חסימת LAD מופעלת מרחוק באמצעות קטטר בלון בעכברים נושמים באופן ספונטני

Summary

מאמר זה מציג טכניקה ייחודית של חזה סגור לגרימת פגיעה באיסכמיה של שריר הלב (IRI) בעכברים. השיטה המוצגת מאפשרת לעכברים לנשום באופן ספונטני תוך גרימת איסכמיה מרחוק של שריר הלב. זה מספק גישה לבעל החיים לחקר התהליכים הדינמיים של איסכמיה ורפרפוזיה באתרם ובזמן אמת באמצעות הדמיה לא פולשנית.

Abstract

אוטם שריר הלב החריף (AMI) הוא מצב קרדיווסקולרי שכיח ותמותה גבוהה. למרות ההתקדמות באסטרטגיות רה-וסקולריזציה עבור AMI, היא מובילה לעתים קרובות לפגיעה באיסכמיה של שריר הלב (IRI), מה שמגביר את הנזק הלבבי. מודלים של מורין משמשים ככלים חיוניים לחקירת פציעות אקוטיות ותכנון מחדש כרוני של שריר הלב in vivo. מחקר זה מציג טכניקה ייחודית של חזה סגור להשראת IRI מרחוק של שריר הלב בעכברים, המאפשרת לחקור את השלב המוקדם מאוד של חסימה ורפרפוזיה באמצעות הדמיה in-vivo כגון MRI או PET. הפרוטוקול משתמש בשיטת חסימה מרחוק, המאפשרת שליטה מדויקת על התחלת איסכמיה לאחר סגירת החזה. הוא מפחית טראומה כירורגית, מאפשר נשימה ספונטנית ומשפר את עקביות הניסוי. מה שמייחד טכניקה זו הוא הפוטנציאל שלה לדימות לא פולשני בו זמנית, כולל אולטרסאונד והדמיית תהודה מגנטית (MRI), במהלך אירועי חסימה ורפרפוזיה. הוא מציע הזדמנות ייחודית לנתח תגובות רקמות כמעט בזמן אמת, ומספק תובנות קריטיות על תהליכים במהלך איסכמיה ורפרפוזיה. נערכו בדיקות שיטתיות מקיפות של גישה חדשנית זו, מדידת סמני נמק לבבי לאוטם, הערכת האזור בסיכון באמצעות MRI משופר בניגוד, והכתמת אוטם בשלב הבשלת הצלקת. באמצעות חקירות אלה הושם דגש על ערכו של הכלי המוצע בקידום גישות מחקריות לפגיעה באיסכמיה של שריר הלב ובהאצת הפיתוח של התערבויות ממוקדות. מוצגים כאן ממצאים ראשוניים המדגימים את ההיתכנות של שילוב פרוטוקול הניסוי החדשני המוצע עם טכניקות הדמיה לא פולשניות. תוצאות ראשוניות אלה מדגישות את היתרון של ניצול עריסת בעלי החיים הייעודית לגרימת איסכמיה מרחוק של שריר הלב תוך ביצוע סריקות MRI בו זמנית.

Introduction

אוטם חריף של שריר הלב (AMI), מצב קרדיווסקולרי עולמי נפוץ, קשור לשיעורי תמותה ותחלואה גבוהים¹. למרות ההתקדמות הטכנולוגית שאפשרה אסטרטגיות רה-וסקולריזציה מוקדמות ויעילות עבור חולי AMI, חולים עדיין חווים פגיעה באיסכמיה של שריר הלב (IRI) בעקבות התערבויות אלה². לכן, הבנת המנגנונים הבסיסיים וגיבוש גישות להפחתת IRI היא חיונית. IRI מייצג מצב פתופיזיולוגי מורכב המערב מספר רב של תהליכים ביולוגיים מורכבים. אלה כוללים מוות תאי מוסדר, תגובות עקה חמצונית, דלקת, ריפוי פצעים, פיברוזיס ועיצוב מחדש של החדרים. מודלים של בעלי חיים, כגון עכברים, היו בעלי חשיבות רבה למחקר IRI והם נמצאים בשימוש נרחב בשל עלות-תועלתם, הרבייה המהירה שלהם, ושפע המידע המכניסטי ממודלים טרנסגניים³.

