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この記事について

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  • 要約
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  • プロトコル
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  • 資料
  • 参考文献
  • 転載および許可

要約

この記事では、マウスで心筋虚血再灌流障害(IRI)を誘発するための独自の閉鎖胸部技術を紹介します。提示された方法は、マウスが遠隔で心筋虚血を誘発しながら自発的に呼吸することを可能にする。これにより、虚血と再灌流の動的プロセスを非侵襲的イメージングを介してその場でリアルタイムに研究するための動物へのアクセスが提供されます。

要約

急性心筋梗塞 (AMI) は、一般的で死亡率の高い心血管疾患です。AMIの血行再建術戦略が進歩しているにもかかわらず、AMIはしばしば心筋虚血再灌流障害(IRI)を引き起こし、心臓の損傷を増幅します。マウスモデルは、 in vivoでの急性損傷と慢性心筋リモデリングの両方を調査するための重要なツールとして機能します。この研究は、マウスで心筋IRIを遠隔誘導するためのユニークな閉鎖胸部技術を提示し、MRIやPETなどの生体内イメージングを使用して閉塞および再灌流の非常に初期の段階の調査を可能にします。このプロトコルは、遠隔閉塞法を利用しているため、胸部閉鎖後の虚血開始を正確に制御できます。外科的外傷を軽減し、自発呼吸を可能にし、実験の一貫性を高めます。この技術を際立たせているのは、閉塞および再灌流イベント中に、超音波や磁気共鳴画像法(MRI)などの非侵襲的イメージングを同時に行うことができる可能性があることです。これは、ほぼリアルタイムで組織応答を解析するユニークな機会を提供し、虚血および再灌流中のプロセスに関する重要な洞察を提供します。この革新的なアプローチについて、梗塞の心壊死マーカーの測定、造影MRIによるリスク領域の評価、瘢痕成熟期の梗塞の染色など、広範な系統的試験が実施されました。これらの調査を通じて、心筋虚血再灌流障害に対する研究アプローチを前進させ、標的を絞った介入の開発を加速する上で、提案されたツールの価値に重点が置かれました。提案された革新的な実験プロトコルを非侵襲的イメージング技術と組み合わせることの実現可能性を実証する予備的な知見を本明細書に提示する。これらの最初の結果は、専用の動物用クレードルを利用して、MRIスキャンを同時に実施しながら遠隔で心筋虚血を誘発することの利点を強調しています。

概要

急性心筋梗塞(AMI)は、世界的に蔓延している心血管疾患であり、高い死亡率と罹患率と関連しています1。技術の進歩により、AMI患者の早期かつ効果的な血行再建術が可能になりましたが、これらの介入後も患者は依然として心筋虚血再灌流障害(IRI)を経験しています2。したがって、IRIを軽減するための基本的なメカニズムを理解し、アプローチを策定することが重要です。IRIは、多数の複雑な生物学的プロセスが関与する複雑な病態生理学的状態を表しています。これらには、制御された細胞死、酸化ストレス応答、炎症、創傷治癒、線維症、および心室リモデリングが含まれます。マウスなどの動物モデルは、IRI研究にとって非常に重要であり、その費用対効果、迅速な繁殖、およびトランスジェニックモデルからの豊富な機構情報により、広く採用されています3

このプロトコルは、胸部が閉じた自発呼吸マウスにIRIを遠隔誘導する革新的な技術を提示し、人間の病理をより密接に模倣します。遠隔閉塞は、心筋から離れた位置に配置されたバルーンカテーテルを利用して左前下行動脈(LAD)を閉塞することによって達成されました。このアプローチにより、閉塞と再灌流の正確な瞬間に鼓動する心臓への継続的なアクセスが可能になり、超音波や磁気共鳴画像法(MRI)などの同時イメージングモダリティが容易になります。これらの非侵襲的方法は、閉塞および再灌流イベントの前、最中、および後の組織応答に関する重要な洞察を提供する可能性があります。

マウスモデルでIRIを誘導するためのさまざまな外科的手法が存在します。冠動脈結紮の開胸モデルにおける開胸術に起因する外科的外傷は、虚血と再灌流に関連する多様なメカニズムに影響を与える免疫応答を引き起こします。自然免疫系の活性化は、心筋梗塞の程度に影響を与える可能性を秘めています4。提案された適応技術は、心筋のプレコンディショニングとポストコンディショニングを調査し、オープン胸部の時間枠を最大 5 分に最小化することにより、マウスの IRI 研究における外科的外傷に対する自然免疫応答の影響を軽減するための潜在的なアプローチを提供します。さらに、新たに開発された技術は、人工呼吸器誘発性肺損傷5によって引き起こされる炎症誘発性後遺症の軽減にも貢献する可能性があります。しかし、この新しいクローズドチェスト法の複合的な効果には、さらに詳細な調査が必要です。

