자발적으로 호흡하는 마우스에서 풍선 카테터를 사용하여 원격으로 트리거된 LAD 폐색

요약

이 기사에서는 마우스에서 심근 허혈 재관류 손상(IRI)을 유도하기 위한 독특한 폐쇄 흉부 기술을 제시합니다. 제시된 방법은 마우스가 자발적으로 숨을 쉬면서 원격으로 심근 허혈을 유도할 수 있도록 합니다. 이를 통해 비침습적 이미징을 통해 현장에서 실시간으로 허혈 및 재관류의 동적 과정을 연구하기 위해 동물에 액세스할 수 있습니다.

초록

급성 심근경색(AMI)은 널리 퍼져 있고 사망률이 높은 심혈관 질환입니다. AMI에 대한 혈관재생술 전략의 발전에도 불구하고 심근 허혈-재관류 손상(IRI)으로 이어지는 경우가 많아 심장 손상을 증폭시킵니다. 쥐 모델은 생체 내에서 급성 손상 및 만성 심근 리모델링을 모두 조사하는 데 중요한 도구 역할을 합니다. 이 연구는 마우스에서 심근 IRI를 원격으로 유도하기 위한 고유한 폐쇄 흉부 기술을 제시하여 MRI 또는 PET와 같은 생체 내 이미징을 사용하여 폐색 및 재관류의 매우 초기 단계를 조사할 수 있도록 합니다. 이 프로토콜은 원격 교합 방법을 사용하여 흉부 폐쇄 후 허혈 시작을 정밀하게 제어할 수 있습니다. 이는 외과적 외상을 줄이고, 자발적인 호흡을 가능하게 하며, 실험의 일관성을 향상시킵니다. 이 기술을 차별화하는 것은 교합 및 재관류 이벤트 중에 초음파 및 자기 공명 영상(MRI)을 포함한 동시 비침습적 이미징이 가능하다는 것입니다. 거의 실시간으로 조직 반응을 분석할 수 있는 고유한 기회를 제공하여 허혈 및 재관류 중 과정에 대한 중요한 통찰력을 제공합니다. 이 혁신적인 접근법에 대한 광범위하고 체계적인 테스트가 수행되었으며, 경색에 대한 심장 괴사 마커를 측정하고, 조영제 강화 MRI를 사용하여 위험 영역을 평가하고, 흉터 성숙 단계에서 경색을 염색했습니다. 이러한 조사를 통해 심근 허혈 재관류 손상에 대한 연구 접근 방식을 발전시키고 표적 중재 개발을 가속화하는 데 있어 제안된 도구의 가치가 강조되었습니다. 제안된 혁신적인 실험 프로토콜과 비침습적 이미징 기법을 결합하는 타당성을 보여주는 예비 결과가 여기에 제시되어 있습니다. 이러한 초기 결과는 MRI 스캔을 수행하는 동시에 심근 허혈을 원격으로 유도하기 위해 특수 제작된 동물 요람을 활용하는 이점을 강조합니다.

서문

전 세계적으로 널리 퍼져 있는 심혈관 질환인 급성 심근경색(AMI)은 높은 사망률 및 이환율과 관련이 있습니다¹. AMI 환자를 위한 조기에 효과적인 혈관재생술을 가능하게 한 기술 발전에도 불구하고 환자는 여전히 이러한 중재 후 심근 허혈-재관류 손상(IRI)을 경험합니다². 따라서 근본적인 메커니즘을 이해하고 IRI를 완화하기 위한 접근 방식을 공식화하는 것이 중요합니다. IRI는 여러 복잡한 생물학적 과정을 포함하는 복잡한 병태생리학적 상태를 나타냅니다. 여기에는 조절된 세포 사멸, 산화 스트레스 반응, 염증, 상처 치유, 섬유증 및 심실 리모델링이 포함됩니다. 생쥐와 같은 동물 모델은 IRI 연구에 매우 중요하며, 비용 효율성, 빠른 번식 및 형질전환 모델의 풍부한 기계론적 정보로 인해 광범위하게 사용되고 있다³.

