在自主呼吸小鼠中使用球囊导管远程触发 LAD 闭塞

摘要

本文介绍了一种独特的闭胸技术，用于诱导小鼠心肌缺血再灌注损伤 （IRI）。所提出的方法允许小鼠自主呼吸，同时远程诱导心肌缺血。这为动物提供了通过无创成像原位实时研究缺血和再灌注的动态过程的途径。

摘要

急性心肌梗死 （AMI） 是一种普遍且死亡率高的心血管疾病。尽管 AMI 的血运重建策略取得了进展，但它经常导致心肌缺血再灌注损伤 （IRI），从而放大心脏损伤。小鼠模型是研究 体内急性损伤和慢性心肌重塑的重要工具。本研究提出了一种独特的闭胸技术，用于远程诱导小鼠心肌 IRI，从而能够使用 MRI 或 PET 等体内成像研究闭塞和再灌注的非常早期阶段。该方案采用远程闭塞方法，允许精确控制胸部闭合后缺血的开始。它减少了手术创伤，实现了自主呼吸，并增强了实验的一致性。这项技术的不同之处在于它在闭塞和再灌注事件期间可以同时进行无创成像，包括超声和磁共振成像 （MRI）。它提供了一个独特的机会，可以近乎实时地分析组织反应，为缺血和再灌注过程中的过程提供关键见解。对这种创新方法进行了广泛的系统测试，测量梗死的心脏坏死标志物，使用对比增强 MRI 评估风险区域，并在瘢痕成熟阶段对梗塞进行染色。通过这些调查，重点放在了所提出的工具在推进心肌缺血再灌注损伤研究方法和加速靶向干预措施开发方面的价值。本文提出了初步结果，证明了将拟议的创新实验方案与无创成像技术相结合的可行性。这些初步结果突出了利用专用动物摇篮远程诱导心肌缺血，同时进行 MRI 扫描的好处。

引言

急性心肌梗死 （AMI） 是一种普遍的全球心血管疾病，与高死亡率和发病率相关¹。尽管技术进步为 AMI 患者提供了早期有效的血运重建策略，但在这些干预后，患者仍会出现心肌缺血再灌注损伤 （IRI）²。因此，了解缓解 IRI 的基本机制和制定方法至关重要。IRI 代表一种复杂的病理生理状态，涉及多种复杂的生物过程。这些包括调节细胞死亡、氧化应激反应、炎症、伤口愈合、纤维化和心室重塑。动物模型（如小鼠）对 IRI 研究非常重要，并因其成本效益、快速繁殖和转基因模型的丰富机制信息而被广泛使用³。

该协议提出了一种创新技术，可在胸部闭合的自主呼吸小鼠中远程诱导 IRI，更接近于人类病理学。通过使用位于距心肌一定距离处的球囊导管闭塞左前降支 （LAD） 来实现远程闭塞。这种方法可以在闭塞和再灌注的确切时刻持续进入跳动的心脏，促进同步成像方式，包括超声或磁共振成像 （MRI）。这些无创方法可以提供对闭塞和再灌注事件之前、期间和之后的组织反应的重要见解。

存在各种手术技术可以在小鼠模型中诱导 IRI。在冠状动脉结扎的开胸模型中，开胸手术引起的手术创伤会触发免疫反应，影响与缺血和再灌注相关的多种机制。先天免疫系统的激活有可能影响心肌梗死的程度⁴。拟议的改编技术提供了一种潜在的方法，用于探索心肌预处理和后调节，并通过将开放胸腔时间范围最小化至最大 5 分钟来可能减少小鼠 IRI 研究中先天免疫反应对手术创伤的影响。此外，新开发的技术还可能有助于减少呼吸机诱导的肺损伤引起的促炎后遗症⁵。然而，这种新的闭胸方法的综合影响需要进一步深入研究。

通过将所提出的技术与传统方法进行比较，对所提出的技术进行了彻底的验证，传统方法包括通过手术胸部解剖和结扎诱导的闭塞暴露 LAD 30 分钟。比较了两种技术的结果，其中包括反映心肌梗死大小的肌钙蛋白测量、使用钆对比增强 MRI 评估风险区域、组织学三苯基四唑氯化物 （TTC） 染色，以及 通过 天狼星红 （SR） 染色确定最终疤痕大小。该结果证明了所提出的方法在小鼠模型中研究缺血再灌注损伤的稳健性和有效性。

