Einstufige Isolierung extrazellulärer Vesikel aus großvolumigen Proben mit einem gegabelten mikrofluidischen A4F-Gerät

Zusammenfassung

Extrazelluläre Vesikel sind für biomedizinische Anwendungen sehr vielversprechend, aber die derzeitigen Isolierungsmethoden sind zeitaufwändig und für den klinischen Einsatz unpraktisch. In dieser Studie stellen wir ein mikrofluidisches Gerät vor, das die direkte Isolierung extrazellulärer Vesikel aus großen Mengen von Bioflüssigkeiten in einer kontinuierlichen Weise mit minimalen Schritten ermöglicht.

Zusammenfassung

Extrazelluläre Vesikel (EVs) bergen ein immenses Potenzial für verschiedene biomedizinische Anwendungen, einschließlich Diagnostik, Arzneimittelabgabe und regenerative Medizin. Dennoch stellen die aktuellen Methoden zur Isolierung von Elektrofahrzeugen erhebliche Herausforderungen dar, wie z. B. Komplexität, Zeitaufwand und die Notwendigkeit sperriger Geräte, die ihre klinische Umsetzung behindern. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wollten wir ein innovatives mikrofluidisches System entwickeln, das auf zyklischem Olefin-Copolymer-Off-Stöchiometrie-Thiol-En (COC-OSTE) für die effiziente und kontinuierliche Isolierung von EVs aus großvolumigen Proben basiert. Durch die Verwendung einer größen- und auftriebsbasierten Trennung erreichte die in dieser Studie verwendete Technologie eine deutlich engere Größenverteilung im Vergleich zu bestehenden Ansätzen aus Urin- und Zellmedienproben, was die gezielte Ausrichtung auf spezifische EV-Größenfraktionen in zukünftigen Anwendungen ermöglicht. Unser innovatives mikrofluidisches COC-OSTE-Gerätedesign, das die Technologie der gegabelten asymmetrischen Durchflussfeld-Durchflussfraktionierung verwendet, bietet einen einfachen und kontinuierlichen EV-Isolationsansatz für großvolumige Proben. Darüber hinaus bietet das Potenzial für die Massenproduktion dieses mikrofluidischen Geräts Skalierbarkeit und Konsistenz, so dass es möglich ist, die EV-Isolierung in klinische Routinediagnostik und industrielle Prozesse zu integrieren, bei denen hohe Konsistenz und hoher Durchsatz wesentliche Anforderungen sind.

Einleitung

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind aus Zellen gewonnene membrangebundene Partikel, die zwei Haupttypen umfassen: Exosomen (30-200 nm) und Mikrovesikel (200-1000 nm)¹. Exosomen bilden sich durch nach innen gerichtete Knospung der endosomalen Membran innerhalb eines multivesikulären Körpers (MVB) und setzen bei Fusion mit der Plasmamembran^{intraluminale} Vesikel (ILVs) in den extrazellulären Raum frei. Im Gegensatz dazu werden Mikrovesikel durch nach außen gerichtete Knospung und Spaltung der Zellmembran^{erzeugt 2}. EVs spielen eine entscheidende Rolle bei der interzellulären Kommunikation, indem sie Proteine, Nukleinsäuren, Lipide und Metaboliten transportieren und den physiologischen Zustand der Zelle widerspiegeln, einschließlich Wachstum, Angiogenese, Metastasierung, Proliferation und Therapieresistenz³. Infolgedessen haben sie sich als vielversprechende Biomarker und therapeutische Ziele für Krankheiten, einschließlich Krebs, herausgestellt, was ihr Potenzial in der Diagnostik und in Arzneimittelverabreichungssystemen unterstreicht⁴.

Um EVs in der Krankheitsdiagnostik und -therapie voll auszuschöpfen, ist eine effiziente Isolierung aus verschiedenen Bioflüssigkeiten von entscheidender^{Bedeutung 5}. Zu den gängigen Methoden gehören Ultrazentrifugation (UC), Dichtegradientenzentrifugation, Größenausschlusschromatographie (SEC), Filtration und Immunisolierung⁶. UC ist eine weit verbreitete Technik, kann aber Partikel ähnlicher Dichte liefern, die keine EVs sind und EV-Aggregate erzeugen können⁷. SEC hat aufgrund seiner Fähigkeit, Proben mit höherer Reinheit zu liefern, durch den Ausschluss von Partikeln auf der Grundlage der Größe und nicht^{der Dichte 8} an Popularität gewonnen. Eine sorgfältige Auswahl der geeigneten Porengröße für die SEC-Säule und die Optimierung der Chromatographiebedingungen sind jedoch unerlässlich, um die Co-Isolierung unerwünschter Partikel wie Chylomikronen und Lipoproteine niedriger Dichte^{zu minimieren 8}. Trotz ihrer Wirksamkeit sind beide Methoden zeitaufwändig und schwierig zu automatisieren, insbesondere bei großvolumigen Proben wie Zellmedien oder Urin, was ihre Skalierbarkeit für industrielle Anwendungen einschränkt⁹.