פרוטוקול זה מציג טכניקה חדשנית להשראת IRI מרחוק בעכברים נושמים באופן ספונטני עם חזה סגור, המחקה באופן הדוק יותר את הפתולוגיה האנושית. חסימה מרחוק הושגה על ידי שימוש בצנתר בלון הממוקם במרחק משריר הלב כדי לחסום את העורק היורד הקדמי השמאלי (LAD). גישה זו מציעה גישה מתמשכת ללב הפועם ברגעים המדויקים של חסימה ורפרפוזיה, ומקלה על שיטות הדמיה סימולטניות, כולל אולטרסאונד או דימות תהודה מגנטית (MRI). שיטות לא פולשניות אלה יכולות לספק תובנות חיוניות לגבי תגובות רקמות לפני, במהלך ואחרי אירועי חסימה ורפרפוזיה.

קיימות טכניקות כירורגיות שונות להשראת IRI במודלים מורינים. טראומה כירורגית הנובעת מבית החזה במודלים של קשירה כלילית בחזה פתוח מעוררת תגובה חיסונית המשפיעה על מנגנונים מגוונים הקשורים לאיסכמיה ורפרפוזיה. הפעלת מערכת החיסון המולדת טומנת בחובה פוטנציאל להשפיע על מידת אוטם שריר הלב⁴. הטכניקה המותאמת המוצעת מספקת גישה פוטנציאלית לחקר שריר הלב לפני ואחרי ההתניה ואולי להפחית את ההשפעה של התגובה החיסונית המולדת לטראומה כירורגית במחקרי IRI על ידי מזעור מסגרת הזמן של בית החזה הפתוח למקסימום של 5 דקות. יתר על כן, הטכניקה החדשה שפותחה עשויה גם לתרום להפחתת sequelae פרו דלקתי הנגרם על ידי פגיעה ריאות הנגרמת על ידי הנשמה⁵. עם זאת, ההשפעות המשולבות של שיטת החזה הסגור החדשה תדרוש חקירה מעמיקה נוספת.

תיקוף יסודי של הטכניקה המוצעת בוצע על ידי השוואתה לשיטה המסורתית, הכוללת חשיפת LAD באמצעות דיסקציה כירורגית של החזה וחסימה הנגרמת על ידי ליגטורה למשך 30 דקות. הושוו תוצאות משתי הטכניקות, שכללו מדידות טרופונין המשקפות את גודל אוטם הלב, הערכות של האזור בסיכון באמצעות MRI עם שיפור ניגודיות גדוליניום, צביעה היסטולוגית של טריפניל טטרזוליום כלוריד (TTC), וקביעת גודל צלקת סופי באמצעות צביעת סיריוס אדום (SR). התוצאה מדגימה את החוסן והיעילות של הגישה המוצעת לחקר פגיעה איסכמיה-רפרפוזיה במודלים של מורין.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

פרוטוקול זה של בעלי חיים אושר על ידי והוא בהתאם להנחיות ולתקנות שנקבעו על ידי הוועדה האתית לניסויים בבעלי חיים (ECD) באוניברסיטה הקתולית של לוון. כל המדיניות שפותחה על ידי ECD המקומי עוקבת אחר תקנות האיחוד האירופי בנוגע לרווחתן של חיות מעבדה כפי שהוכרז בדירקטיבה 2010/63/EU. כל הבדיקות המתוארות להלן בוצעו בעכברים זכרים C57BL/6 בני 8-12 שבועות (משקל גוף = 20-23 גרם). הניסויים החריפים מייצגים בעלי חיים שהוקרבו מיד לאחר הניתוח. ניסויי ההישרדות ייצגו מעקב של ארבעה שבועות, כולל מדידת טרופונין, MRI וצביעת SR.

