انسداد LAD الذي يتم تشغيله عن بعد باستخدام قسطرة بالون في الفئران التي تتنفس تلقائيا

Summary

تقدم هذه المقالة تقنية فريدة من نوعها للصدر المغلق لإحداث إصابة نقص تروية عضلة القلب (IRI) في الفئران. تسمح الطريقة المقدمة للفئران بالتنفس تلقائيا أثناء تحفيز نقص تروية عضلة القلب عن بعد. يوفر هذا الوصول إلى لدراسة العمليات الديناميكية لنقص التروية وإعادة التروية في الموقع وفي الوقت الفعلي عبر التصوير غير الباضع.

Abstract

احتشاء عضلة القلب الحاد (AMI) هو حالة قلبية وعائية منتشرة وعالية الوفيات. على الرغم من التقدم في استراتيجيات إعادة التوعي ل AMI ، فإنه يؤدي في كثير من الأحيان إلى إصابة نقص تروية عضلة القلب (IRI) ، مما يؤدي إلى تضخيم تلف القلب. تعمل نماذج الفئران كأدوات حيوية للتحقيق في كل من الإصابات الحادة وإعادة تشكيل عضلة القلب المزمنة في الجسم الحي. تقدم هذه الدراسة تقنية فريدة من نوعها لإغلاق الصدر لتحفيز IRI عضلة القلب عن بعد في الفئران ، مما يتيح التحقيق في المرحلة المبكرة جدا من الانسداد وإعادة التروية باستخدام التصوير في الجسم الحي مثل التصوير بالرنين المغناطيسي أو التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني. يستخدم البروتوكول طريقة انسداد عن بعد ، مما يسمح بالتحكم الدقيق في بدء نقص التروية بعد إغلاق الصدر. يقلل من الصدمات الجراحية ، ويتيح التنفس التلقائي ، ويعزز الاتساق التجريبي. ما يميز هذه التقنية هو قدرتها على التصوير غير الباضع في وقت واحد ، بما في ذلك الموجات فوق الصوتية والتصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) ، أثناء أحداث الانسداد وإعادة التروية. إنه يوفر فرصة فريدة لتحليل استجابات الأنسجة في الوقت الفعلي تقريبا ، مما يوفر رؤى مهمة للعمليات أثناء نقص التروية وإعادة التروية. تم إجراء اختبارات منهجية مكثفة لهذا النهج المبتكر ، وقياس علامات نخر القلب للاحتشاء ، وتقييم المنطقة المعرضة للخطر باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي المعزز بالتباين ، واحتشاء تلطيخ في مرحلة نضج الندبة. من خلال هذه التحقيقات ، تم التركيز على قيمة الأداة المقترحة في تطوير مناهج البحث لإصابة نقص تروية عضلة القلب وتسريع تطوير التدخلات المستهدفة. يتم عرض النتائج الأولية التي توضح جدوى الجمع بين البروتوكول التجريبي المبتكر المقترح وتقنيات التصوير غير الباضعة هنا. تسلط هذه النتائج الأولية الضوء على فائدة استخدام مهد المصمم لهذا الغرض للحث على نقص تروية عضلة القلب عن بعد أثناء إجراء فحوصات التصوير بالرنين المغناطيسي في نفس الوقت.

Introduction

يرتبط احتشاء عضلة القلب الحاد (AMI) ، وهو حالة قلبية وعائية عالمية سائدة ، بارتفاع معدلات الوفيات والمراضة¹. على الرغم من التطورات التكنولوجية التي مكنت استراتيجيات إعادة التوعي المبكرة والفعالة لمرضى AMI ، لا يزال المرضى يعانون من إصابة نقص تروية عضلة القلب (IRI) بعد هذه التدخلات². لذلك ، فإن فهم الآليات الأساسية وصياغة النهج للتخفيف من IRI أمر بالغ الأهمية. يمثل IRI حالة فيزيولوجية مرضية معقدة تنطوي على العديد من العمليات البيولوجية المعقدة. وتشمل هذه موت الخلايا المنظم ، واستجابات الإجهاد التأكسدي ، والالتهابات ، والتئام الجروح ، والتليف ، وإعادة تشكيل البطين. كانت النماذج الحيوانية ، مثل الفئران ، ذات أهمية كبيرة لأبحاث IRI ويتم استخدامها على نطاق واسع بسبب فعاليتها من حيث التكلفة ، والتكاثر السريع ، وثروة المعلومات الميكانيكية من النماذج المعدلة وراثيا³.