提案された技術の徹底的な検証は、外科的胸郭清と結紮糸誘発閉塞を通じて LAD を 30 分間露出させる従来の方法と比較することにより行われました。心筋梗塞のサイズを反映したトロポニン測定、ガドリニウム造影剤を用いたMRIを用いたリスク領域の評価、組織学的トリフェニルテトラゾリウムクロリド(TTC)染色、およびシリウスレッド(SR)染色 による 最終的な瘢痕サイズの決定を含む、両方の技術の結果を比較しました。この結果は、マウスモデルにおける虚血再灌流障害を研究するための提案されたアプローチの堅牢性と有効性を示しています。

プロトコル

この動物プロトコルは、ルーヴェン・カトリック大学の動物実験倫理委員会(ECD)によって承認されたガイドラインと規制に準拠しています。現地のECDが策定するすべてのポリシーは、指令2010/63/EUで宣言されている実験動物の福祉に関する欧州連合の規制に準拠しています。以下に説明するすべての試験は、8〜12週齢(体重= 20〜23 g)の雄C57BL / 6マウスで実施されています。.急性実験は、手術直後に犠牲にされた動物を表しています。生存実験は、トロポニン測定、MRI、SR染色を含む4週間の追跡調査であった。

1.麻酔と気管内挿管

  1. ケタミン(7.5 mg / kg;ニマテック100 mg / mL)、キシラジン(1 mg / kg;ロンプン、20 mg / mL)、およびアセプロマジン(0.1 mg / kg;プラシベット、10 mg / mL)(KXA)( 材料の表を参照)腹腔内に0.9%生理食塩水希釈剤を投与します。.これにより、よりスムーズで侵襲性の低い挿管が可能になります。
  2. マウスを誘導チャンバー( 材料の表を参照)に置き、2.5%イソフルランを純酸素中で1 L /分の流量で使用して、直立とつま先のつま先つまみ反射が失われるまで麻酔をかけます。
  3. 動物を加熱パッド(±38°C)に移し、頭を外科医に向けて仰向けに置きます。尻尾と前足をパッドにテープで固定します。前肢が過度に伸びていないことを確認してください、これは呼吸を損なう可能性があるためです。
  4. 上切歯の周りに2-0シルク縫合糸( 材料の表を参照)を置き、パッドの境界に縫合糸をテープで固定してマウスをぴんと張らせます。必要に応じて、縫合糸の張力を保つためにニードルホルダーを取り付けます。ノーズコーンを使用して、100%酸素中の2%イソフルランを使用して1L / minの流量で動物を麻酔します。
  5. 光源を胸骨の吻側だけに置き、ノーズコーンを取り外し、イソフルラン供給を人工呼吸器に置きます。鉗子を使用してマウスを挿管するには、舌を上に持ち上げ、自作の喉頭鏡を持って舌の基部をさらに持ち上げ、声帯を視覚化します。
  6. 声帯の間の鈍い針に18Gカテーテルを使用して自作の気管チューブを留置します。カテーテルを上に移動させ、鈍い針を抜いて、チューブをマウスベンチレーターに接続します( 材料の表を参照)。
  7. 変更されたY字型コネクタ( 材料の表を参照)を使用して、挿管チューブを人工呼吸器に接続します。気管チューブの正しい位置は、対称的な胸部拡張を判断することで確認できます。
  8. 一回換気量(mL)を体重(BW)(g)×7、換気量を53.5×(BW(g)-0.26)ストローク/分に設定し、必要に応じて特定のマウスの体重に調整します6 (例えば、25gのマウスの場合、一回換気量は140ストローク/分で175mLです)。
  9. イソフルランを100%酸素中1%に減らします、動物は前投薬のために麻酔されたままになります。ただし、つま先をつまむことにより、麻酔の深さを定期的に評価してください。麻酔の深さに基づいてイソフルラン濃度を適応させます。
  10. 麻酔下での乾燥を防ぐために、眼科用軟膏を一滴塗布します。.