이 프로토콜은 가슴을 닫은 상태에서 자발적으로 숨을 쉬는 쥐에서 원격으로 IRI를 유도하는 혁신적인 기술을 제시하여 인간 병리학을 보다 밀접하게 모방합니다. 원격 교합은 심근에서 멀리 떨어진 곳에 위치한 풍선 카테터를 사용하여 좌측 전방 하행 동맥(LAD)을 폐색함으로써 달성되었습니다. 이 접근 방식은 폐색 및 재관류의 정확한 순간에 박동하는 심장에 지속적으로 접근할 수 있도록 하여 초음파 또는 자기 공명 영상(MRI)을 포함한 동시 이미징 방식을 용이하게 합니다. 이러한 비침습적 방법은 폐색 및 재관류 사건 전, 중, 후의 조직 반응에 대한 중요한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

쥐 모델에서 IRI를 유도하기 위한 다양한 수술 기법이 존재합니다. 관상동맥 결찰술의 개흉 모델에서 개흉술로 인한 외과적 외상은 허혈 및 재관류와 관련된 다양한 메커니즘에 영향을 미치는 면역 반응을 유발합니다. 선천면역체계의 활성화는 심근경색의 정도에 영향을 미칠 수 있는 잠재력을 가지고 있다⁴. 제안된 적응된 기술은 심근 사전 및 사후 컨디셔닝을 탐색하고 쥐 IRI 연구에서 흉부 개방 시간 프레임을 최대 5분으로 최소화하여 외과적 외상에 대한 선천성 면역 반응의 영향을 줄이기 위한 잠재적인 접근 방식을 제공합니다. 더욱이, 새로 개발된 기술은 인공호흡기에 의한 폐 손상으로 인한 전염증성 후유증을 줄이는 데에도 기여할 수 있다⁵. 그러나 이 새로운 폐쇄 흉부 방법의 복합적인 효과는 더 심층적인 연구가 필요합니다.

제안된 기술에 대한 철저한 검증은 외과적 흉부 절제술과 합자 유도 폐색을 통해 LAD를 30분 동안 노출시키는 기존 방법과 비교하여 수행되었습니다. 심장 경색 크기를 반영하는 트로포닌 측정, 가돌리늄 조영제 향상을 동반한 MRI를 사용한 위험 부위 평가, 조직학적 트리페닐 테트라졸륨 클로라이드(TTC) 염색, 시리우스 레드(SR) 염색을 통한 최종 흉터 크기 결정 등 두 기법의 결과를 비교했습니다. 이 결과는 쥐 모델에서 허혈-재관류 손상을 연구하기 위해 제안된 접근 방식의 견고성과 효능을 보여줍니다.

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프로토콜

이 동물 프로토콜은 루뱅 가톨릭 대학교(Catholic University of Leuven)의 동물 실험 윤리 위원회(ECD)에서 정한 지침 및 규정에 따라 승인되었습니다. 현지 ECD에서 개발한 모든 정책은 지침 2010/63/EU에 선언된 실험실 동물의 복지에 관한 유럽 연합의 규정을 따릅니다. 아래에 설명된 모든 테스트는 8-12주령(체중 = 20-23g) 수컷 C57BL/6 마우스를 대상으로 수행되었습니다. 급성 실험은 수술 후 즉시 희생된 동물을 나타냅니다. 생존 실험은 트로포닌 측정, MRI 및 SR 염색을 포함한 4주간의 추적 관찰을 나타냅니다.