يقدم هذا البروتوكول تقنية مبتكرة للحث عن بعد IRI في الفئران التي تتنفس تلقائيا بصدر مغلق ، تحاكي عن كثب علم الأمراض البشري. تم تحقيق الانسداد عن بعد من خلال استخدام قسطرة بالون موضوعة على مسافة من عضلة القلب لسد الشريان النازل الأمامي الأيسر (LAD). يوفر هذا النهج وصولا مستمرا إلى القلب النابض في لحظات الانسداد وإعادة التروية بالضبط ، مما يسهل طرق التصوير المتزامن ، بما في ذلك التصوير بالموجات فوق الصوتية أو التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI). يمكن أن توفر هذه الطرق غير الباضعة رؤى مهمة حول استجابات الأنسجة قبل وأثناء وبعد أحداث الانسداد وإعادة التروية.

توجد تقنيات جراحية مختلفة للحث على IRI في نماذج الفئران. تؤدي الصدمة الجراحية الناجمة عن بضع الصدر في نماذج الصدر المفتوح للربط التاجي إلى استجابة مناعية تؤثر على آليات متنوعة مرتبطة بنقص التروية وإعادة التروية. تفعيل الجهاز المناعي الفطري يحمل القدرة على التأثير على مدى احتشاء عضلة القلب⁴. توفر التقنية المعدلة المقترحة نهجا محتملا لاستكشاف ما قبل وبعد تكييف عضلة القلب وربما تقليل تأثير الاستجابة المناعية الفطرية للصدمة الجراحية في دراسات IRI للفئران عن طريق تقليل الإطار الزمني المفتوح للصدر إلى 5 دقائق كحد أقصى. علاوة على ذلك ، قد تساهم التقنية المطورة حديثا أيضا في تقليل العواقب المؤيدة للالتهابات الناتجة عن إصابة الرئة التي يسببها جهاز التنفس^{الصناعي 5}. ومع ذلك ، فإن الآثار المشتركة لهذه الطريقة الجديدة للصدر المغلق تتطلب مزيدا من التحقيق المتعمق.

تم إجراء التحقق الشامل من التقنية المقترحة من خلال مقارنتها بالطريقة التقليدية ، والتي تتضمن تعريض LAD من خلال تشريح الصدر الجراحي والانسداد الناجم عن الأربطة لمدة 30 دقيقة. تمت مقارنة النتائج من كلتا التقنيتين ، والتي تضمنت قياسات التروبونين التي تعكس حجم احتشاء القلب ، وتقييمات المنطقة المعرضة للخطر باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي مع تعزيز تباين الجادولينيوم ، وتلطيخ كلوريد ثلاثي فينيل رباعي التنسج (TTC) ، وتحديد أحجام الندبات النهائية عبر تلطيخ Sirius Red (SR). توضح النتيجة متانة وفعالية النهج المقترح لدراسة إصابة نقص التروية في نماذج الفئران.

Protocol

تمت الموافقة على هذا البروتوكول الحيواني من قبل ويتوافق مع المبادئ التوجيهية واللوائح التي وضعتها اللجنة الأخلاقية للتجارب على (ECD) في الجامعة الكاثوليكية في لوفين. تتبع جميع السياسات التي طورتها تنمية الطفولة المبكرة المحلية لوائح الاتحاد الأوروبي المتعلقة برعاية المختبر كما هو معلن في التوجيه 2010/63 / EU. تم إجراء جميع الاختبارات الموضحة أدناه على ذكور الفئران C57BL / 6 البالغة من العمر 8-12 أسبوعا (وزن الجسم = 20-23 جم). تمثل التجارب الحادة التي تم التضحية بها على الفور بعد الجراحة. مثلت تجارب البقاء على قيد الحياة متابعة لمدة أربعة أسابيع ، بما في ذلك قياس التروبونين والتصوير بالرنين المغناطيسي وتلطيخ SR.