1. הרדמה ואינטובציה אנדוטרכאלית

1. מתן תרופות טרום הרדמה באמצעות תערובת של קטמין (7.5 מ"ג/ק"ג; Nimatek 100 מ"ג / מ"ל), xylazine (1 מ"ג / ק"ג; רומפון, 20 מ"ג/מ"ל), ואצפרומזין (0.1 מ"ג/ק"ג; Placivet, 10 מ"ג / מ"ל) (KXA) (ראה טבלה של חומרים) עם 0.9% מלח מדלל intraperitoneally. זה מאפשר אינטובציה חלקה יותר ופחות פולשנית.
2. הניחו את העכבר בתא אינדוקציה (ראו טבלת חומרים) והפעילו הרדמה באמצעות איזופלורן 2.5% בחמצן טהור עם קצב זרימה של 1 ליטר/דקה עד לאיבוד רפלקס הישרה וצביטת הבוהן.
3. מעבירים את בעל החיים לפד מחומם (±38 מעלות צלזיוס) ומניחים אותו בשכיבה עם הראש לכיוון המנתח. תקן את הזנב ואת הכפות הקדמיות עם סרט על הכרית. ודא כי הגפיים הקדמיות אינן מתוחות יתר על המידה, שכן זה יכול לפגוע בנשימה.
4. הניחו תפר משי 2-0 (ראו טבלת חומרים) סביב החותכות העליונות והדביקו את התפר על גבול הפד כדי למשוך את העכבר. במידת הצורך, חבר מחזיק מחט כדי לשמור על מתח על התפר. יש לשמור על בעל החיים מורדם באמצעות 2% איזופלורן ב-100% חמצן עם זרימה של 1 ליטר/דקה באמצעות חרוט אף.
5. הניחו מקור אור רק רוסטרלי של עצם החזה, הסירו את חרוט האף, והניחו את אספקת האיזופלורן על מכונת ההנשמה. בצע אינטובציה של העכבר באמצעות מלקחיים על ידי הרמת הלשון כלפי מעלה והחזקת לרינגוסקופ מתוצרת עצמית כדי להרים את החלק הבסיסי של הלשון עוד יותר ולדמיין את מיתרי הקול.
6. הניחו צינור קנה נשימה מתוצרת עצמית באמצעות קטטר 18G על מחט עמומה בין מיתרי הקול. הזיזו את הצנתר, הוציאו את המחט העמומה וחברו את הצינור למאוורר העכבר (ראו טבלת חומרים).
7. השתמש במחבר בצורת Y שונה (ראה רשימת חומרים) כדי לחבר את צינור האינטובציה למכונת ההנשמה. המיקום הנכון של צינור קנה הנשימה יכול להיות מאושר על ידי שיפוט הרחבת החזה סימטרי.
8. הגדר את נפח הגאות (מ"ל) על משקל הגוף (BW) (g) x 7 ואת קצב האוורור על 53.5 x (BW (g)^-0.26) משיכות לדקה, והתאם אותו למשקל הגוף של עכבר מסוים במידת הצורך⁶ (לדוגמה, עבור עכבר של 25 גרם נפח הגאות הוא 175 מ"ל ב 140 פעימות לדקה).
9. להפחית את isoflurane ל 1% ב 100% חמצן, כמו החיה יישאר מורדם עקב premedication. עם זאת, להעריך באופן קבוע את עומק ההרדמה על ידי ביצוע צביטת בוהן. התאמת ריכוז איזופלורן בהתאם לעומק ההרדמה.
10. יש למרוח טיפה של משחת עיניים למניעת יובש בזמן ההרדמה.

2. התקנת כלי IRI

הערה: הסר את כל ההדבקות והנח את בעל החיים על לוח הבסיס של כלי ה-IRI הייעודי. פרטים על מאפייני הכלי IRI מוזכרים בקובץ משלים 1.