2. IRIツールのインストール

注意: すべてのテーピングをはがし、専用のIRIツールのベースプレートに動物を置きます。IRI ツールのプロパティの詳細については、 補足ファイル 1 を参照してください。

  1. 専用のリモートIRIツールのベースプレートを、外科医の前の横向きの位置に固定します。尻尾と足をテープで固定します。偶発的な動きを防ぐために、上切歯の周りに2-0シルク縫合糸を使用して頭を固定します(図1)。
  2. 直腸サーマルプローブ( 材料の表を参照)を挿入して体温を監視し、動物の上にある赤外線加熱ランプを使用して温度を約37°Cに保ちます。 動物とlの間に十分な距離に注意してくださいamp 過熱を避けるために。
  3. ECG針電極を4つの足すべてに配置して、心拍数とECG波形を観察および記録します。直腸プローブとECG電極をテープでプラットフォームに固定します。
  4. 胸部の左側に脱毛クリームを塗ると脱毛し、術野がすっきりと整えます。
    注意: 塗布時間を制限し、化学火傷を防ぐためにクリームの完全な除去に注意を払ってください。

3.開胸術

  1. Betadine Solutionを使用して皮膚の無菌調製を行い、その後、左胸部に外科用ドレープを配置して無菌環境を確保します。滅菌済みの機器を使用して手順を実行します。胸筋の中央部に、長さ約1cm、左胸骨境界から2mm離れた場所に垂直に皮膚を切開します。
  2. 胸筋を吐き出して、その下の肋骨を露出させます。船舶への偶発的な怪我を避けてください。出血が発生した場合は、綿のアプリケーターを使用して出血を止めてください。
  3. 肋骨を視覚化し、薄い半透明の胸壁を通して膨らんだ肺を観察することにより、肋間腔を特定します。手術用ハサミを使用して、3番目の肋間腔に6〜8mmの切開を行い、胸腔を開きます。切開部が、内胸動脈が位置する胸骨境界から2mm以上離れていることを確認してください。
  4. 小さなラットアイスペキュラム( 材料の表を参照)を肋間腔に挿入します。これは、リブリトラクターとして機能します(図1A)。
  5. 湾曲した鉗子で心膜をそっと持ち上げ、引き離します。
  6. 肺の上に小さな綿を置き、そっと下に押します。

4. LADの準備

  1. LADは真っ赤に見え、左耳介の下の大動脈から頂点に向かって走ります。結紮糸の理想的な位置は、左耳介の先端より約2mm低い位置です。肺幹をマーカーとして使用して、左耳介を特定し、光の流入を使用してLADの視覚化を最適化します(図2)。
  2. テーパー針を使用して、7-0ポリプロピレン縫合糸をLADの周りに通します。針は左心室に入る可能性があるため、針を深く置きすぎたり、LADを損傷する可能性があるため浅すぎたりしないでください。
  3. 小さな綿片を取り除き、左肺がまだ換気されているかどうかを確認します。
  4. リブリトラクターを取り外します。
  5. 縫合糸の両端が15cm以上の長さであることを確認してください。針を切り落とします。
  6. 1 mm PE-50 チューブを 15 mm PE-10 チューブの上に置きます ( 材料の表を参照)。縫合糸の両端をPE-10チューブに通し、PEチューブの太い端を心臓に当てて移動します。

5.胸部閉鎖と抜管

  1. 開いた肋間腔にフシジン酸ジェルを塗布し、人工呼吸器の流出を一時的に遮ることにより、残りの胸腔内空気を静かに逃がします。胸部への空気の侵入を防ぐために、PEチューブの外側部分に追加のフシジン酸ゲルを追加することができます。
  2. PEチューブのレベル上下に5-0ポリプロピレンXステッチで胸筋を閉じ、PEチューブの肥厚部分が筋肉のレベルの下にあることを確認します。
  3. PEチューブの上と下に2つの5-0ポリプロピレンXステッチで皮膚を閉じます(図1B および 図3)。
  4. 胸が閉じていると、動物は再び自発的に呼吸することができます。一回換気量と呼吸数をゆっくりと減らすことにより、動物を人工呼吸器から離乳させます。.動物が呼吸を始めたら、自発的に慎重に換気チューブを外しますが、安定した呼吸パターンが観察されるまで所定の位置に保ちます。
  5. イソフルラン供給を、動物の鼻の上に置かれ、ベースプレートに固定されているノーズコーンに接続します。