In den letzten Jahren hat sich die asymmetrische Feldflussfeldfraktionierung (A4F) zu einer leistungsstarken Trenntechnik für die größen- und auftriebsbasierte Partikeltrennung im Mikro- und Nanometerbereich entwickelt¹⁰. Das Funktionsprinzip von A4F beruht auf einem mikrofluidischen Kanal, der an seiner Basis mit einer porösen Membran ausgestattet ist und eine Kraft erzeugt, die auf die Membran ausgeübt wird, die als Cross-Flow¹⁰ bezeichnet wird. In Kombination mit der systemeigenen Brownschen Bewegung und Poiseuille-Strömung ermöglicht die Querströmung eine effiziente Partikeltrennung aufgrund der unterschiedlichen Partikelposition innerhalb der Strömungsdynamik¹¹. Trotz der Vorteile ist dieses Verfahren auf Probenvolumina im Mikroliterbereich¹² beschränkt und erfordert einen zusätzlichen Fokussierungsschritt, wodurch die Dauer des Prozesses^{verlängert wird 10}.

In den letzten zehn Jahren hat die Mikrofluidik als Werkzeug für eine schnelle, effiziente und klinisch zuverlässige EV-Trennung an Bedeutung gewonnen¹³. Die meisten mikrofluidischen Methoden, die für die EV-Trennung entwickelt wurden, sind jedoch für kleinvolumige, hochkonzentrierte EV-Proben optimiert oder hängen von komplexen Trennverfahren^{ab 14}. Darüber hinaus ist Polydimethylsiloxan (PDMS) im Bereich der Mikrofluidik aufgrund seiner optischen Transparenz, Biokompatibilität und Benutzerfreundlichkeit als goldenes Standardmaterial anerkannt¹⁵. Dennoch kann seine bekannte Neigung, kleine lipophile Moleküle, einschließlich EVs, zu absorbieren, für seine Anwendung im EV-Bereich problematisch sein¹³.

Cyclisches Olefin-Copolymer (COC) ist aufgrund der Biokompatibilität, der geringen Absorption von Molekülen und der hohen chemischen Beständigkeit ein häufig verwendetes Material in der Mikrofluidik¹⁵. Die Herstellung von COC-Geräten erfordert jedoch häufig komplexe Prozesse oder spezielle Geräte¹⁶. Alternativ ist Off-Stöchiometrie-Thiol-En (OSTE) aufgrund der verringerten Absorption kleiner Moleküle, der überlegenen chemischen Stabilität, der einfachen Herstellung und des skalierbaren Herstellungsprozesses eine vielversprechende Alternative zu PDMS^17,18. Aufgrund komplexer Verbindungen zu Schläuchen können Geräte jedoch anfällig für Undichtigkeiten^{sein 19}.

Das Ziel dieser Studie war es, ein mikrofluidisches Gerät zu entwickeln und herzustellen, das OSTE und COC und das gegabelte A4F-Prinzip für die EV-Trennung aus großvolumigen Proben wie Urin oder Zellmedien kombiniert.

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Protokoll

Die Probenentnahme wurde von der lettischen Ethikkommission für Lebens- und Medizinforschung genehmigt (Entscheidung N0-71-35/54)

HINWEIS: Die in dieser Studie verwendeten Materialien sind in der Materialtabelle enthalten.

1. Herstellung dreidimensionaler (3D) gedruckter Formen

1. Entwerfen Sie eine schlangenförmige Doppelnegativform in CAD-Software mit den folgenden Abmessungen für den oberen Kanal: Höhe von 0,5 mm, Breite von 1 mm und Länge von 210 mm. Verwenden Sie für den unteren Kanal das gleiche Design mit einer Breite von 1,5 mm, einer Höhe von 0,6 mm und einer Länge von 210 mm. Abmessungen wie Formbreite, Länge, Höhe und isometrische Darstellung des Designs sind in Abbildung 1 dargestellt. Speichern Sie das Design als .stl-Datei.
2. Bereiten Sie die Datei in der Z-Suite vor. Es muss keine Unterstützung hinzugefügt werden. Drucken Sie die Formen mit einem ultravioletten Flüssigkristalldisplay (UV LCD) 3D-Drucker mit robustem schwarzem Harz.
3. Entfernen Sie nach dem Drucken vorsichtig die Formen von der Druckeroberfläche. Waschen Sie die Formen 20 Minuten lang in Isopropanol (IPA) unter Beschallung.
4. Föhnen Sie die Formen mit N₂.
5. Setzen Sie die Formen 810 s lang mit einem ND33-Filter einer Flut aus und stellen Sie sie dann für 48 h bei 60 °C in einen Ofen.