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研究方案

该动物协议已获得鲁汶天主教大学动物实验伦理委员会 （ECD） 的批准，并符合其制定的指导方针和规定。当地 ECD 制定的所有政策均遵循指令 2010/63/EU 中宣布的欧盟关于实验动物福利的规定。下面描述的所有测试均已在 8-12 周龄（体重 = 20-23 克）雄性 C57BL/6 小鼠上进行。急性实验代表了手术后立即处死的动物。生存实验代表了 4 周的随访，包括肌钙蛋白测量、MRI 和 SR 染色。

1. 麻醉和气管插管

1. 使用氯胺酮混合物（7.5 mg/kg;Nimatek 100 mg/mL）、甲苯噻嗪（1 mg/kg;仑平，20 mg/mL）和乙酰丙嗪（0.1 mg/kg;Placivet，10 mg/mL）（KXA）（见 材料表）腹膜内含 0.9% 盐水稀释剂。这允许更顺畅、侵入性更小的插管。
2. 将鼠标置于诱导室中（参见 材料表），并使用 2.5% 异氟醚在纯氧中以 1 L/min 的流速进行麻醉，直到失去扶正和脚趾捏反射。
3. 将动物转移到加热垫 （±38 °C） 中，并将其仰卧，头部朝向外科医生。用胶带在垫子上固定尾巴和前爪。确保前肢没有过度拉伸，因为这会影响呼吸。
4. 在上切牙周围放置一根 2-0 丝缝合线（参见 材料表），并将缝合线贴在垫的边缘以拉紧鼠标。如有必要，连接持针器以保持缝合线的张力。使用鼻锥在 100% 氧气中使用 2% 异氟醚以 1 L/min 的流速保持动物麻醉。
5. 将光源放在胸骨的喙部，取下鼻锥，然后将异氟醚供应放在呼吸机上。使用镊子将舌头向上抬起并握住自制喉镜，以进一步抬起舌头的基部并观察声带。
6. 使用 18 G 导管将自制气管插管放在声带之间的钝针上。向上移动导管，拔出钝针，并将管子与小鼠呼吸机连接（参见 材料表）。
7. 使用改进的 Y 形连接器（ 材料 表）将插管连接到呼吸机。气管插管的正确定位可以通过判断对称的胸部扩张来确认。
8. 将潮气量 （mL） 设置为体重 （BW） （g） x 7，通风率设置为每分钟 53.5 x （BW （g）^-0.26） 次，必要时将其调整为特定小鼠的体重⁶ （例如，对于 25 g 小鼠，潮气量为 175 mL，每分钟 140 次冲程）。
9. 在 100% 氧气中将异氟醚降至 1%，因为由于术前用药，动物将保持麻醉状态。但是，请定期通过捏住脚趾来评估麻醉深度。根据麻醉深度调整异氟醚浓度。
10. 涂抹一滴眼药膏以防止麻醉时干燥。

2. 安装 IRI 工具

注意:撕掉所有胶带，将动物放在专用 IRI 工具的底板上。 补充文件 1 中提到了 IRI 工具属性的详细信息。

1. 将专用远程 IRI 工具的底板固定在外科医生面前的侧向位置。用胶带固定尾巴和爪子。使用上门牙周围的 2-0 丝缝线固定头部，以防止意外移动（图 1）。
2. 插入直肠热探针（见 材料表）以监测体温，并在动物上方使用红外加热灯将温度保持在 37 °C 左右。 注意动物与 lamp 之间有足够的距离，以免过热。
3. 将心电图针电极放在所有四个爪子中，以观察和记录心率和心电图波形。使用胶带将直肠探头和 ECG 电极固定到平台上。
4. 在胸部左侧涂抹脱毛霜以去除毛发并创造一个清晰的手术区域。
   注意:限制使用时间并注意完全去除乳霜，以防止化学灼伤。