1. 마취 및 기관내 삽관

1. 케타민(7.5mg/kg; 니마텍 100mg/mL), 자일라진(1mg/kg; Rompun, 20 mg/mL), 아세프로마진(0.1 mg/kg; Placivet, 10 mg / mL) (KXA) ( 재료 표 참조) 0.9 % 식염수 희석제 복강 내. 이를 통해 더 부드럽고 덜 침습적인 삽관이 가능합니다.
2. 마우스를 유도 챔버( 재료 표 참조)에 넣고 순수 산소에 2.5% 이소플루란을 사용하여 1L/min의 유속으로 righting 및 toe pinch reflex가 손실될 때까지 마취를 요청합니다.
3. 동물을 가열된 패드(±38°C)로 옮기고 머리를 외과 의사를 향해 누운 상태로 놓습니다. 패드에 테이프로 꼬리와 앞발을 고정합니다. 호흡을 손상시킬 수 있으므로 앞다리를 과도하게 펴지 않도록 하십시오.
4. 위쪽 앞니 주위에 2-0 실크 봉합사( 재료 표 참조)를 놓고 패드 가장자리에 봉합사를 테이프로 붙여서 마우스를 팽팽하게 당깁니다. 필요한 경우 바늘 홀더를 부착하여 봉합사의 장력을 유지합니다. 노즈콘을 사용하여 1L/min의 흐름으로 100% 산소에 2% 이소플루란을 사용하여 마취된 동물을 유지합니다.
5. 광원을 흉골 바로 앞에 놓고 노즈콘을 제거한 다음 이소플루란 공급 장치를 인공호흡기에 놓습니다. 혀를 위로 들어 올리고 자체 제작한 후두경을 들고 혀의 기저 부분을 더 들어 올리고 성대를 시각화하여 집게를 사용하여 쥐를 삽관합니다.
6. 18G 카테터를 사용하여 직접 만든 기관관을 성대 사이의 무딘 바늘에 삽입합니다. 카테터를 위로 이동하고 무딘 바늘을 추출한 다음 튜브를 마우스 인공호흡기에 연결합니다( 재료 표 참조).
7. 수정된 Y자형 커넥터( 재료 표 참조)를 사용하여 삽관 튜브를 인공호흡기에 연결합니다. 기관관의 올바른 위치는 대칭 흉부 확장을 판단하여 확인할 수 있습니다.
8. 일회 호흡량(mL)을 체중(BW)(g) x 7로, 환기율을 분당 53.5 x (BW(g)^-0.26) 스트로크로^{설정하고 필요한 경우} 특정 마우스의 체중에 맞게 조정합니다(예: 25g 마우스의 경우 일회 호흡량은 분당 140스트로크에서 175mL).
9. 이소플루란을 100% 산소에서 1%로 줄이십시오., 동물은 사전 투약으로 인해 마취 상태를 유지할 것입니다. 그러나 정기적으로 발가락 꼬집기를 수행하여 마취의 깊이를 평가하십시오. 마취 깊이에 따라 이소플루란 농도를 조정합니다.
10. 마취 상태에서 건조함을 방지하기 위해 안과 연고 한 방울을 바르십시오.

2. IRI 도구 설치

알림: 모든 테이프를 제거하고 동물을 특수 제작된 IRI 도구의 베이스 플레이트에 놓습니다. IRI 도구의 속성에 대한 자세한 내용은 보충 파일 1에 설명되어 있습니다.

1. 특수 제작된 원격 IRI 도구의 베이스 플레이트를 외과 의사 앞의 옆으로 고정합니다. 테이프를 사용하여 꼬리와 발을 고정하십시오. 우발적인 움직임을 방지하기 위해 위쪽 앞니 주위에 2-0 실크 봉합사를 사용하여 머리를 고정합니다(그림 1).
2. 직장 열 프로브( 재료 표 참조)를 삽입하여 체온을 모니터링하고 적외선 가열 램프를 사용하여 동물 위에 AMP 온도를 약 37°C로 유지합니다. 과열을 방지하기 위해 동물과 램프 사이의 충분한 거리에 주의하십시오.
3. ECG 바늘 전극을 네 발 모두에 배치하여 심박수와 ECG 파형을 관찰하고 기록합니다. 테이프를 사용하여 직장 프로브와 ECG 전극을 플랫폼에 고정합니다.
4. 흉부 왼쪽에 제모 크림을 바르면 제모가 제거되고 투명한 수술 부위가 만들어집니다.
   알림: 화학적 화상을 방지하기 위해 적용 시간을 제한하고 크림이 완전히 제거되도록 주의하십시오.