2. Vorbereitung der PDMS-Formen

1. Wiegen Sie PDMS in einem Verhältnis von 10:1 w/w (für jede Form verwenden Sie 16 g Elastomerbasis und 1,6 g Vernetzungsmittel). Mischen Sie die Komponenten in einem Planetenzentrifugalmischer und mischen Sie 1 Minute lang bei 500 U/min.
2. Gießen Sie das gemischte PDMS in die 3D-gedruckten Formen und entgasen Sie es in einem Vakuumexsikkator bei -800 mbar für 30 min oder bis keine Blasen mehr beobachtet werden.
3. Legen Sie vorsichtig einen 100 μm dicken Polyvinylchlorid-Liner auf das flüssige PDMS.
   HINWEIS: Tragen Sie den Liner langsam von einer Seite zur anderen auf, um Blasenbildung zu vermeiden.
4. Setzen Sie die Form mit PDMS in eine Mold-in-Place-Vorrichtung ein und ziehen Sie die Vorrichtung mit einem Drehmomentschlüssel fest, der auf 0,3 Nm eingestellt ist.
5. Stellen Sie die Vorrichtung für 3 h in einen 60 °C-Ofen, um PDMS auszuhärten.
6. Zerlegen Sie die Vorrichtung mit einem Inbusschlüssel und entfernen Sie die 3D-gedruckte Form aus der Vorrichtung.
7. Entformen Sie PDMS-Formen vorsichtig von den 3D-gedruckten Urformen, indem Sie mit einem Skalpell um die Ränder der Form fahren und dann die Form mit einer Pinzette entfernen.
   Anmerkungen: Zur leichteren Schimmelentfernung kann IPA verwendet werden; die Formen müssen jedoch danach 10 Minuten lang auf 60 °C erhitzt werden, um überschüssiges IPA zu verdampfen.

3. Vorbereitung des OSTE-COC-Oberkanals

1. Gewicht OSTE bei einem Verhältnis von 1,09:1 w/w (für 5 Geräte werden 1,56 g A-Teil und 1,44 g B-Teil benötigt). Mischen Sie die Komponenten in einem Planetenzentrifugalmischer: 5 Minuten bei 750 U/min mischen, dann 5 Minuten bei 750 U/min entgasen.
2. Das gemischte OSTE in ein Zentrifugenröhrchen umfüllen und bei -800 mbar in einem Vakuumexsikkator für 30 min entgasen.
3. Reinigen Sie COC-Objektträger mit 2 x 16 Mini-Luer-Konnektoren durch Beschallung in IPA für 10 min. Trocknen Sie die Objektträger vorsichtig mit N₂.
4. Legen Sie die sauberen COC-Objektträger so in den Plasma-Asher, dass die ebene Oberfläche nach oben zeigt, und behandeln Sie die Oberfläche 2 Minuten lang mit 800 SCCM-Sauerstoffplasma bei 700 W Leistung und 0,133 mbar Druck.
5. Legen Sie den oxidierten COC-Objektträger auf die PDMS-Form für den oberen Kanal, so dass die behandelte Oberfläche mit der strukturierten Oberfläche von PDMS in Kontakt ist. Platzieren Sie die Baugruppe in einer Mold-in-Place-Vorrichtung und ziehen Sie die Vorrichtung mit einem Drehmomentschlüssel fest, der auf 0,3 Nm eingestellt ist.
6. Schließen Sie das Drucksystem bei 6 bar an die Druckluftleitung an. Nehmen Sie das Zentrifugenröhrchen mit entgastem OSTE und montieren Sie es gemäß den Anweisungen des Drucksystems mit einem Polytetrafluorethylen (PTFE)-Schlauch mit 0,8 mm Innendurchmesser (ID).
7. Schließen Sie den PTFE-Schlauch an den Einlass der PDMS-Form an und füllen Sie das Gerät mit einem Druck von 1000 mbar, der von einer piezoelektrischen Pumpe im Drucksystem aufrechterhalten wird. Legen Sie den Jig mit der Glasseite nach oben in den Masken-Aligner und belichten Sie ihn mit einer Dosis von 850 mJ unter Verwendung des ND33-Filters.
8. Nach der Belichtung die Vorrichtung mit einem Inbusschlüssel zerlegen und den COC-Objektträger mit der strukturierten OSTE-Schicht vorsichtig aus der PDMS-Form entfernen.
9. Bringen Sie die strukturierte OSTE mit einer 25 mm x 75 mm großen Membran mit 50 nm Poren und 11,8 % Porendichte in Kontakt, so dass die Kanäle vollständig mit der Membran bedeckt sind.
   HINWEIS: Es ist besonders wichtig, die Membran während des Auftragens so gerade wie möglich zu halten.
10. Legen Sie die Baugruppe mit der Membranseite nach oben auf eine auf 60 °C eingestellte Heizplatte, legen Sie einen sauberen Glasobjektträger auf die Membran und üben Sie einen Druck von 1,6 kPa von oben aus, um eine gleichmäßige Verbindung zu gewährleisten. Erhitzen Sie die Baugruppe über Nacht.
    HINWEIS: Nach diesem Schritt ist es besonders wichtig, die Klebeleistung und die Kanalverformung zu bewerten.