1. التخدير والتنبيب الرغامي

1. تطبيق دواء ما قبل التخدير باستخدام مزيج من الكيتامين (7.5 ملغ/كغ; نيماتيك 100 ملغم/مل)، زيلازين (1 ملغم/كغ; رومبون، 20 ملغ/مل)، والأسيبرومازين (0.1 ملغ/كغ; بلاسيفيت ، 10 مجم / مل) (KXA) (انظر جدول المواد) مع 0.9٪ محلول ملحي مخفف داخل الصفاق. هذا يسمح بتنبيب أكثر سلاسة وأقل توغلا.
2. ضع الفأر في غرفة الحث (انظر جدول المواد) واستحضر التخدير باستخدام 2.5٪ إيزوفلوران في الأكسجين النقي بمعدل تدفق 1 لتر / دقيقة حتى فقدان التصحيح ومنعكس قرصة إصبع القدم.
3. نقل إلى وسادة ساخنة (±38 درجة مئوية) ووضعها مستلق مع الرأس نحو الجراح. إصلاح الذيل والكفوف الأمامية مع الشريط على وسادة. تأكد من أن الأطراف الأمامية ليست ممتدة بشكل مفرط ، لأن هذا يمكن أن يضر بالتنفس.
4. ضع خيطا حريريا 2-0 (انظر جدول المواد) حول القواطع العلوية وقم بلصق الخيط على حدود الوسادة لسحب الماوس مشدودا. إذا لزم الأمر ، قم بتوصيل حامل إبرة للحفاظ على التوتر على الخيط. الحفاظ على تخدير باستخدام 2٪ إيزوفلوران في أكسجين 100٪ مع تدفق 1 لتر / دقيقة باستخدام مخروط الأنف.
5. ضع مصدر ضوء منبر القص فقط ، وأزل مخروط الأنف ، وضع إمداد الأيزوفلوران على جهاز التنفس الصناعي. تنبيب الفأر باستخدام ملقط عن طريق رفع اللسان لأعلى وعقد منظار الحنجرة عصامي لرفع الجزء القاعدي من اللسان أكثر وتصور الحبال الصوتية.
6. ضع أنبوب القصبة الهوائية المصنوع ذاتيا باستخدام قسطرة 18 جم على إبرة باهتة بين الأحبال الصوتية. حرك القسطرة لأعلى ، واستخرج الإبرة الباهتة ، وقم بتوصيل الأنبوب بجهاز التنفس الصناعي للفأر (انظر جدول المواد).
7. استخدم موصلا معدلا على شكل حرف Y (انظر جدول المواد) لتوصيل أنبوب التنبيب بجهاز التنفس الصناعي. يمكن تأكيد الموضع الصحيح لأنبوب القصبة الهوائية من خلال الحكم على توسع الصدر المتماثل.
8. اضبط حجم المد والجزر (مل) عند وزن الجسم (BW) (g) x 7 ومعدل التهوية عند 53.5 × (BW (g) ^-0.26) ضربات في الدقيقة ، واضبطه على وزن جسم ماوس معين إذا لزم الأمر⁶ (على سبيل المثال ، بالنسبة للفأر 25 جم ، يكون حجم المد والجزر 175 مل بمعدل 140 ضربة في الدقيقة).
9. قلل الأيزوفلوران إلى 1٪ في الأكسجين بنسبة 100٪ ، حيث سيبقى مخدرا بسبب التخدير. ومع ذلك ، قم بتقييم عمق التخدير بانتظام عن طريق إجراء قرصة إصبع القدم. تكييف تركيز إيزوفلوران على أساس عمق التخدير.
10. ضع قطرة من مرهم العيون لمنع الجفاف أثناء التخدير.

2. تثبيت أداة IRI

ملاحظة: قم بإزالة كل الشريط ووضع على اللوحة الأساسية لأداة IRI المصممة لهذا الغرض. وترد تفاصيل عن خصائص أداة IRI في الملف التكميلي 1.