6. リモートIRツールの組み立て

  1. 縦側の側面部分をベースプレートのスリットに差し込んで配置します。
  2. 細いフックを使用して2つの縫合糸の端を取り出し、バルーンの後ろの側面部分の中央の穴から引き出します( 材料の表を参照)。
  3. 縫合糸の端の1つをバルーンの上と周りにガイドします。もう一方の縫合糸の端をバルーンの下と周りでフォロースルーします。縫合糸のガイドをスムーズにするために、フシジン酸ゲルを塗布します。
  4. 縫合糸の端をサイドパーツ上部のスリットに通します。縫合糸の遠位部分に2.1gの重りをかけて、各縫合糸の端を所定の位置に保ちます(図1C および 図4)。
    注意: 適切なウェイトの構成は変更される可能性があり、事前にテストする必要があります。詳細については、 補足図 1 および 補足ファイル 1 を参照してください。リモート IRI ツールの設計は、 補足図 2 で提供されています。

7. 虚血と再灌流の誘発

  1. 血管バルーンポンプを使用してバルーンを最大2バールまで迅速に膨らませることにより、虚血を誘発します。.ポンプをロックします。バルーンが膨らみ、ウェイトが持ち上げられているかどうかを目視で確認します(図4)。
  2. ECGトレースの変化を観察して虚血を確認します。
  3. 特定の研究プロトコルに従って、設定された時間(提示された実験では30分)バルーンを膨らませたままにします。
  4. ポンプのロックを解除するだけで閉塞を止めます。バルーンを慎重に収縮させます。バルーンが収縮し、ウェイトが下がっているかどうかを目視で確認します。

8.リモートIRツールの分解

  1. 動物と側面部分の間の縫合糸とチューブを切断し、側面部分を慎重に取り外します。
  2. 胸部へのチューブの挿入部位にフシジン酸ゲルを塗布します。湾曲した鉗子を使用して皮膚をチューブにそっと押し付け、別の鉗子を使用してチューブを抽出します。皮膚の近くに残っている縫合糸を切断します。
  3. 5-0ポリプロピレンの予備の縫合糸を配置して、チューブの出口部位を閉じ、胸部への空気の侵入リスクを最小限に抑えます。

9. 麻薬終結と回復

  1. イソフルランの供給を止め、動物が静かで暖かく、酸素が豊富な環境で目を覚ますようにします。
  2. マウスが完全に回復するまで観察することにより、マウスが呼吸困難に陥っていないことを確認します。脱水症を防ぐために、腹腔内注射により0.3mLの滅菌生理食塩水(体温)を提供します。.
  3. 術後鎮痛薬として、オピオイド鎮痛薬(ブプレノルフィン、0.1 mg / kg)を皮下投与してから、動物が歩行可能になります。.ブプレノルフィンが提供されている場合は、次の24〜48時間について4〜6時間ごとにマウスをチェックし、マウスが鎮痛剤に反応していることを確認し、追加の鎮痛剤が必要かどうかを判断します。.追加のサポートには、術後にケージの床に置かれた標準的な推奨支持療法ダイエットジェルまたはマッシュを含める必要があります。

結果

虚血を誘発する能力の検証は、塩化トリフェニルテトラゾリウム(TTC)およびシリウスレッド(SR)染色、心筋トロポニンI測定、および後期ガドリニウム増強(LGE)MRイメージングの4つの試験によって行われています。統計的有意性は、サンプルサイズが限られていることを考慮して、Mann-Whitneyノンパラメトリック検定を使用して評価されました。統計的有意性は p < 0...

ディスカッション

この研究で導入された新しい遠隔閉塞技術は、虚血再灌流損傷モデリングの分野で研究を進めるための独自のプラットフォームを提供します 最初の手術中の直接血管操作の必要性を回避し、早期に再灌流された心筋の同時マルチモーダルイメージングを可能にします。トロポニンI測定、LGE造影MRI、TTC、およびSR染色を含む包括的な特性評価は、提案された技術が現?...