4. Vorbereitung des OSTE-COC-Bodenkanals und der Gerätemontage

1. Mischen Sie OSTE im Verhältnis 1,09:1 w/w (für 5 Geräte werden 1,56 g A-Teil und 1,44 g B-Teil benötigt). Mischen Sie die Komponenten in einem Planetenzentrifugalmischer: 5 Minuten bei 750 U/min mischen, dann 5 Minuten bei 750 U/min entgasen.
2. Das gemischte OSTE in ein Falkenröhrchen umfüllen und bei -800 mbar in einem Vakuumexsikkator für 30 min entgasen.
3. Reinigen Sie die COC-Objektträger durch Ultraschall in IPA für 10 Minuten. Trocknen Sie die Objektträger vorsichtig mit N₂.
4. Legen Sie die sauberen COC-Objektträger in den Plasma-Ascher und behandeln Sie die Oberfläche 2 min lang mit 800 SCCM-Sauerstoffplasma bei 700 W Leistung und 0,133 mbar Druck.
5. Legen Sie den oxidierten COC-Objektträger auf die PDMS-Form für den unteren Kanal, so dass die behandelte Oberfläche mit der strukturierten Oberfläche von PDMS in Kontakt ist. Platzieren Sie die Baugruppe in einer Mold-in-Place-Vorrichtung und ziehen Sie die Vorrichtung mit einem Drehmomentschlüssel fest, der auf 0,3 Nm eingestellt ist.
6. Nehmen Sie das Falcon-Rohr mit entgastem OSTE und montieren Sie es gemäß den Anweisungen des Drucksystems mit PTFE-Schlauch mit 0,8 mm Innendurchmesser.
7. Schließen Sie den PTFE-Schlauch an den Einlass der PDMS-Form an und füllen Sie das Gerät mit 1000 mbar Druck. Legen Sie den Jig mit der Glasseite nach oben in den Masken-Aligner und belichten Sie ihn mit einer Dosis von 1100 mJ unter Verwendung des ND33-Filters.
8. Nach der Belichtung die Vorrichtung mit einem Inbusschlüssel zerlegen und den COC-Objektträger mit der strukturierten OSTE-Schicht vorsichtig aus der PDMS-Form entfernen.
9. Kombinieren Sie die strukturierte OSTE-Schicht mit der oberen Kanalbaugruppe, so dass das Design der oberen und unteren Schicht aufeinander ausgerichtet ist und die untere OSTE-Schicht mit der Membran in Kontakt steht.
10. Setzen Sie das Design in eine Mold-in-Place-Vorrichtung ein und üben Sie mit Bulldog-Clips gleichmäßig einen Druck von 1,6 kPa auf das Gerät aus. Stellen Sie die Vorrichtung über Nacht in einen 60°C-Ofen.
    HINWEIS: Eine ungleichmäßige Platzierung der Clips kann zu einer ungleichmäßigen Verklebung führen.

5. Gerätebewertung

1. Beurteilen Sie die Geräte nach dem Kleben visuell mit einem Mikroskop auf Sehfehler, z. B. Verformung des Kanals oder erfolglose Verklebung.
2. Testen Sie die Geräte ohne Mängel, indem Sie 0,02 μm gefiltertes deionisiertes Wasser mit 30 mbar Druck durch die Kanäle leiten. Achten Sie auf Leckagen im Strömungskanal und Luer-Anschluss sowie auf Wasserdurchfluss.
   HINWEIS: Wenn keine Leckage festgestellt werden kann und der Kanalfluss nicht unterbrochen ist, gelten die Geräte als für weitere Experimente nutzbar.

6. Einrichtung des Geräts

1. Füllen Sie zwei 5-ml-Spritzen mit 2 ml 20 nm gefiltertem 3% H₂O₂ und setzen Sie sie auf eine Spritzenpumpe (verwenden Sie die Bewegungspfeile für den erforderlichen Abstand, setzen Sie die Spritzen ein und fixieren Sie sie mit der oberen Stange).
   VORSICHT! Seien Sie immer vorsichtig beim Umgang mit H₂O₂. Tragen Sie einen Laborkittel, Gummischutzhandschuhe und Augenschutz.
2. Verbinden Sie 14 cm lange PTFE-Schläuche mit einem Innendurchmesser von 800 μm mit den Spritzennadeln mit den Spritzen und mit den Einlässen des Geräts mit Luer-Anschlüssen.
3. Schließen Sie 20 cm lange 200 μm ID-Schläuche aus Polyetheretherketon (PEEK) an die Auslässe an.
4. Schließen Sie das andere Ende des PEEK-Schlauchs an einen Abfallbehälter an. Der Aufbau ist in Abbildung 3 zu sehen.
5. Starten Sie die Spritzenpumpe mit der Durchflussgeschwindigkeit von 500 μl/min für jeden Einlass (auf dem Instrumentenbildschirm: Einstellungen > System Set > Spritze (Hersteller: medizinische Spritze, Spritze: 5 mL) > Zurück-Taste > Parameter (auswählen: Infusion, Wiederholung: 1, Volumen: 1,5 mL, Durchfluss: 500 μl/min) > Zurück-Taste > Zurück-Taste). Sammeln Sie den Durchfluss in einem Abfallbehälter.
6. Füllen Sie zwei neue 5-ml-Spritzen mit 2 ml 20 nm gefiltertem 70%igem Ethanol.
7. Ersetzen Sie die vorherigen Spritzen durch die mit Ethanol gefüllten Spritzen und starten Sie die Spritzenpumpe mit den gleichen Parametern, die in Schritt 6.5 beschrieben sind.
8. Verwenden Sie neue 5-ml-Spritzen und füllen Sie sie mit 5 ml gefilterter phosphatgepufferter 20-nm-Kochsalzlösung (PBS).
9. Ersetzen Sie die vorherigen Spritzen durch die PBS-gefüllten Spritzen und spülen Sie das Gerät mit 4 ml PBS, indem Sie die Schritte 6.1 wiederholen. und 6.5.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie die System-Setup-Parameter auf Volumen: 4 ml ändern (auf dem Gerätebildschirm: Einstellungen > Parameter > (auswählen: Volumen: 4 ml).
10. Trennen Sie den Schlauch vom Gerät und verschließen Sie jeden Einlass und Auslass mit Luer-Steckern.
    Anmerkungen: Lassen Sie PBS im Gerät und vermeiden Sie Lufteinschlüsse, indem Sie vor dem Schließen mit einer Mikropipette zusätzliches PBS an jedem Einlass und Auslass hinzufügen.
11. Lassen Sie das Gerät über Nacht an einem dunklen Ort bei Raumtemperatur (RT).
12. Spülen Sie das PBS-gefüllte Gerät am nächsten Tag mit 4 ml 20-nm-gefiltertem PBS (wie in Schritt 6.8 beschrieben).
13. Sammeln Sie die letzten 1 ml des Durchflusses aus beiden Auslässen in einem 2-ml-Proteinröhrchen mit geringer Bindung und lagern Sie es bei 4 °C als Rohling für vom Gerät eingeführte Partikel.
14. Entfernen Sie die PBS-gefüllten Spritzen und ersetzen Sie sie durch neue, mit Luft gefüllte 5-ml-Spritzen.
15. Spülen Sie das Gerät mit 4 ml Luft, bis die gesamte Flüssigkeit aus dem Gerät und dem Schlauch ausgetreten ist.