3. 开胸术

1. 使用 Betadine 溶液对皮肤进行无菌准备，然后在左胸腔放置手术单以确保无菌环境。使用消毒设备执行该程序。在胸肌中部做一个垂直的皮肤切口，长约 1 厘米，距离胸骨左缘 2 毫米。
2. 吐出胸肌，露出下面的肋骨。避免对船只造成意外伤害。如果发生出血，请使用棉签止血。
3. 通过薄的半透明胸壁观察膨胀的肺，使肋骨可视化并识别肋间隙。使用手术剪刀在第三肋间隙切开 6-8 毫米的切口，打开胸腔。确保切口距离胸内动脉所在的胸骨边界至少 2 毫米。
4. 在肋间隙插入一个小的大鼠窥器（见 材料表）。这将用作肋骨牵开器（图 1A）。
5. 用弯曲的镊子轻轻提起心包并将其拉开。
6. 将一小块棉花放在肺的顶部，然后轻轻向下推。

4. LAD 准备

1. LAD 呈鲜红色，从左耳廓下方的主动脉向心尖延伸。结扎的理想位置是比左耳廓尖端低约 2 毫米。使用肺干作为标记，帮助识别左耳廓并使用光流入优化 LAD 可视化（图 2）。
2. 使用锥形针将 7-0 聚丙烯缝合线穿过 LAD 周围。不要将针头放置得太深，因为它会进入左心室，也不要太浅，因为它会损坏 LAD。
3. 取出那一小块棉花，检查左肺是否还通气。
4. 拆下肋条牵开器。
5. 确保缝合线两端的最小长度为 15 厘米。剪掉针头。
6. 将一根 1 mm PE-50 管放在一根 15 mm PE-10 管上（参见 材料表）。引导缝合线的两端穿过 PE-10 管，并将较粗端的 PE 管移向心脏。

5. 胸部闭合和拔管

1. 在开放的肋间隙涂抹一些夫西地酸凝胶，轻轻地通过短暂阻塞呼吸机的流出，让剩余的胸腔内空气逸出。可以在 PE 管的外部添加额外的夫西地酸凝胶，以防止空气进入胸部。
2. 在 PE 管水平上方和下方用 5-0 聚丙烯 X 针缝合胸肌，并确保 PE 管的增厚部分低于肌肉水平。
3. 在 PE 管上方和下方分别用两针 5-0 聚丙烯 X 针和两针闭合皮肤（图 1B 和 图 3）。
4. 在闭合的胸部下，动物可以再次自主呼吸。通过缓慢减少潮气量和呼吸频率，使动物脱离呼吸机。当动物开始呼吸时，自发小心地断开呼吸机管，但要保持原位，直到观察到稳定的呼吸模式。
5. 将异氟醚供应与放置在动物鼻子上并固定在底板上的鼻锥连接。

6. 远程 IR 工具的组装

1. 将垂直侧面部分插入狭缝中，将其放入底板中。
2. 使用细钩取回两个缝合末端，并将它们拉过球囊后面侧面的中心孔（参见 材料表）。
3. 引导其中一个缝合线末端在球囊上方和周围。将球囊下方和周围的另一缝合端进行跟进。涂抹夫西地酸凝胶以更顺畅地引导缝合线。
4. 将缝合线末端穿过侧面顶部的狭缝。在缝合线的远端，施加 2.1 g 的重量以将每个缝合线末端固定到位（图 1C 和 图4）。
   注意: 适当砝码的配置可能会发生变化，并且必须事先进行测试。有关详细信息，请参见 补充图 1 和 补充文件 1 。远程 IRI 工具设计在 补充图 2 中提供。

7. 诱导缺血和再灌注

1. 通过使用血管球囊泵迅速给球囊充气来诱发缺血，最高可达 2 bar。锁上泵。目视检查球囊是否充气并且重物是否被举起（图 4）。
2. 通过观察心电图轨迹的变化来确认缺血。
3. 根据特定的研究方案（在所提出的实验中为 30 分钟），将气球充气设定的时间。
4. 只需解锁泵即可停止闭塞。小心地给气球放气。目视检查球囊是否放气和重量是否降低。

8. 拆卸远程红外工具

1. 剪断动物和侧面之间的缝合线和管子，然后小心地取下侧面。
2. 在管道插入胸部的插入部位涂抹夫西地酸凝胶。使用弯曲的镊子轻轻地将皮肤推向管子，然后使用另一把镊子拔出管子。在靠近皮肤的地方剪断任何剩余的缝合线。
3. 放置一根额外的 5-0 聚丙烯缝合线，以关闭管子的出口部位，并将空气进入胸部的风险降至最低。

