C come bianco per le particelle introdotte dal dispositivo.
14. Rimuovere le siringhe riempite di PBS e sostituirle con nuove siringhe da 5 ml riempite d'aria.
15. Spurgare il dispositivo con 4 ml di aria fino a quando tutto il liquido non è uscito dal dispositivo e dal tubo.

7. Test del dispositivo con perline di lattice standardizzate

1. Preparare un campione standardizzato di microsfere utilizzando polistirene da 1,0 μm e perle di carbossilato da 0,1 μm. A una provetta da 15 mL, aggiungere 500 μL di standard di microsfere di polistirene da 1,0 μm, 1 μL di standard di microsfere di carbossilato da 0,1 μm e 9499 μL di PBS filtrato da 20 nm (la concentrazione finale della miscela di microsfere da 1,0 e 0,1 μm sarà rispettivamente di 5 × 108 perline/mL e di 3,6 × 1010 perline/mL).
2. Vorticare il campione di microsfere per 30 s e conservarlo a +4 °C quando non è in uso.
3. Riempire una nuova siringa da 5 mL con 1,5 mL della miscela di microsfere standardizzata e un'altra con 1,5 mL di PBS filtrato a 20 nm.
4. Rimuovere le siringhe precedentemente collegate e collegare la siringa della miscela di perline al primo tubo di ingresso e l'altro al secondo ingresso.
5. Rimuovere il contenitore dei rifiuti e preparare almeno cinque provette per microcentrifuga da 0,5 mL per ciascun tubo di uscita.
6. Modificare i parametri di avvio del sistema della pompa a siringa su Volume: 1 mL; Portata: 250 μL/min.
   NOTA: A seconda delle esigenze dell'utente, è possibile impostare diverse velocità di flusso come 250 μL/min, 200 μL/min, 150 μL/min, 100 μL/min e 50 μL/min. Si raccomanda uno studio preliminare per scegliere la velocità più favorevole per il risultato desiderato.
7. Avviare la pompa a siringa e raccogliere il deflusso - da 5 a 6 goccioline in ciascuna provetta per microcentrifuga.
   NOTA: Se lo stesso dispositivo viene utilizzato più volte, sciacquare il dispositivo come descritto al punto 6.8 e sostituire tutti i connettori, le spine e gli aghi. Lavare i connettori, le spine e gli aghi usati lasciandoli in etanolo filtrato al 70% a 20 nm per almeno 30 minuti. Quindi, spostare tutte le parti in una provetta contenente acqua deionizzata filtrata a 20 nm, agitare accuratamente la provetta e trasferirle in una capsula di Petri contenente 20 mL di acqua deionizzata filtrata a 20 nm. Lasciare la capsula di Petri sullo shaker per almeno 30 minuti a 100 giri/min, quindi lasciare asciugare le cose in una capsula di Petri asciutta (per almeno 12 ore) prima di riutilizzarla.

8. Test del dispositivo con campioni di urina

1. Preparare il dispositivo come descritto nei passaggi 6.1-6.15.
2. Raccogliere 100 ml di urina mattutina per donatore utilizzando contenitori sterili per urina e consegnarla al laboratorio per l'elaborazione entro 2 ore dalla raccolta.
3. Separare ogni campione di urina in due provette da 50 mL e centrifugare a 2'000 x g per 15 minuti a RT.
4. Raccogliere il surnatante e gettare il pellet.
5. Centrifugare il surnatante a 10'000 x g per 30 minuti a RT per eliminare le particelle di grandi dimensioni e i detriti cellulari.
6. Raccogliere il surnatante e gettare il pellet.
7. Lavare il dispositivo come descritto al punto 6.6.
8. Sostituire le siringhe da 5 mL con una siringa da 20 mL riempita con il campione di urina preparato per l'ingresso del campione e un'altra siringa da 20 mL riempita con 20 mL di DEPC-PBS filtrato da 20 nm per l'ingresso del tampone. Modificare le impostazioni della pompa a siringa in BDPlastipak; Siringa: cc; Capacità: 20 mL; Portata: 250 μL/min (portata ottimale), analogamente a quanto descritto al punto 6.2. Avviare la pompa a siringa e raccogliere il flusso da ciascuna uscita in provette separate da 50 ml.
9. Concentrare ogni flusso a flusso singolo utilizzando 100.000 provette di concentrazione cut-off a peso molecolare a 100 μL ciascuna a 3.000 x g a 4 °C.
10. Trasferire i concentrati in provette per microcentrifuga da 0,5 mL.
11. Agitare i campioni concentrati per 30 secondi, quindi ruotare per 10 secondi.
12. Aliquotare i campioni trasferendo 25 μL di campione per provetta, etichettarli e congelarli a -80 °C per la conservazione a lungo termine.