7. Gerätetest mit standardisierten Latexperlen

1. Bereiten Sie eine standardisierte Bead-Probe mit 1,0 μm Polystyrol und 0,1 μm Carboxylatkügelchen vor. In ein 15-ml-Röhrchen geben Sie 500 μl 1,0 μm Polystyrol-Bead-Standards, 1 μl 0,1 μm Carboxylat-Bead-Standards und 9499 μl 20 nm gefiltertes PBS (die Endkonzentration von 1,0 und 0,1 μm Bead-Mischung beträgt 5 × 108 Beads/ml und 3,6 × 1010 Beads/ml respektvoll).
2. Die Perlenprobe 30 s lang vorziehen und bei Nichtgebrauch bei +4 °C lagern.
3. Füllen Sie eine neue 5-ml-Spritze mit 1,5 mL der standardisierten Perlenmischung und eine weitere mit 1,5 mL 20 nm gefiltertem PBS.
4. Entfernen Sie die zuvor angebrachten Spritzen und befestigen Sie die Perlenmischungsspritze am ersten Einlassschlauch und die andere am zweiten Einlass.
5. Entfernen Sie den Abfallbehälter und bereiten Sie mindestens fünf 0,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen für jeden Auslassschlauch vor.
6. Ändern Sie die Startparameter des Spritzenpumpensystems auf Volumen: 1 ml; Durchfluss: 250 μl/min.
   HINWEIS: Je nach Bedarf des Benutzers können verschiedene Durchflussgeschwindigkeiten wie 250 μl/min, 200 μl/min, 150 μl/min, 100 μl/min und 50 μl/min eingestellt werden. Eine Vorstudie zur Auswahl der günstigsten Geschwindigkeit für das gewünschte Ergebnis wird empfohlen.
7. Starten Sie die Spritzenpumpe und sammeln Sie den Abfluss - 5 bis 6 Tröpfchen in jedem Mikrozentrifugenröhrchen.
   HINWEIS: Wenn dasselbe Gerät mehrmals verwendet wird, spülen Sie das Gerät wie in Schritt 6.8 beschrieben und wechseln Sie alle Anschlüsse, Stecker und Nadeln. Waschen Sie die gebrauchten Stecker, Stecker und Nadeln, indem Sie sie mindestens 30 Minuten lang in 20 nm gefiltertem 70%igem Ethanol belassen. Bringen Sie dann alle Teile in ein Röhrchen mit 20 nm gefiltertem deionisiertem Wasser, schütteln Sie das Röhrchen gründlich und geben Sie sie in eine Petrischale mit 20 ml 20 nm gefiltertem deionisiertem Wasser. Lassen Sie die Petrischale mindestens 30 Minuten bei 100 U/min auf dem Shaker und lassen Sie die Dinge dann in einer trockenen Petrischale trocknen (mindestens 12 Stunden), bevor Sie sie wiederverwenden.