1. קבע את לוחית הבסיס של כלי ה-IRI המרוחק שנבנה במיוחד במיקום צדדי מול המנתח. תקן את הזנב והכפות באמצעות סרט הדבקה. תקנו את הראש באמצעות תפר משי 2-0 סביב החותכות העליונות כדי למנוע תזוזה מקרית (איור 1).
2. הכנס את הבדיקה התרמית הרקטלית (ראה טבלת חומרים) כדי לפקח על טמפרטורת הגוף והשתמש במנורת חימום אינפרא אדום מעל החיה כדי לשמור על הטמפרטורה סביב 37 מעלות צלזיוס. שימו לב למרחק מספיק בין החיה למנורה כדי למנוע התחממות יתר.
3. מקם את אלקטרודות מחט האק"ג בכל ארבע הכפות כדי לצפות ולרשום את קצב הלב ואת צורת הגל של האק"ג. אבטח את הבדיקה הרקטלית ואת אלקטרודות האק"ג לפלטפורמה באמצעות קלטת.
4. יש למרוח קרם להסרת שיער בצד שמאל של בית החזה כדי להסיר שיער וליצור שדה ניתוחי ברור.
   הערה: יש להגביל את זמן המריחה ולשים לב להסרה מלאה של הקרם למניעת כוויות כימיות.

3. Thoracotomy

1. בצע הכנה אספטית של העור באמצעות תמיסת בטדין, לאחר מכן הנח וילון כירורגי על בית החזה השמאלי כדי להבטיח סביבה סטרילית. השתמש בציוד מעוקר כדי לבצע את ההליך. בצע חתך עור אנכי בחלק האמצעי של שריר החזה באורך של כ -1 ס"מ ובמרחק של כ -2 מ"מ מגבול עצם החזה השמאלית.
2. לירוק את שריר החזה כדי לחשוף את הצלעות מתחת. הימנע מפגיעה בשוגג בכלי השיט. אם מתרחש דימום, השתמש אפליקטורים כותנה כדי לעצור כל דימום.
3. דמיינו את הצלעות וזהו את החללים הבין-קוסטליים על ידי התבוננות בריאה המתנפחת דרך קיר החזה הדק והשקוף למחצה. פתח את חלל החזה באמצעות מספריים כירורגיים על ידי ביצוע חתך 6-8 מ"מ בחלל הבין-קוסטלי השלישי. יש לוודא שהחתך נמצא במרחק של לפחות 2 מ"מ מגבול עצם החזה שבו נמצא עורק החזה הפנימי.
4. הכניסו ספקולום קטן של עין חולדה (ראו טבלת חומרים) בחלל הבין-קוסטלי. זה יתפקד כמסיר צלעות (איור 1A).
5. הרימו בעדינות את קרום הלב עם מלקחיים מעוקלים ומשכו אותו בנפרד.
6. מניחים חתיכת כותנה קטנה על גבי הריאה ודוחפים בעדינות כלפי מטה.

4. הכנת LAD

1. ה-LAD נראה אדום בוהק ויוצא מאבי העורקים מתחת לאאוריקל השמאלי לכיוון הקודקוד. המיקום האידיאלי עבור הרצועה נמוך בכ -2 מ"מ מקצה האוריקל השמאלי. השתמשו בגזע הריאתי כסמן כדי לעזור לזהות את האוריקל השמאלי ולמטב את הדמיית LAD באמצעות זרם אור (איור 2).
2. השתמש במחט מחודדת כדי להעביר תפר פוליפרופילן 7-0 סביב ה- LAD. אין להניח את המחט עמוק מדי, כפי שהוא יכול להיכנס לחדר השמאלי, ולא רדוד מדי, כפי שהוא יכול להזיק LAD.
3. הסר את חתיכת הכותנה הקטנה ובדוק אם הריאה השמאלית עדיין מאווררת.
4. הסר את מסיר הצלעות.
5. יש לוודא שהתפר הוא באורך מינימלי של 15 ס"מ משני קצותיו. חותכים את המחט.
6. הניחו חתיכה של צינור PE-50 בקוטר 1 מ"מ מעל חתיכה של צינורות PE-10 בקוטר 15 מ"מ (ראו טבלת חומרים). יש להנחות את שני קצוות התפר דרך צינור PE-10 ולהעביר את צינור ה-PE עם קצהו העבה כנגד הלב.