9. Test del dispositivo con mezzi condizionati

1. Preparare il dispositivo come descritto nei passaggi 6.1-6.15.
2. Cellule di coltura in un ambiente umidificato al 5% di CO₂ a 37 °C fino a quando il conteggio totale raggiunge i 100 milioni secondo Bajo-Santos et ^al.20 Passaggio delle cellule in un singolo pallone di sospensione T175 in 100 mL di terreno privo di siero integrato con integratore sostitutivo del siero B-27 al 2% e coltura in un ambiente umidificato al 5% di CO₂ a 37 °C per ulteriori 48 ore.
3. Raccogliere la sospensione cellulare e centrifugarla a 300 x g per 5 minuti a RT per eliminare le cellule.
4. Raccogliere e centrifugare nuovamente il surnatante a 3.000 x g per 30 minuti a +4 °C per eliminare le particelle di grandi dimensioni e i detriti cellulari.
5. Raccogliere il surnatante e conservarlo a +4°C fino a quando la separazione può avvenire, ma non più di 3 ore.
6. Sostituire le siringhe da 5 mL con siringhe da 20 mL riempite con il terreno condizionato preparato per l'ingresso del campione e riempite con 20 mL di PBS filtrato da 20 nm per l'ingresso del tampone.
7. Impostare le impostazioni nella stazione di pompaggio come descritto al punto 7.8.
8. Avviare la pompa a siringa e raccogliere il flusso da ciascuna uscita in una provetta separata da 50 ml.
9. Concentrare ogni flusso in modo separato utilizzando 100.000 provette di concentrazione cut-off a peso molecolare da 150 μL ciascuna a 3.000 x g a +4 °C.
10. Trasferire i concentrati in provette per microcentrifuga da 0,5 mL.
11. Campioni concentrati a vortice per 30 s.
12. Centrifugare i campioni concentrati per 10 s.
13. Aliquotare i campioni trasferendo 25 μL di campione per provetta, etichettarli e congelarli a -80 °C per la conservazione a lungo termine.

10. Isolamento delle vescicole extracellulari mediante ultracentrifugazione

1. Centrifugare 20 mL di urina o terreni cellulari condizionati a 100.000 x g per 70 minuti a +4 °C utilizzando una centrifuga con rotore ad angolo fisso.
2. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 20 mL di PBS filtrato a 20 nm.
3. Centrifugare di nuovo, come spiegato al punto 10.1.
4. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 12 mL di PBS filtrato a 20 nm.
5. Centrifugare a 100.000 x g per 70 minuti a +4 °C utilizzando un rotore oscillante.
6. Scartare il surnatante.
   NOTA: Prestare attenzione quando si scarta il surnatante questa volta. Si consiglia di farlo con una pipetta.
7. Risospendere il pellet in 100 μL di PBS filtrato a 20 nm.
8. Aliquotare il campione e procedere alla sezione 12 per la caratterizzazione delle EV. In caso contrario, conservare a -80 °C fino al nuovo utilizzo.

11. Isolamento delle vescicole extracellulari mediante cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC)

1. Concentrare 20 mL di urina o terreni cellulari condizionati a 500 μL utilizzando unità filtranti centrifughe a 100 kDa a 3.000 x g a +4 °C per 15 min.
2. Trasferire il concentrato sulla colonna SEC (intervallo di carico di 35 nm).
3. Versare il PBS filtrato a 20 nm sulla colonna e raccogliere 15 frazioni da 0,5 mL.
4. Analizza le frazioni con un sistema di diffusione dinamica della luce (DLS) seguendo le istruzioni del produttore.
5. Raggruppa le frazioni selezionate. Scegliere frazioni con un attenuatore inferiore a 11 e almeno il 30% delle particelle totali di dimensioni superiori a 40 nm.
6. Concentrare le frazioni selezionate a 100 μL utilizzando unità filtranti centrifughe a 3 kDa con cut-off a peso molecolare (MWCO) a 14.000 x g a +4 °C per 15 min.
7. Aliquotare il campione e passare alla sezione 12 per la caratterizzazione delle EV. In caso contrario, conservare a -80 °C fino al nuovo utilizzo.