8. Geräteprüfung mit Urinproben

1. Bereiten Sie das Gerät wie in den Schritten 6.1-6.15 beschrieben vor.
2. Sammeln Sie 100 ml Morgenurin pro Spender in sterilen Urinbehältern und liefern Sie ihn innerhalb von 2 Stunden nach der Entnahme zur Verarbeitung an das Labor.
3. Jede Urinprobe in zwei 50-ml-Röhrchen trennen und bei 2'000 x g für 15 min bei RT zentrifugieren.
4. Sammeln Sie den Überstand und entsorgen Sie das Pellet.
5. Zentrifugieren Sie den Überstand bei 10'000 x g für 30 Minuten bei RT, um grosse Partikel und Zelltrümmer zu entfernen.
6. Sammeln Sie den Überstand und entsorgen Sie das Pellet.
7. Waschen Sie das Gerät wie in 6.6 beschrieben.
8. Tauschen Sie die 5-ml-Spritzen gegen eine 20-ml-Spritze aus, die mit der vorbereiteten Urinprobe für den Probeneinlass gefüllt ist, und eine weitere 20-ml-Spritze, die mit 20 ml 20-nm-gefiltertem DEPC-PBS für den Puffereinlass gefüllt ist. Ändern Sie die Einstellungen der Spritzenpumpe auf BDPlastipak; Spritze: cc; Volumen: 20 ml; Durchfluss: 250 μl/min (optimale Durchflussrate), ähnlich wie in Schritt 6.2 beschrieben. Starten Sie die Spritzenpumpe und sammeln Sie den Durchfluss von jedem Auslass in separaten 50-ml-Röhrchen.
9. Jeder Durchfluss wird separat mit 100.000 Molekulargewichts-Cutoff-Konzentrationsröhrchen auf jeweils 100 μl bei 3.000 x g bei 4 °C konzentriert.
10. Übertragen Sie die Konzentrate auf 0,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
11. Die konzentrierten Proben 30 Sekunden lang vortexen und dann 10 Sekunden lang drehen.
12. Aliquotieren Sie die Proben, indem Sie 25 μl Probe pro Röhrchen übertragen, markieren und bei -80 °C zur Langzeitlagerung einfrieren.

9. Geräteprüfung mit konditionierten Medien

1. Bereiten Sie das Gerät wie in den Schritten 6.1 bis 6.15 beschrieben vor.
2. Zellen in einer 5 % CO₂ -befeuchteten Umgebung bei 37 °C kultivieren, bis die Gesamtzahl 100 Millionen erreicht, gemäß Bajo-Santos et ^al.20 Passage der Zellen in einen einzelnen T175-Suspensionskolben in 100 ml serumfreiem Medium, ergänzt mit 2 % B-27-Serumersatzzusatz, und Kultur in einer 5 % CO₂ -befeuchteten Umgebung bei 37 °C für weitere 48 Stunden.
3. Sammeln Sie die Zellsuspension und zentrifugieren Sie sie bei 300 x g für 5 min bei RT, um Zellen loszuwerden.
4. Sammeln und zentrifugieren Sie den Überstand erneut bei 3.000 x g für 30 min bei +4 °C, um große Partikel und Zelltrümmer zu entfernen.
5. Der Überstand wird aufgefangen und bei +4 °C gelagert, bis die Trennung erfolgen kann, jedoch nicht länger als 3 h.
6. Tauschen Sie die 5-ml-Spritzen gegen 20-ml-Spritzen aus, die mit dem vorbereiteten konditionierten Medium für den Probeneinlass gefüllt sind und mit 20 ml 20-nm-gefiltertem PBS für den Puffereinlass gefüllt sind.
7. Stellen Sie die Einstellungen in der Pumpstation wie in Schritt 7.8 beschrieben ein.
8. Starten Sie die Spritzenpumpe und sammeln Sie den Durchfluss von jedem Auslass in einem separaten 50-ml-Röhrchen.
9. Konzentrieren Sie jeden Durchfluss separat mit 100.000 Molekulargewichts-Cutoff-Konzentrationsröhrchen auf jeweils 150 μl bei 3.000 x g bei +4 °C.
10. Übertragen Sie die Konzentrate auf 0,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
11. Vortex-konzentrierte Proben für 30 s.
12. Schleudern Sie konzentrierte Proben für 10 s.
13. Aliquotieren Sie die Proben, indem Sie 25 μl Probe pro Röhrchen übertragen, markieren und für die Langzeitlagerung bei -80 °C einfrieren.

10. Isolierung von EVs durch Ultrazentrifugation

1. Zentrifugieren Sie 20 ml Urin oder konditionierte Zellmedien bei 100.000 x g für 70 min bei +4 °C mit einer Zentrifuge mit einem Festwinkelrotor.
2. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 20 ml 20 nm gefiltertem PBS.
3. Erneut zentrifugieren, wie in 10.1 erläutert.
4. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 12 ml 20 nm gefiltertem PBS.
5. Zentrifugieren Sie bei 100.000 x g für 70 min bei +4 °C mit einem Schwenkrotor.
6. Entsorgen Sie den Überstand.
   HINWEIS: Seien Sie vorsichtig, wenn Sie den Überstand dieses Mal entsorgen. Es wird empfohlen, dies mit einer Pipette zu tun.
7. Resuspendieren Sie das Pellet in 100 μl 20 nm gefiltertem PBS.
8. Aliquotieren Sie die Probe und fahren Sie mit Satz 12 zur EV-Charakterisierung fort. Andernfalls bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C lagern.