5. סגירת חזה ו extubating

1. החל קצת ג'ל חומצה fusidic על החלל intercostal פתוח בעדינות לאפשר את האוויר intrathoracic הנותר לברוח על ידי חסימה קצרה של זרימת המאוורר. ניתן להוסיף ג'ל חומצה פוסידית נוסף לחלק החיצוני של צינור PE כדי למנוע כניסת אוויר לבית החזה.
2. סגור את שריר החזה עם תפר 5-0 פוליפרופילן X מעל ומתחת לרמה של צינור PE, וודא שהחלק המעובה של צינור PE נמצא מתחת לרמה של השריר.
3. סגור את העור עם שני תפרים של 5-0 פוליפרופילן X מעל ושניים מתחת לצינור PE (איור 1B ואיור 3).
4. עם חזה סגור, החיה יכולה לנשום באופן ספונטני שוב. לגמול את בעל החיים ממכונת ההנשמה על ידי הפחתה איטית של נפח הגאות וקצב הנשימה. כאשר בעל החיים מתחיל לנשום, נתק בזהירות ספונטנית את צינור ההנשמה, אך שמור אותו במקומו עד שנצפה דפוס נשימה יציב.
5. חבר את אספקת האיזופלורן עם חרוט אף המונחת מעל אפו של בעל החיים ומקובעת על צלחת הבסיס.

6. הרכבה של כלי IR מרחוק

1. מקם את החלק הצדדי האנכי בלוח הבסיס על-ידי הכנסתו לחריצים.
2. השתמש בוו דק כדי לשלוף את שני קצוות התפרים ומשוך אותם דרך החור המרכזי בחלק הצדדי מאחורי הבלון (ראה טבלת חומרים).
3. מדריך אחד מהתפרים מסתיים מעל ומסביב לבלון. המשך עם קצה התפר השני מתחת ומסביב לבלון. יש למרוח ג'ל חומצה פוסידית להנחיה חלקה יותר של התפר.
4. יש להנחות את קצה התפר דרך החרכים שעל גבי החלק הצדדי. על החלק הדיסטלי של התפר, הפעילו משקל של 2.1 גרם כדי לשמור על כל קצה תפר במקומו (איור 1C ואיור 4).
   הערה: תצורת המשקולות המתאימות כפופה לשינויים ויש לבדוק אותה מראש. ראו תרשים משלים 1 וקובץ משלים 1 לפרטים. עיצוב כלי IRI מרחוק מסופק באיור משלים 2.

7. אינדוקציה של איסכמיה ורפרפוזיה

1. לגרום לאיסכמיה על ידי ניפוח מיידי של הבלון באמצעות משאבת הבלון כלי הדם עד 2 בר. נעל את המשאבה. בדקו ויזואלית אם הבלון מנופח והמשקולות מורמות (איור 4).
2. אשר את האיסכמיה על ידי התבוננות בשינוי בעקבות א.ק.ג.
3. השאירו את הבלון מנופח לזמן שנקבע בהתאם לפרוטוקול המחקר הספציפי (30 דקות בניסויים המוצגים).
4. עצור את החסימה פשוט על ידי פתיחת המשאבה. מנפחים את הבלון בזהירות. בדקו ויזואלית אם הבלון מנופח ומורידים משקולות.

8. פירוק כלי ה-IR המרוחק

1. חותכים את התפר והצינור בין החיה לחלק הצדדי ומסירים בזהירות את החלק הצדדי.
2. יש למרוח ג'ל חומצה פוסידית באתר החדרת הצינורית לבית החזה. השתמש במלקחיים מעוקלים כדי לדחוף בעדינות את העור כנגד הצינור והשתמש במלקחיים נוספים כדי לחלץ את הצינור. יש לחתוך כל תפר שנותר קרוב לעור.
3. מניחים תפר נוסף של 5-0 פוליפרופילן כדי לסגור את אתר היציאה של הצינור ולמזער את הסיכון לכניסת אוויר לבית החזה.