12. Caratterizzazione delle EV

1. Prelevare il campione da caratterizzare dal congelatore e scongelarlo lentamente (su un blocco di ghiaccio o a +4 °C).
2. Eseguire l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA) per determinare la distribuzione granulometrica e la quantit๳. Eseguire il test di immunoassorbimento enzimatico legato all'enzima a doppio sandwich (dsELISA) della proteina di membrana delle cellule T ad alta affinità (TIM-4)¹⁴ per confermare la presenza di EV nei campioni.

13. NTA

1. Vorticare il campione EV scongelato per 30 s e centrifugare per 10 s, quindi trasferire 1 μL a 999 μL di PBS filtrato da 20 nm in una provetta da microcentrifuga da 2 mL per diluirlo di 1000 volte. Conservare 1 mL di PBS extra utilizzato per la diluizione per verificare che non contenga particelle. Conservare il tutto a +4 °C fino alla misurazione.
   NOTA: Filtrare il PBS attraverso un filtro da 0.02 nm prima dell'uso.
2. Agitare il campione EV o il bianco per 30 secondi e inserirlo nel modulo utilizzando una siringa. Riempire il modulo con circa 0,7 mL di campione e inserirlo nello strumento.
3. Misurare il campione utilizzando lo strumento analizzatore di nanoparticelle seguendo le istruzioni del produttore.

14. dsELISA per marcatori EV

1. Preparare una soluzione di 1 μg/mL di proteina TIM4-Fc. Rivestire i pozzetti di una piastra ELISA a 96 pozzetti trasferendo 100 μL di soluzione in ciascun pozzetto necessario e incubare per una notte a +4 °C agitando a 200 giri/min.
2. Il giorno seguente, preparare la soluzione di lavaggio (1x TBS + 0,05% Tween20 + 2 mM CaCl₂).
3. Scartare tutto il liquido in ogni pozzetto. Lavare ogni pozzetto aggiungendo 200 μL di soluzione di lavaggio, agitando a 200 giri/min per 5 minuti a RT e scartando. Ripeti questo passaggio due volte.
4. Preparare la soluzione bloccante (1x TBS + 0,05% Tween20 + 1% albumina sierica bovina. Aggiungere 200 μL di soluzione bloccante a ciascun pozzetto e incubare a RT per 1 ora agitando a 200 giri/min.
5. Lavare ogni pozzetto come descritto al punto 14.3.
6. Preparare 220 μL di ciascuna diluizione del campione nel tampone di lavaggio (la concentrazione ottimale di EV è 2,7 × 10⁵ EVs/μL). Aggiungere 100 μL di campione diluito per pozzetto ed eseguire due repliche. Incubare a RT per 90 minuti agitando a 200 giri/min.
7. Lavare ogni pozzetto come descritto al punto 14.3.
8. Aggiungere 100 μL di anticorpi corrispondenti a ciascun pozzetto. Utilizzare marcatori EV appropriati per confermare la presenza di vescicole extracellulari e contaminanti⁴. Incubare a RT per 2 ore agitando a 200 RPM. NOTA: Se si utilizzano anticorpi secondari, ripetere i passaggi 14.7-14.8. Tuttavia, ridurre il periodo di incubazione degli anticorpi secondari a 1 ora.
9. Lavare ogni pozzetto come descritto al punto 14.3.
10. Aggiungere 100 μL di substrato di perossidasi di rafano in ciascun pozzetto, mescolare la piastra per 1 minuto e incubare a RT per 30 minuti.
11. Aggiungere 1 M H₂SO₄ a ciascun pozzetto per arrestare la reazione.
12. Utilizzando un lettore per micropiastre, misurare l'assorbanza a 450 nm.

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Risultati

Abbiamo fabbricato un dispositivo microfluidico utilizzando uno stampo a doppio negativo stampato in 3D (Figura 1) tramite litografia morbida (Figura 2A) per la separazione di EV ad alta produttività basata sul principio A4F biforcato (Figura 2B,C). La configurazione richiede una pompa e una stazione di flusso, come si può vedere nella Figura 3, per l'isolamento dei veicoli elettrici ...