11. Isolierung von EVs mittels Größenausschlusschromatographie (SEC)

1. Konzentrieren Sie 20 ml Urin oder konditionierte Zellmedien auf 500 μl unter Verwendung von 100 kDa Molekulargewichts-Cut-off-Zentrifugalfiltereinheiten (MWCO) bei 3.000 x g bei +4 °C für 15 Minuten.
2. Übertragen Sie das Konzentrat auf die SEC-Säule (35 nm Lastbereich).
3. Gießen Sie das 20 nm gefilterte PBS auf die Säule und sammeln Sie 15 Fraktionen von 0,5 ml.
4. Analysieren Sie Fraktionen mit einem dynamischen Lichtstreusystem (DLS) gemäß den Anweisungen des Herstellers.
5. Fassen Sie die ausgewählten Fraktionen zusammen. Wählen Sie Fraktionen mit einem Dämpfungsglied von weniger als 11 und mindestens 30 % der Gesamtpartikel, die größer als 40 nm sind.
6. Konzentrieren Sie ausgewählte Fraktionen auf 100 μl mit 3 kDa Molekulargewichts-Cut-off-Zentrifugalfiltereinheiten (MWCO) bei 14.000 x g bei +4 °C für 15 Minuten.
7. Aliquotieren Sie die Probe und fahren Sie mit Abschnitt 12 zur EV-Charakterisierung fort. Andernfalls bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C lagern.

12. EV-Charakterisierung

1. Die zu charakterisierende Probe wird aus dem Gefrierschrank entnommen und langsam (auf einem Eisblock oder bei +4 °C) aufgetaut.
2. Führen Sie eine Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) durch, um die Partikelgrößenverteilung und -menge¹³ zu bestimmen. Führen Sie einen hochaffinen T-Zell-Membranprotein 4 (TIM-4) Double Sandwich Enzyme-linked Immunosorbent Assay (dsELISA)¹⁴ durch, um das Vorhandensein von EV in den Proben zu bestätigen.

13. NTA

1. Die aufgetaute EV-Probe 30 s lang vortexen und 10 s drehen, dann 1 μl auf 999 μl 20 nm gefiltertes PBS in ein 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen übertragen, um es 1000-fach zu verdünnen. Bewahren Sie 1 ml zusätzliches PBS zur Verdünnung auf, um sicherzustellen, dass es keine Partikel enthält. Alles bis zur Messung bei +4 °C lagern.
   HINWEIS: Filtern Sie PBS vor der Verwendung durch einen 0,02-nm-Filter.
2. Wirbeln Sie die EV-Probe oder den Rohling 30 s lang vor und führen Sie sie mit einer Spritze in das Modul ein. Füllen Sie das Modul mit ca. 0,7 ml Probe und legen Sie es in das Gerät.
3. Messen Sie die Probe mit dem Nanopartikelanalysator gemäß den Anweisungen des Herstellers.

14. dsELISA für EV-Marker

1. Bereiten Sie eine Lösung von 1 μg/ml TIM4-Fc-Protein vor. Beschichten Sie die Wells einer 96-Well-ELISA-Platte, indem Sie 100 μl Lösung in jedes erforderliche Well geben und über Nacht bei +4 °C und Schütteln bei 200 U/min inkubieren.
2. Bereiten Sie am nächsten Tag eine Waschlösung vor (1x TBS + 0,05% Tween20 + 2 mM CaCl₂).
3. Entsorgen Sie die gesamte Flüssigkeit in jeder Vertiefung. Waschen Sie jede Vertiefung, indem Sie 200 μl Waschlösung hinzufügen, 5 Minuten lang bei RT bei 200 U/min schütteln und verwerfen. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.
4. Bereiten Sie eine Blockierungslösung vor (1x TBS + 0,05% Tween20 + 1% Rinderserumalbumin). Geben Sie 200 μl Blockierungslösung in jede Vertiefung und inkubieren Sie 1 Stunde lang bei RT unter Schütteln bei 200 U/min.
5. Waschen Sie jede gut wie in Schritt 14.3 beschrieben.
6. Bereiten Sie 220 μl jeder Probenverdünnung in Waschpuffer vor (optimale EV-Konzentration beträgt 2,7 × 10⁵ EVs/μl). Fügen Sie 100 μl der verdünnten Probe pro Vertiefung hinzu und führen Sie zwei Wiederholungen durch. 90 min bei RT unter Schütteln bei 200 U/min inkubieren.
7. Waschen Sie jede gut wie in Schritt 14.3 beschrieben.
8. Geben Sie 100 μl entsprechende Antikörper in jede Vertiefung. Verwenden Sie geeignete EV-Marker zur Bestätigung von EVs und Verunreinigungen⁴. 2 Stunden bei RT unter Schütteln bei 200 U/min inkubieren. HINWEIS: Wenn Sekundärantikörper verwendet werden, wiederholen Sie die Schritte 14.7-14.8. Reduzieren Sie jedoch die Inkubationszeit von Sekundärantikörpern auf 1 h.
9. Waschen Sie jede gut wie in Schritt 14.3 beschrieben.
10. Geben Sie 100 μl Meerrettichperoxidase-Substrat in jede Vertiefung, mischen Sie die Platte 1 Minute lang und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei RT.
11. Geben Sie 1 M H₂SO₄ in jede Vertiefung, um die Reaktion zu stoppen.
12. Messen Sie mit einem Mikroplatten-Reader die Extinktion bei 450 nm.

