Aislamiento en un solo paso de vesículas extracelulares a partir de muestras de gran volumen con un dispositivo microfluídico A4F bifurcado

Resumen

Las vesículas extracelulares son muy prometedoras para las aplicaciones biomédicas, pero los métodos de aislamiento actuales requieren mucho tiempo y no son prácticos para el uso clínico. En este estudio, presentamos un dispositivo microfluídico que permite el aislamiento directo de vesículas extracelulares de grandes volúmenes de biofluidos de forma continua y con pasos mínimos.

Resumen

Las vesículas extracelulares (VE) tienen un inmenso potencial para diversas aplicaciones biomédicas, como el diagnóstico, la administración de fármacos y la medicina regenerativa. Sin embargo, las metodologías actuales para aislar los vehículos eléctricos presentan desafíos significativos, como la complejidad, el consumo de tiempo y la necesidad de equipos voluminosos, lo que dificulta su traslación clínica. Para abordar estas limitaciones, nos propusimos desarrollar un sistema microfluídico innovador basado en tiol-eno de copolímero de olefina cíclica fuera de estequiometría (COC-OSTE) para el aislamiento eficiente de EV de muestras de gran volumen de manera continua. Al utilizar la separación basada en el tamaño y la flotabilidad, la tecnología utilizada en este estudio logró una distribución de tamaño significativamente más estrecha en comparación con los enfoques existentes a partir de muestras de orina y medios celulares, lo que permite apuntar a fracciones específicas de tamaño EV en aplicaciones futuras. Nuestro innovador diseño de dispositivo microfluídico COC-OSTE, que utiliza la tecnología de fraccionamiento de flujo de campo de flujo asimétrico bifurcado, ofrece un enfoque de aislamiento EV sencillo y continuo para muestras de gran volumen. Además, el potencial para la fabricación en masa de este dispositivo microfluídico ofrece escalabilidad y consistencia, lo que hace factible integrar el aislamiento de EV en diagnósticos clínicos rutinarios y procesos industriales, donde la alta consistencia y rendimiento son requisitos esenciales.

Introducción

Las vesículas extracelulares (VE) son partículas derivadas de células unidas a la membrana que comprenden dos tipos principales: exosomas (30-200 nm) y microvesículas (200-1000 nm)¹. Los exosomas se forman a través de la gemación hacia adentro de la membrana endosomal dentro de un cuerpo multivesicular (MVB), liberando vesículas intraluminales (ILV) en el espacio extracelular al fusionarse con la membrana plasmática¹. Por el contrario, las microvesículas se generan por gemación y fisión hacia afuera de la membrana celular². Los VE desempeñan un papel crucial en la comunicación intercelular mediant....

Protocolo

La recogida de muestras fue aprobada por el Comité de Ética de la Investigación en Ciencias Médicas y de la Vida de la Universidad de Letonia (decisión N0-71-35/54)

NOTA: Los materiales utilizados en este estudio se incluyen en el archivo de la Tabla de Materiales .

1. Fabricación de moldes impresos tridimensionales (3D)

1. Diseñe un molde de doble negativo en forma de serpentina en software CAD con las siguientes dimensiones para el canal superior: altura de 0,5 mm, ancho de 1 mm y longitud de 210 mm. Para el canal inferior, utilice el mismo diseño con una anchura de 1,5 ....

Resultados

Fabricamos un dispositivo microfluídico utilizando un molde de doble negativo impreso en 3D (Figura 1) mediante litografía blanda (Figura 2A) para la separación de EV de alto rendimiento basado en el principio A4F bifurcado (Figura 2B, C). La configuración requiere una bomba y una estación de flujo continuo, como se puede ver en la Figura 3, para el aislamiento de vehículos eléct.......