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Discussione

Il dispositivo microfluidico presentato offre un metodo promettente per l'isolamento e l'estrazione di vescicole extracellulari da fluidi biologici, affrontando alcuni dei limiti critici dei metodi gold standard esistenti come UC e SEC¹². UC e SEC sono noti per essere laboriosi, dispendiosi in termini di tempo e soffrono di un basso rendimento, il che li rende meno adatti per applicazioni ad alto rendimento in cui sono necessarie grandi quantità di veicoli elettrici^21,22

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 µm carboxylate FluoSpheres	Invitrogen	#F8803	Stock concentration: 3.6 x 1013 beads/mL (LOT dependent)
0.5 mL microcentrifuge tubes	Starstedt	72.704
1 mL Luer cone syringe single use without needle	RAYS	TUB1ML
1.0 µm polystyrene FluoSpheres	Invitrogen	#F13083	Stock concentration: 1 x 1010 beads/mL (LOT dependent)
10 mL Serological pipettes	Sarstedt	86.1254.001
15 mL (100k) Amicon Ultra centrifugal filters	Merck Millipore	UFC910024
2.0 mL Protein LoBind tubes	Eppendorf	30108132
20 mL syringes	BD PlastikPak	10569215
250 µm ID polyether ether ketone tubing	Darwin Microfluidics	CIL-1581
3 kDa MWCO centrifugal filter units	Merck Millipore,	UFC200324
5 mL Medical Syringe without Needle	Anhui Hongyu Wuzhou Medical	159646
50 mL conical tubes	Sarstedt	62.547.254
70 Ti fixed angle ultracentrifuge rotor	Beckman Coulter	337922
800 µm ID polytetrafluoroethylene tubing	Darwin Microfluidics	LVF-KTU-15
96 well microplate, f-bottom, med. binding	Greiner Bio-One	655001	ELISA plate
B-27 Supplement (50x), serum free	Thermo Fisher Scientific	17504044
Bovine serum albumin	SigmaAldrich	A7906-100G
COC Topas microscopy slide platform	Microfluidic Chipshop	10000002
COC Topas microscopy slide platform 2 x 16 Mini Luer	Microfluidic Chipshop	10000387
Elveflow OB1 pressure controller	Elvesys Group
Luer connectors	Darwin Microfluidics	CS-10000095
Mask aligner Suss MA/BA6	SUSS MicroTec Group
Mixer Thinky ARE-250	Thinky Corporation
NanoSight NS300	Malvern Panalytical	NS300	nanoparticle analyzer
Optical microscope Nikon Eclipse LV150N	Nikon Metrology NV
OSTE 322 Crystal Clear	Mercene Labs
PBS TABLETS.Ca/Mg free. Fisher Bioreagents. 100 g	Fisher Scientific	BP2944-100
PC membrane (50 nm pore diameter, 11.8% density)	it4ip S.A., Louvain-La Neuve, Belgium
Petri dishes, sterile	Sarstedt	82.1472.001
Plasma Asher GIGAbatch 360 M	PVA TePla America, LLC
qEVoriginal/35 nm column	Izon	SP5	SEC column
QSIL 216 Silicone Elastomer Kit	PP&S
Resin Tough Black	Zortrax
SW40 Ti swing ultracentrifuge rotor	Beckman Coulter	331301
Syringe pump	DK Infusetek	ISPLab002
T175 suspension flask	Sarstedt	83.3912.502
TIM4-Fc protein	Adipogen LifeSciences	AG-40B-0180B-3010
TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine)	SigmaAldrich	T0440-100ML	Horseradish peroxidase substrate
Tween20	SigmaAldrich	P1379-100ML
Ultracentrifuge Optima L100XP	Beckman Coulter
Ultrasonic cleaning unit P 60 H	Elma Schmidbauer GmbH
Universal Microplate Spectrophotometer	Bio-Tek instruments	71777-1
Urine collection cup, 150mL, sterile	APTACA	2120_SG
Whatman Anotop 25 Syringe Filter	SigmaAldrich	68092002
Zetasizer Nano ZS	Malvern Panalytical		dynamic light scattering (DLS) system
Zortrax Inkspire	Zortrax