1. ثبت اللوحة الأساسية لأداة IRI عن بعد المصممة لهذا الغرض في وضع جانبي أمام الجراح. إصلاح الذيل والكفوف باستخدام الشريط. ثبت الرأس باستخدام خياطة الحرير 2-0 حول القواطع العلوية لمنع الحركة العرضية (الشكل 1).
2. أدخل المسبار الحراري المستقيمي (انظر جدول المواد) لمراقبة درجة حرارة الجسم واستخدم مصباح تسخين بالأشعة تحت الحمراء فوق للحفاظ على درجة الحرارة حوالي 37 درجة مئوية. انتبه إلى المسافة الكافية بين والمصباح لتجنب ارتفاع درجة الحرارة.
3. ضع أقطاب إبرة ECG في جميع الكفوف الأربعة لمراقبة وتسجيل معدل ضربات القلب وشكل موجة ECG. قم بتثبيت مسبار المستقيم وأقطاب تخطيط القلب على المنصة باستخدام شريط لاصق.
4. ضع كريم إزالة الشعر على الجانب الأيسر من الصدر لإزالة الشعر وإنشاء مجال جراحي واضح.
   ملاحظة: الحد من وقت التطبيق والانتباه إلى الإزالة الكاملة للكريم لمنع الحروق الكيميائية.

3. بضع الصدر

1. قم بإجراء التحضير المعقم للجلد باستخدام محلول Betadine ، ثم ضع ثنى جراحيا على الصدر الأيسر لضمان بيئة معقمة. استخدم معدات معقمة لتنفيذ الإجراء. قم بعمل شق جلدي عمودي في الجزء الأوسط من العضلة الصدرية بطول 1 سم تقريبا و 2 مم بعيدا عن الحد القصي الأيسر.
2. بصق العضلة الصدرية لفضح الأضلاع تحتها. تجنب الإصابة العرضية للسفينة. في حالة حدوث نزيف ، استخدم أدوات تطبيق القطن لوقف أي نزيف.
3. تصور الأضلاع وحدد المساحات الوربية من خلال مراقبة الرئة المتضخمة من خلال جدار الصدر الرقيق شبه الشفاف. افتح تجويف الصدر باستخدام مقص جراحي عن طريق عمل شق 6-8 مم في الفضاء الوربي الثالث. تأكد من أن الشق لا يقل عن 2 مم من الحدود القصية حيث يوجد الشريان الصدري الداخلي.
4. أدخل منظارا صغيرا لعين الجرذ (انظر جدول المواد) في الفضاء الوربي. سيعمل هذا كمبعدة ضلع (الشكل 1 أ).
5. ارفع التامور برفق باستخدام ملقط منحني واسحبه بعيدا.
6. ضع قطعة صغيرة من القطن أعلى الرئة وادفعها برفق إلى أسفل.

4. إعداد LAD

1. يظهر LAD باللون الأحمر الفاتح ويمتد من الشريان الأورطي تحت الأذن اليسرى نحو القمة. الوضع المثالي للرباط أقل بحوالي 2 مم من طرف الأذن اليسرى. استخدم الجذع الرئوي كعلامة للمساعدة في تحديد الأذن اليسرى وتحسين تصور LAD باستخدام تدفق الضوء (الشكل 2).
2. استخدم إبرة مدببة لتمرير خياطة البولي بروبلين 7-0 حول LAD. لا تضع الإبرة عميقة جدا ، لأنها يمكن أن تدخل البطين الأيسر ، ولا ضحلة جدا ، لأنها يمكن أن تلحق الضرر ب LAD.
3. قم بإزالة قطعة القطن الصغيرة وتحقق مما إذا كانت الرئة اليسرى لا تزال جيدة التهوية.
4. إزالة ضلع المبتور.
5. تأكد من أن طول الخيط لا يقل عن 15 سم على كلا الطرفين. قطع الإبرة.
6. ضع قطعة من أنابيب PE-50 مقاس 1 مم فوق قطعة من أنابيب PE-10 مقاس 15 مم (انظر جدول المواد). قم بتوجيه طرفي الخيط من خلال أنبوب PE-10 وقم بتحويل أنبوب PE بنهايته السميكة ضد القلب.