3. 흉강절개술

1. Betadine Solution을 사용하여 피부의 무균 준비를 수행한 후 왼쪽 흉부에 수술용 드레이프를 놓아 멸균 환경을 보장합니다. 멸균된 장비를 사용하여 절차를 수행하십시오. 가슴 근육의 중간 부분을 약 1cm 길이, 왼쪽 흉골 경계에서 2mm 떨어진 곳에서 수직으로 피부를 절개합니다.
2. 가슴 근육을 뱉어 아래의 갈비뼈를 노출시킵니다. 선박의 우발적인 부상을 피하십시오. 출혈이 발생하면 면 어플리케이터를 사용하여 출혈을 멈추십시오.
3. 갈비뼈를 시각화하고 얇고 반투명한 흉벽을 통해 팽창하는 폐를 관찰하여 늑간 공간을 식별합니다. 수술용 가위를 사용하여 세 번째 늑간 공간을 6-8mm 절개하여 흉강을 엽니다. 절개 부위가 흉부 내동맥이 있는 흉골 경계에서 최소 2mm 이상 떨어져 있는지 확인합니다.
4. 늑간 공간에 작은 쥐 눈 검경( 재료 표 참조)을 삽입합니다. 이것은 리브 견인기로 작동합니다(그림 1A).
5. 구부러진 집게로 심낭을 부드럽게 들어 올려 분리합니다.
6. 작은 솜 조각을 폐 위에 놓고 부드럽게 아래로 밀어 내립니다.

4. LAD 준비

1. LAD는 밝은 빨간색으로 보이며 왼쪽 귓바퀴 아래의 대동맥에서 정점을 향해 뻗어 있습니다. 합자의 이상적인 위치는 왼쪽 귓바퀴의 끝보다 약 2mm 낮습니다. 폐 줄기를 마커로 사용하면 왼쪽 귓바퀴를 식별하고 빛 유입을 사용하여 LAD 시각화를 최적화하는 데 도움이 됩니다(그림 2).
2. 테이퍼 바늘을 사용하여 LAD 주위에 7-0 폴리프로필렌 봉합사를 통과시킵니다. 바늘은 좌심실에 들어갈 수 있으므로 너무 깊게 놓지 말고 LAD를 손상시킬 수 있으므로 너무 얕게 놓지 마십시오.
3. 작은 솜 조각을 제거하고 왼쪽 폐가 여전히 환기되고 있는지 확인하십시오.
4. 리브 견인기를 제거합니다.
5. 봉합사의 양쪽 끝이 최소 15cm 길이인지 확인하십시오. 바늘을 자릅니다.
6. 1mm PE-50 튜브 조각을 15mm PE-10 튜브 조각 위에 놓습니다( 재료 표 참조). 봉합사의 양쪽 끝을 PE-10 튜브를 통해 안내하고 더 두꺼운 끝이 있는 PE 튜브를 심장에 대고 이동합니다.

5. 가슴 폐쇄 및 발관

1. 열린 늑간 공간에 약간의 푸시딕산 젤을 바르고 인공호흡기의 유출을 잠시 막아 남아 있는 흉곽 내 공기가 부드럽게 빠져나갈 수 있도록 합니다. 공기가 흉부로 들어가는 것을 방지하기 위해 PE 튜브의 외부 부분에 추가 푸시딕 산 젤을 추가할 수 있습니다.
2. PE 튜브 높이 위아래로 5-0 폴리프로필렌 X 스티치로 가슴 근육을 닫고 PE 튜브의 두꺼운 부분이 근육 높이 아래에 있는지 확인합니다.
3. PE 튜브 위와 아래 2개의 5-0 폴리프로필렌 X 스티치로 피부를 닫습니다(그림 1B 및 그림 3).
4. 가슴을 닫으면 동물은 다시 자발적으로 숨을 쉴 수 있습니다. 일회 호흡량과 호흡수를 천천히 줄여 인공호흡기에서 동물을 떼어냅니다. 동물이 숨을 쉬기 시작하면 자발적으로 인공호흡기 튜브를 조심스럽게 분리하되 안정적인 호흡 패턴이 관찰될 때까지 제자리에 두십시오.
5. 이소플루란 공급 장치를 동물의 코 위에 놓고 베이스 플레이트에 고정하는 노즈콘과 연결합니다.