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Ergebnisse

Wir haben ein mikrofluidisches Gerät mit einer 3D-gedruckten Doppelnegativform (Abbildung 1) mittels Softlithographie (Abbildung 2A) für die EV-Trennung mit hohem Durchsatz basierend auf dem gegabelten A4F-Prinzip (Abbildung 2B,C) hergestellt. Der Aufbau erfordert eine Pumpe und eine Durchflussstation, wie in Abbildung 3 zu sehen ist, für die automatisierte Isolierung von Elektrofahr...

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Diskussion

Das vorgestellte mikrofluidische Gerät bietet eine vielversprechende Methode zur Isolierung und Extraktion von EVs aus biologischen Flüssigkeiten, die einige der kritischen Einschränkungen bestehender Goldstandardmethoden wie UC und SEC¹² behebt. UC und SEC sind dafür bekannt, arbeitsintensiv und zeitaufwändig zu sein und unter geringer Ausbeute zu leiden, wodurch sie für Anwendungen mit hohem Durchsatz, bei denen große Mengen an Elektrofahrzeugen benötigt werden, weniger geeignet sind

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 µm carboxylate FluoSpheres	Invitrogen	#F8803	Stock concentration: 3.6 x 1013 beads/mL (LOT dependent)
0.5 mL microcentrifuge tubes	Starstedt	72.704
1 mL Luer cone syringe single use without needle	RAYS	TUB1ML
1.0 µm polystyrene FluoSpheres	Invitrogen	#F13083	Stock concentration: 1 x 1010 beads/mL (LOT dependent)
10 mL Serological pipettes	Sarstedt	86.1254.001
15 mL (100k) Amicon Ultra centrifugal filters	Merck Millipore	UFC910024
2.0 mL Protein LoBind tubes	Eppendorf	30108132
20 mL syringes	BD PlastikPak	10569215
250 µm ID polyether ether ketone tubing	Darwin Microfluidics	CIL-1581
3 kDa MWCO centrifugal filter units	Merck Millipore,	UFC200324
5 mL Medical Syringe without Needle	Anhui Hongyu Wuzhou Medical	159646
50 mL conical tubes	Sarstedt	62.547.254
70 Ti fixed angle ultracentrifuge rotor	Beckman Coulter	337922
800 µm ID polytetrafluoroethylene tubing	Darwin Microfluidics	LVF-KTU-15
96 well microplate, f-bottom, med. binding	Greiner Bio-One	655001	ELISA plate
B-27 Supplement (50x), serum free	Thermo Fisher Scientific	17504044
Bovine serum albumin	SigmaAldrich	A7906-100G
COC Topas microscopy slide platform	Microfluidic Chipshop	10000002
COC Topas microscopy slide platform 2 x 16 Mini Luer	Microfluidic Chipshop	10000387
Elveflow OB1 pressure controller	Elvesys Group
Luer connectors	Darwin Microfluidics	CS-10000095
Mask aligner Suss MA/BA6	SUSS MicroTec Group
Mixer Thinky ARE-250	Thinky Corporation
NanoSight NS300	Malvern Panalytical	NS300	nanoparticle analyzer
Optical microscope Nikon Eclipse LV150N	Nikon Metrology NV
OSTE 322 Crystal Clear	Mercene Labs
PBS TABLETS.Ca/Mg free. Fisher Bioreagents. 100 g	Fisher Scientific	BP2944-100
PC membrane (50 nm pore diameter, 11.8% density)	it4ip S.A., Louvain-La Neuve, Belgium
Petri dishes, sterile	Sarstedt	82.1472.001
Plasma Asher GIGAbatch 360 M	PVA TePla America, LLC
qEVoriginal/35 nm column	Izon	SP5	SEC column
QSIL 216 Silicone Elastomer Kit	PP&S
Resin Tough Black	Zortrax
SW40 Ti swing ultracentrifuge rotor	Beckman Coulter	331301
Syringe pump	DK Infusetek	ISPLab002
T175 suspension flask	Sarstedt	83.3912.502
TIM4-Fc protein	Adipogen LifeSciences	AG-40B-0180B-3010
TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine)	SigmaAldrich	T0440-100ML	Horseradish peroxidase substrate
Tween20	SigmaAldrich	P1379-100ML
Ultracentrifuge Optima L100XP	Beckman Coulter
Ultrasonic cleaning unit P 60 H	Elma Schmidbauer GmbH
Universal Microplate Spectrophotometer	Bio-Tek instruments	71777-1
Urine collection cup, 150mL, sterile	APTACA	2120_SG
Whatman Anotop 25 Syringe Filter	SigmaAldrich	68092002
Zetasizer Nano ZS	Malvern Panalytical		dynamic light scattering (DLS) system
Zortrax Inkspire	Zortrax