5. إغلاق الصدر ونزع الأنبوب

1. ضع بعض هلام حمض الفوسيديك على المساحة الوربية المفتوحة واسمح للهواء المتبقي داخل الصدر بالهروب برفق عن طريق إعاقة تدفق جهاز التنفس الصناعي لفترة وجيزة. يمكن إضافة جل حمض الفوسيديك الإضافي إلى الجزء الخارجي من أنبوب PE لمنع دخول الهواء إلى الصدر.
2. أغلق العضلة الصدرية بغرزة 5-0 بولي بروبيلين X أعلى وأسفل مستوى أنبوب PE ، وتأكد من أن الجزء السميك من أنبوب PE تحت مستوى العضلات.
3. أغلق الجلد بغرزتين من مادة البولي بروبيلين X 5-0 أعلى واثنين أسفل أنبوب PE (الشكل 1B والشكل 3).
4. مع صندوق مغلق ، يمكن للحيوان التنفس تلقائيا مرة أخرى. فطم من جهاز التنفس الصناعي عن طريق تقليل حجم المد والجزر ومعدل التنفس ببطء. عندما يبدأ في التنفس ، افصل أنبوب جهاز التنفس الصناعي تلقائيا بعناية ، ولكن احتفظ به في مكانه حتى يتم ملاحظة نمط تنفس مستقر.
5. قم بتوصيل إمداد الأيزوفلوران بمخروط أنف يتم وضعه فوق أنف ويتم تثبيته على لوحة القاعدة.

6. تجميع أداة الأشعة تحت الحمراء عن بعد

1. ضع الجزء الجانبي الرأسي في لوحة القاعدة عن طريق إدخاله في الشقوق.
2. استخدم خطافا رفيعا لاسترداد طرفي الخياطة واسحبهما عبر الفتحة المركزية في الجزء الجانبي خلف البالون (انظر جدول المواد).
3. توجيه أحد الغرز ينتهي فوق وحول البالون. اتبع مع نهاية خياطة أخرى تحت وحول البالون. ضع جل حمض الفوسيديك لتوجيه أكثر سلاسة للخياطة.
4. توجيه ينتهي خياطة من خلال الشقوق على الجزء العلوي من الجزء الجانبي. في الجزء البعيد من الخيط ، ضع وزنا قدره 2.1 جم للحفاظ على نهاية كل خياطة في مكانها (الشكل 1 ج والشكل 4).
   ملاحظة: تكوين الأوزان المناسبة عرضة للتغيير ويجب اختباره مسبقا. انظر الشكل التكميلي 1 والملف التكميلي 1 للحصول على التفاصيل. يتم توفير تصميم أداة IRI عن بعد في الشكل التكميلي 2.

7. تحريض نقص التروية والتروية

1. تحفيز نقص التروية عن طريق نفخ البالون على الفور باستخدام مضخة البالون الوعائية حتى 2 بار. قفل المضخة. تحقق بصريا مما إذا كان البالون منتفخا وأن الأوزان مرفوعة (الشكل 4).
2. تأكيد نقص التروية من خلال مراقبة التغيير في تتبع تخطيط القلب.
3. اترك البالون منفوخا للوقت المحدد وفقا لبروتوكول الدراسة المحدد (30 دقيقة في التجارب المقدمة).
4. أوقف الانسداد ببساطة عن طريق فتح المضخة. أفرغ البالون بعناية. تحقق بصريا مما إذا كان البالون مفرغا من الهواء ويتم خفض الأوزان.

8. تفكيك أداة الأشعة تحت الحمراء عن بعد

1. قطع خياطة وأنبوب بين والجزء الجانبي وإزالة بعناية الجزء الجانبي.
2. ضع هلام حمض الفوسيديك في موقع إدخال الأنبوب في الصدر. استخدم ملقط منحني لدفع الجلد برفق ضد الأنبوب واستخدم ملقط آخر لاستخراج الأنبوب. قطع أي خياطة المتبقية بالقرب من الجلد.
3. ضع خيطا إضافيا من 5-0 بولي بروبيلين لإغلاق موقع خروج الأنبوب وتقليل خطر دخول الهواء إلى الصدر.

