إنشاء وتوصيف عضويات المعدة المشتقة من المريض من خزعات جسم المعدة الحميد والظهارة الغارية

Summary

تجد العضويات المشتقة من مرضى المعدة استخداما متزايدا في البحث ، ومع ذلك لا توجد بروتوكولات رسمية لتوليد عضويات المعدة البشرية من هضم الخلية الواحدة بكثافة بذر موحدة. يقدم هذا البروتوكول طريقة مفصلة لإنشاء عضويات معدية موثوقة من أنسجة الخزعة التي تم الحصول عليها أثناء التنظير العلوي.

Abstract

تقدم المواد العضوية المشتقة من مريض المعدة (PDOs) أداة فريدة لدراسة بيولوجيا المعدة وعلم الأمراض. وبالتالي ، تجد PDOs هذه استخداما متزايدا في مجموعة واسعة من التطبيقات البحثية. ومع ذلك ، يوجد نقص في الأساليب المنشورة لإنتاج PDOs المعدة من هضم خلية واحدة مع الحفاظ على كثافة أولية موحدة لبذر الخلية. في هذا البروتوكول ، ينصب التركيز على بدء عضويات المعدة من الخلايا المفردة المعزولة وتوفير طريقة لتمرير الكائنات العضوية من خلال التجزئة. الأهم من ذلك ، يوضح البروتوكول أن النهج الموحد لكثافة بذر الخلايا الأولية ينتج باستمرار عضويات معدية من أنسجة الخزعة الحميدة ويسمح بالقياس الكمي الموحد لنمو الأعضاء. أخيرا ، تدعم الأدلة الملاحظة الجديدة القائلة بأن PDOs في المعدة تظهر معدلات متفاوتة من التكوين والنمو بناء على ما إذا كانت الكائنات العضوية تنشأ من خزعات الجسم أو المناطق الغارية في المعدة. على وجه التحديد ، تم الكشف عن أن استخدام أنسجة الخزعة الغارية لبدء العضوية يؤدي إلى تكوين عدد أكبر من الكائنات العضوية ونمو عضوي أسرع على مدى فترة 20 يوما مقارنة بالمواد العضوية الناتجة عن خزعات جسم المعدة. يوفر البروتوكول الموصوف هنا للمحققين طريقة قابلة للتكرار وفي الوقت المناسب لتوليد PDOs المعدة والعمل معها بنجاح.

Introduction

Organoids هي هياكل خلوية مصغرة ثلاثية الأبعاد (3D) تشبه بنية ووظائف الأعضاء التي اشتقت منها ^1,2. يتم إنشاء هذه النماذج المزروعة في المختبر عن طريق زراعة الخلايا الجذعية أو الخلايا الخاصة بالأنسجة في بيئة خاضعة للرقابة تسمح لهذه الخلايا بالتنظيم الذاتي والتمايز إلى أنواع مختلفة من الخلايا^1،2،3. واحدة من المزايا الرئيسية للعضويات هي قدرتها على تلخيص البيولوجيا البشرية بشكل أوثق من ثقافات الخلايا التقليدية ثنائية الأبعاد (2D)^1،2،3

Protocol

تم جمع جميع الأنسجة البشرية المستخدمة في هذا البروتوكول من الأفراد الذين قدموا موافقة مستنيرة لجمع الأنسجة من خلال دراسة جمع أنسجة المعدة المعتمدة من قبل مجلس المراجعة المؤسسية بجامعة بنسلفانيا (IRB # 842961). طلب من المشاركين في هذه الدراسة الخضوع لتنظير علوي كجزء من رعايتهم الروتينية ، وأن يكونوا على الأقل 18 عاما ، وأن يكونوا قادرين على تقديم موافقة مستنيرة. التزمت جميع الأبحاث التي أجريت بالمبادئ التوجيهية التي وضعتها جامعة بنسلفانيا.

1. التحضير التجريبي

1. قم بإعداد وسائط L-WRN المشروطة كما هو موضح سابقا¹⁶. على الرغم من أنها ليست إلزامية ، يمكن التحقق من تركيزات Wnt-3A و R-spondin و noggi....

النتائج

النتائج التمثيلية اللاحقة مستمدة من الخزعات المأخوذة من ظهارة حميدة لكل من جسم المعدة ومناطق غار المعدة في معدة خمسة مرضى مختلفين يخضعون للتنظير العلوي. تم طلاء اثنين إلى أربعة "قباب" / آبار وتحليلها لكل مريض لكل من خزعات جسم المعدة والغار. تم إنشاء المواد العضوية بنجاح من جسم المعدة وأنسج?.......

Discussion

هنا ، يتم تحديد بروتوكول مفصل لتوليد عضويات المعدة البشرية بشكل موثوق من خلايا مفردة معزولة من خزعات ظهارة حميدة من جسم المعدة والغار. تدور الخطوات الحاسمة في البروتوكول حول التوقيت وكذلك التعامل مع مصفوفة الغشاء القاعدي. للحفاظ على الجدوى ، من الضروري بدء البروتوكول في أقرب وقت ممكن بعد .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
A83-01	R&D Systems	2939
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634-010
Amphotericin B	Invitrogen	15290018
B27	Invitrogen	17504044
BZ-X710	Keyence	n/a
cellSens	Olympus	n/a
Collagenase III	Worthington	LS004182
Dispase II	Sigma	D4693-1G
Dithiothreitol (DTT)	EMSCO/Fisher	BP1725
DPBS	Gibco	14200-075
Fungin	InvivoGen	NC9326704
Gastrin I	Sigma Aldrich	G9145
Gentamicin	Invitrogen	1570060
Glutamax	Gibco	35050-061
hEGF	Peprotech	AF-100-15
HEPES	Invitrogen	15630080
hFGF-10	Peprotech	100-26
L-WRN Cell Line	ATCC	CRL-3276
Matrigel	Corning	47743-715
Metronidazole	MP Biomedicals	155710
N2 Supplement	Invitrogen	17502048
Noggin ELISA Kit	Novus Biologicals	NBP2-80296
Pen Strep	Gibco	15140-122
RPMI 1640	Gibco	11875-085
R-Spondin ELISA Kit	R&D Systems	DY4120-05
Wnt-3a ELISA Kit	R&D Systems	DY1324B-05
Y-27632	Sigma Aldrich	Y0503