開示事項

著者には、開示すべき利益相反はありません。

謝辞

実験は、KUルーヴェンの中核施設「分子小動物イメージングセンター」(MoSAIC)で行われました。著者は、技術支援を提供してくれたKatarzyna Błażejczykに感謝の意を表したいと思います。この研究は、KU Leuven(C14/20/095)およびResearch Foundation - Flanders(FWO G0A7722N)からの研究助成金によって支援されました。M. Algoetは、Research Foundation - Flanders Fellowship Grant(FWO 11A2423N)の支援を受けています。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
2-0 silk sutureSharpoint ProductsDC-2515N
5-0 polypropylene sutureEthicon8710H
7-0 polypropylene sutureEthicon8206H
ACCLARENT Balloon Inflation DeviceJohnson&Johnson MedTechBID30
AcepromazineKela
BD Vialon 18 GBD381347
BD Vialon 20 GBD381334
Betadine SolutionPurdue Pharma25655-41-8
Buprenorphine (Buprenex Injectable)Reckitt Benkiser HealthcareNDC 12496-0757-1
Carp Zoom Styl Knijplood 2.1 g (lead fishing weights)Visdeal.nl
Dumont #3 ForcepsFine Science Tools11231-30
Dumont #5 ForcepsFine Science Tools11251-30
Fine ScissorsFine Science Tools14040-10
Fucidine gelLeo Pharma
IsofluraneAbbottNDC 5260-04-05
KD Mouse/Rat Eye SpeculumWorld Precision Instruments501897
KD mouse/rat eye speculumWorld Precision Instruments501897
KetamineDechra
Light sourceZeissKL 1500 LCD
MRI system Bruker BioSpin, Ettlingen, GermanyBioSpec 70/30
NatriumChloride 0.9%Baxter
Nocturnal Infrared Heat LampZoo Med Laboratories, Inc.RS-75
ParaVision software Bruker BioSpinversion 6.0.1 
polyethylene tubing PE-10SAI Infusion technologiesPE-10
polyethylene tubing PE-50SAI Infusion technologiesPE-50
remote IRI tool (PMMA)homemade
Rodent Surgical MonitorIndus instruments
Segment v4.0Medviso, segment.heiberg.seR12067
Self-gated gradient echo sequence Bruker BioSpin, Ettlingen, GermanyIntraGate, ParaVision 6.0.1
Slim Elongated Needle HolderFine Science Tools12005-15
Sure-Seal Mouse/Rat Induction ChamberWorld Precision InstrumentsEZ-178
Tubing Connectors, Poly, Y ShapeWestlab072025-0001
Ultraverse 035 PTA Dilatation Catheter: 5mm x 40mm, 17 ATM RBP balloon on 130 cm long catheterBard Peripheral Vascular, Inc.00801741092671
Veet (depilatory creme)Reckitt Benkiser Healthcare
Ventilator, MiniVent Model 845Hugo Sachs73-0043
VidisicBAUSCH & LOMB PHARMA685313
XylazineBayer

参考文献

  1. Bryda, E. C. The mighty mouse: The impact of rodents on advances in biomedical research. Mo Med. 110 (3), 207-211 (2013).
  2. Fishbein, M. C., et al. Early phase acute myocardial infarct size quantification: Validation of the triphenyl tetrazolium chloride tissue enzyme staining technique. Am Heart J. 101 (5), 593-600 (1981).
  3. Ibáñez, B., et al. Evolving therapies for myocardial ischemia/reperfusion injury. J Am Coll Cardiol. 65 (14), 1454-1471 (2015).
  4. Dąbrowska, A. M., et al. The immune response to surgery and infection. Cent Eur J Immunol. 39 (4), 532-537 (2014).
  5. Muthuramu, I., et al. Permanent ligation of the left anterior descending coronary artery in mice: a model of post-myocardial infarction remodelling and heart failure. J Vis Exp. (94), e52206 (2014).
  6. Nickles, H. T., et al. Mechanical ventilation causes airway distension with proinflammatory sequelae in mice. Am J Physiol-Lung C. 307 (1), L27-L37 (2014).
  7. Reed, G. W., et al. Acute myocardial infarction. Lancet. 389 (10065), 197-210 (2017).
  8. Rittié, L. Method for picrosirius red-polarization detection of collagen fibers in tissue sections. Methods Mol Biol. 1627, 395-407 (2017).
  9. Schwarte, L. A., et al. Mechanical ventilation of mice. Basic Res Cardiol. 95 (6), 510-520 (2000).
  10. Vaneker, M., et al. Mechanical ventilation induces a Toll/Interleukin-1 receptor domain-containing adapter-inducing interferon β-dependent inflammatory response in healthy mice. Anesthesiology. 111, 836-843 (2009).
  11. Van Allen, N. R., et al. The role of volatile anesthetics in cardioprotection: A systematic review. Med Gas Res. 2, 22 (2012).
  12. Kumar, D., et al. Distinct mouse coronary anatomy and myocardial infarction consequent to ligation. Coron Artery Dis. 16 (1), 41-44 (2005).
  13. Bayat, H., et al. Progressive heart failure after myocardial infarction in mice. Basic Res Cardiol. 97 (3), 206-213 (2002).

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