9. نهاية التخدير والشفاء

1. أوقف إمداد الأيزوفلوران واسمح للحيوان بالاستيقاظ في بيئة صامتة ودافئة وغنية بالأكسجين.
2. تأكد من أن الفأر ليس في أي ضائقة تنفسية من خلال مراقبته حتى الشفاء التام. توفير 0.3 مل من محلول ملحي معقم (في درجة حرارة الجسم) عن طريق الحقن داخل الصفاق لمنع الجفاف.
3. في حالة التسكين بعد الجراحة، يتم تطبيق مسكن أفيوني المفعول (البوبرينورفين، 0.1 ملغ/كغ) تحت الجلد قبل أن يصبح متنقلا. تحقق من الفئران كل 4-6 ساعات لمدة 24-48 ساعة القادمة عند توفير البوبرينورفين للتأكد من أن الفئران تستجيب لمسكنات الألم ولتحديد ما إذا كانت هناك حاجة إلى أدوية إضافية للألم. يجب أن يشمل الدعم الإضافي جل أو هريس غذائي قياسي موصى به للرعاية الداعمة يوضع على أرضية القفص بعد الجراحة.

النتائج

تم التحقق من صحة القدرة على إحداث نقص التروية من خلال أربعة اختبارات: كلوريد ثلاثي فينيل رباعي الأزوليوم (TTC) وتلطيخ سيريوس الأحمر (SR) ، وقياس تروبونين القلب I ، والتصوير بالرنين المغناطيسي لتعزيز الجادولينيوم المتأخر (LGE). تم تقييم الدلالة الإحصائية باستخدام اختبار مان وي...

Discussion

توفر تقنية الانسداد عن بعد الجديدة التي تم تقديمها في هذه الدراسة منصة فريدة لتطوير البحث في مجال نمذجة إصابة نقص التروية عن طريق تجنب الحاجة إلى التلاعب المباشر بالأوعية أثناء الجراحة الأولية والسماح بالتصوير المتزامن متعدد الوسائط لعضلة القلب المعاد تشكيلها في وقت م...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-0 silk suture	Sharpoint Products	DC-2515N
5-0 polypropylene suture	Ethicon	8710H
7-0 polypropylene suture	Ethicon	8206H
ACCLARENT Balloon Inflation Device	Johnson&Johnson MedTech	BID30
Acepromazine	Kela
BD Vialon 18 G	BD	381347
BD Vialon 20 G	BD	381334
Betadine Solution	Purdue Pharma	25655-41-8
Buprenorphine (Buprenex Injectable)	Reckitt Benkiser Healthcare	NDC 12496-0757-1
Carp Zoom Styl Knijplood 2.1 g (lead fishing weights)	Visdeal.nl
Dumont #3 Forceps	Fine Science Tools	11231-30
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-30
Fine Scissors	Fine Science Tools	14040-10
Fucidine gel	Leo Pharma
Isoflurane	Abbott	NDC 5260-04-05
KD Mouse/Rat Eye Speculum	World Precision Instruments	501897
KD mouse/rat eye speculum	World Precision Instruments	501897
Ketamine	Dechra
Light source	Zeiss	KL 1500 LCD
MRI system	Bruker BioSpin, Ettlingen, Germany	BioSpec 70/30
NatriumChloride 0.9%	Baxter
Nocturnal Infrared Heat Lamp	Zoo Med Laboratories, Inc.	RS-75
ParaVision software	Bruker BioSpin	version 6.0.1
polyethylene tubing PE-10	SAI Infusion technologies	PE-10
polyethylene tubing PE-50	SAI Infusion technologies	PE-50
remote IRI tool (PMMA)	homemade
Rodent Surgical Monitor	Indus instruments
Segment v4.0	Medviso, segment.heiberg.se	R12067
Self-gated gradient echo sequence	Bruker BioSpin, Ettlingen, Germany	IntraGate, ParaVision 6.0.1
Slim Elongated Needle Holder	Fine Science Tools	12005-15
Sure-Seal Mouse/Rat Induction Chamber	World Precision Instruments	EZ-178
Tubing Connectors, Poly, Y Shape	Westlab	072025-0001
Ultraverse 035 PTA Dilatation Catheter: 5mm x 40mm, 17 ATM RBP balloon on 130 cm long catheter	Bard Peripheral Vascular, Inc.	00801741092671
Veet (depilatory creme)	Reckitt Benkiser Healthcare
Ventilator, MiniVent Model 845	Hugo Sachs	73-0043
Vidisic	BAUSCH & LOMB PHARMA	685313
Xylazine	Bayer