9. סוף נרקוזיס והתאוששות

1. עצור את אספקת האיזופלורן ואפשר לבעל החיים להתעורר בסביבה שקטה, חמה ועשירה בחמצן.
2. ודא שהעכבר אינו נמצא במצוקה נשימתית כלשהי על ידי התבוננות בו עד להחלמה מלאה. לספק 0.3 מ"ל של מלוחים סטריליים (בטמפרטורת הגוף) על ידי הזרקה intraperitoneal כדי למנוע התייבשות.
3. עבור שיכוך כאבים לאחר הניתוח, לנהל משכך כאבים אופיואידי (buprenorphine, 0.1 מ"ג / ק"ג) תת עורית לפני החיה הוא אמבולטורי. בדוק את העכברים כל 4-6 שעות במשך 24-48 השעות הבאות כאשר buprenorphine מסופק כדי להבטיח כי העכברים מגיבים לתרופות כאב כדי לקבוע אם תרופות כאב נוספות נדרשים. תמיכה נוספת צריכה לכלול ג'ל דיאטה סטנדרטי מומלץ לטיפול תומך או מחית המונחת על רצפת הכלוב לאחר הניתוח.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

אימות היכולת לגרום לאיסכמיה בוצע על ידי ארבע בדיקות: צביעת טריפניל טטרזוליום כלוריד (TTC) וסיריוס אדום (SR), מדידת טרופונין I לבבי והדמיית MR לשיפור גדוליניום מאוחר (LGE). מובהקות סטטיסטית הוערכה באמצעות מבחן מאן-ויטני לא פרמטרי, בהתחשב בגודל המדגם המצומצם. מובהקות סטטיסטית יוח...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

טכניקת החסימה מרחוק החדשנית שהוצגה במחקר זה מציעה פלטפורמה ייחודית לקידום המחקר בתחום מידול פציעות איסכמיה-רפרפוזיה על ידי הימנעות מהצורך במניפולציה ישירה של כלי הדם במהלך הניתוח הראשוני ומאפשרת הדמיה רב-מודאלית סימולטנית של שריר הלב הרפרפוזי המוקדם. אפיון מקיף, כולל ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-0 silk suture	Sharpoint Products	DC-2515N
5-0 polypropylene suture	Ethicon	8710H
7-0 polypropylene suture	Ethicon	8206H
ACCLARENT Balloon Inflation Device	Johnson&Johnson MedTech	BID30
Acepromazine	Kela
BD Vialon 18 G	BD	381347
BD Vialon 20 G	BD	381334
Betadine Solution	Purdue Pharma	25655-41-8
Buprenorphine (Buprenex Injectable)	Reckitt Benkiser Healthcare	NDC 12496-0757-1
Carp Zoom Styl Knijplood 2.1 g (lead fishing weights)	Visdeal.nl
Dumont #3 Forceps	Fine Science Tools	11231-30
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-30
Fine Scissors	Fine Science Tools	14040-10
Fucidine gel	Leo Pharma
Isoflurane	Abbott	NDC 5260-04-05
KD Mouse/Rat Eye Speculum	World Precision Instruments	501897
KD mouse/rat eye speculum	World Precision Instruments	501897
Ketamine	Dechra
Light source	Zeiss	KL 1500 LCD
MRI system	Bruker BioSpin, Ettlingen, Germany	BioSpec 70/30
NatriumChloride 0.9%	Baxter
Nocturnal Infrared Heat Lamp	Zoo Med Laboratories, Inc.	RS-75
ParaVision software	Bruker BioSpin	version 6.0.1
polyethylene tubing PE-10	SAI Infusion technologies	PE-10
polyethylene tubing PE-50	SAI Infusion technologies	PE-50
remote IRI tool (PMMA)	homemade
Rodent Surgical Monitor	Indus instruments
Segment v4.0	Medviso, segment.heiberg.se	R12067
Self-gated gradient echo sequence	Bruker BioSpin, Ettlingen, Germany	IntraGate, ParaVision 6.0.1
Slim Elongated Needle Holder	Fine Science Tools	12005-15
Sure-Seal Mouse/Rat Induction Chamber	World Precision Instruments	EZ-178
Tubing Connectors, Poly, Y Shape	Westlab	072025-0001
Ultraverse 035 PTA Dilatation Catheter: 5mm x 40mm, 17 ATM RBP balloon on 130 cm long catheter	Bard Peripheral Vascular, Inc.	00801741092671
Veet (depilatory creme)	Reckitt Benkiser Healthcare
Ventilator, MiniVent Model 845	Hugo Sachs	73-0043
Vidisic	BAUSCH & LOMB PHARMA	685313
Xylazine	Bayer