Discusión

El dispositivo microfluídico presentado ofrece un método prometedor para el aislamiento y la extracción de vehículos eléctricos de fluidos biológicos, abordando algunas de las limitaciones críticas de los métodos estándar de oro existentes, como UC y SEC¹². Se sabe que la UC y la SEC requieren mucha mano de obra, consumen mucho tiempo y tienen un bajo rendimiento, lo que las hace menos adecuadas para aplicaciones de alto rendimiento en las que se necesitan grandes cantidades de vehículos.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 µm carboxylate FluoSpheres	Invitrogen	#F8803	Stock concentration: 3.6 x 1013 beads/mL (LOT dependent)
0.5 mL microcentrifuge tubes	Starstedt	72.704
1 mL Luer cone syringe single use without needle	RAYS	TUB1ML
1.0 µm polystyrene FluoSpheres	Invitrogen	#F13083	Stock concentration: 1 x 1010 beads/mL (LOT dependent)
10 mL Serological pipettes	Sarstedt	86.1254.001
15 mL (100k) Amicon Ultra centrifugal filters	Merck Millipore	UFC910024
2.0 mL Protein LoBind tubes	Eppendorf	30108132
20 mL syringes	BD PlastikPak	10569215
250 µm ID polyether ether ketone tubing	Darwin Microfluidics	CIL-1581
3 kDa MWCO centrifugal filter units	Merck Millipore,	UFC200324
5 mL Medical Syringe without Needle	Anhui Hongyu Wuzhou Medical	159646
50 mL conical tubes	Sarstedt	62.547.254
70 Ti fixed angle ultracentrifuge rotor	Beckman Coulter	337922
800 µm ID polytetrafluoroethylene tubing	Darwin Microfluidics	LVF-KTU-15
96 well microplate, f-bottom, med. binding	Greiner Bio-One	655001	ELISA plate
B-27 Supplement (50x), serum free	Thermo Fisher Scientific	17504044
Bovine serum albumin	SigmaAldrich	A7906-100G
COC Topas microscopy slide platform	Microfluidic Chipshop	10000002
COC Topas microscopy slide platform 2 x 16 Mini Luer	Microfluidic Chipshop	10000387
Elveflow OB1 pressure controller	Elvesys Group
Luer connectors	Darwin Microfluidics	CS-10000095
Mask aligner Suss MA/BA6	SUSS MicroTec Group
Mixer Thinky ARE-250	Thinky Corporation
NanoSight NS300	Malvern Panalytical	NS300	nanoparticle analyzer
Optical microscope Nikon Eclipse LV150N	Nikon Metrology NV
OSTE 322 Crystal Clear	Mercene Labs
PBS TABLETS.Ca/Mg free. Fisher Bioreagents. 100 g	Fisher Scientific	BP2944-100
PC membrane (50 nm pore diameter, 11.8% density)	it4ip S.A., Louvain-La Neuve, Belgium
Petri dishes, sterile	Sarstedt	82.1472.001
Plasma Asher GIGAbatch 360 M	PVA TePla America, LLC
qEVoriginal/35 nm column	Izon	SP5	SEC column
QSIL 216 Silicone Elastomer Kit	PP&S
Resin Tough Black	Zortrax
SW40 Ti swing ultracentrifuge rotor	Beckman Coulter	331301
Syringe pump	DK Infusetek	ISPLab002
T175 suspension flask	Sarstedt	83.3912.502
TIM4-Fc protein	Adipogen LifeSciences	AG-40B-0180B-3010
TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine)	SigmaAldrich	T0440-100ML	Horseradish peroxidase substrate
Tween20	SigmaAldrich	P1379-100ML
Ultracentrifuge Optima L100XP	Beckman Coulter
Ultrasonic cleaning unit P 60 H	Elma Schmidbauer GmbH
Universal Microplate Spectrophotometer	Bio-Tek instruments	71777-1
Urine collection cup, 150mL, sterile	APTACA	2120_SG
Whatman Anotop 25 Syringe Filter	SigmaAldrich	68092002
Zetasizer Nano ZS	Malvern Panalytical		dynamic light scattering (DLS) system
Zortrax Inkspire	Zortrax