9. 麻醉的结束和恢复

1. 停止异氟醚供应，让动物在安静、温暖和富氧的环境中醒来。
2. 通过观察鼠标直到完全恢复，确认它没有任何呼吸窘迫。通过腹膜内注射提供 0.3 mL 无菌生理盐水（在体温下）以防止脱水。
3. 对于术后镇痛，在动物可以走动之前皮下注射阿片类镇痛药（丁丙诺啡，0.1 mg/kg）。在接下来的 24-48 小时内，当提供丁丙诺啡时，每 4-6 小时检查一次小鼠，以确保小鼠对止痛药有反应，并确定是否需要额外的止痛药。额外的支持应包括术后在笼子地板上放置标准推荐的支持性护理饮食凝胶或麦芽浆。

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结果

通过四项测试验证了诱导缺血的能力:氯化三苯基四唑 （TTC） 和天狼星红 （SR） 染色、心肌肌钙蛋白 I 测量和晚期钆增强 （LGE） MR 成像。考虑到样本量有限，使用 Mann-Whitney 非参数检验评估统计显着性。p < 0.05 具有统计学意义。

急性实验 （TTC 染色，n = 15） 无技术失败，所有动物均被纳入。这些急性实验包括即刻随访实验 （心肌肌钙蛋白 I?...

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讨论

本研究中引入的新型远程闭塞技术提供了一个独特的平台，通过避免在初始手术期间直接操作血管并允许对早期再灌注心肌进行同步多模态成像，为推进缺血再灌注损伤建模领域的研究。全面的表征，包括肌钙蛋白-I 测量、LGE 对比 MRI、TTC 和 SR 染色，表明所提出的技术等同于当前的黄金标准（即 开胸 LAD 结扎）⁹。

与传统的"?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-0 silk suture	Sharpoint Products	DC-2515N
5-0 polypropylene suture	Ethicon	8710H
7-0 polypropylene suture	Ethicon	8206H
ACCLARENT Balloon Inflation Device	Johnson&Johnson MedTech	BID30
Acepromazine	Kela
BD Vialon 18 G	BD	381347
BD Vialon 20 G	BD	381334
Betadine Solution	Purdue Pharma	25655-41-8
Buprenorphine (Buprenex Injectable)	Reckitt Benkiser Healthcare	NDC 12496-0757-1
Carp Zoom Styl Knijplood 2.1 g (lead fishing weights)	Visdeal.nl
Dumont #3 Forceps	Fine Science Tools	11231-30
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-30
Fine Scissors	Fine Science Tools	14040-10
Fucidine gel	Leo Pharma
Isoflurane	Abbott	NDC 5260-04-05
KD Mouse/Rat Eye Speculum	World Precision Instruments	501897
KD mouse/rat eye speculum	World Precision Instruments	501897
Ketamine	Dechra
Light source	Zeiss	KL 1500 LCD
MRI system	Bruker BioSpin, Ettlingen, Germany	BioSpec 70/30
NatriumChloride 0.9%	Baxter
Nocturnal Infrared Heat Lamp	Zoo Med Laboratories, Inc.	RS-75
ParaVision software	Bruker BioSpin	version 6.0.1
polyethylene tubing PE-10	SAI Infusion technologies	PE-10
polyethylene tubing PE-50	SAI Infusion technologies	PE-50
remote IRI tool (PMMA)	homemade
Rodent Surgical Monitor	Indus instruments
Segment v4.0	Medviso, segment.heiberg.se	R12067
Self-gated gradient echo sequence	Bruker BioSpin, Ettlingen, Germany	IntraGate, ParaVision 6.0.1
Slim Elongated Needle Holder	Fine Science Tools	12005-15
Sure-Seal Mouse/Rat Induction Chamber	World Precision Instruments	EZ-178
Tubing Connectors, Poly, Y Shape	Westlab	072025-0001
Ultraverse 035 PTA Dilatation Catheter: 5mm x 40mm, 17 ATM RBP balloon on 130 cm long catheter	Bard Peripheral Vascular, Inc.	00801741092671
Veet (depilatory creme)	Reckitt Benkiser Healthcare
Ventilator, MiniVent Model 845	Hugo Sachs	73-0043
Vidisic	BAUSCH & LOMB PHARMA	685313
Xylazine	Bayer