6. 원격 IR 도구 조립

1. 수직 측면 부분을 슬릿에 삽입하여 베이스 플레이트에 놓습니다.
2. 가는 고리를 사용하여 두 개의 봉합사 끝을 잡고 풍선 뒤의 측면 부분에 있는 중앙 구멍을 통해 당깁니다( 재료 표 참조).
3. 풍선 위와 주변에서 봉합사 끝 중 하나를 안내합니다. 풍선 아래와 주변의 다른 봉합사 끝을 따르십시오. 봉합사를 더 부드럽게 안내하기 위해 푸시딕 애씨드 젤을 바르십시오.
4. 측면 부분 상단의 슬릿을 통해 봉합사 끝을 안내합니다. 봉합사의 말단 부분에 2.1g의 무게를 가하여 각 봉합사 끝을 제자리에 유지합니다(그림 1C 및 그림 4).
   알림: 적절한 분동의 구성은 변경될 수 있으며 사전에 테스트해야 합니다. 자세한 내용은 보충 그림 1 및 보충 파일 1 을 참조하십시오. 원격 IRI 도구 설계는 보충 그림 2에 나와 있습니다.

7. 허혈 유도 및 재관류

1. 혈관 풍선 펌프를 사용하여 최대 2bar까지 풍선을 즉시 팽창시켜 허혈을 유도합니다. 펌프를 잠급니다. 풍선이 부풀어 오르고 무게가 들어 올려져 있는지 육안으로 확인합니다(그림 4).
2. ECG 추적의 변화를 관찰하여 허혈을 확인합니다.
3. 특정 연구 프로토콜에 따라 설정된 시간(제시된 실험에서 30분) 동안 풍선을 부풀린 상태로 두십시오.
4. 펌프의 잠금을 해제하기만 하면 폐색을 중지할 수 있습니다. 풍선을 조심스럽게 수축시킵니다. 풍선이 수축되고 무게가 내려 갔는지 육안으로 확인하십시오.

8. 원격 IR 도구 분해

1. 동물과 옆 부분 사이의 봉합사와 튜브를 자르고 옆 부분을 조심스럽게 제거합니다.
2. 튜브의 삽입 부위에 fusidic acid gel을 흉부에 바릅니다. 구부러진 집게를 사용하여 피부를 튜브에 부드럽게 밀어 넣고 다른 집게를 사용하여 튜브를 추출합니다. 남아 있는 봉합사를 피부 가까이에서 자릅니다.
3. 5-0 폴리프로필렌의 추가 봉합사를 배치하여 튜브의 출구 부위를 닫고 흉부로의 공기 유입 위험을 최소화합니다.

9. 마취의 종료와 회복

1. 이소플루란 공급을 중단하고 동물이 조용하고 따뜻하며 산소가 풍부한 환경에서 깨어날 수 있도록 하십시오.
2. 완전히 회복될 때까지 마우스를 관찰하여 호흡 곤란이 없는지 확인합니다. 탈수를 방지하기 위해 복강 내 주사로 0.3mL의 멸균 식염수(체온 기준)를 제공합니다.
3. 수술 후 진통을 위해 동물이 보행하기 전에 오피오이드 진통제(부프레노르핀, 0.1mg/kg)를 피하로 투여합니다. 부프레노르핀이 제공되면 다음 24-48시간 동안 4-6시간마다 마우스를 확인하여 마우스가 진통제에 반응하고 있는지 확인하고 추가 진통제가 필요한지 확인합니다. 추가 지원에는 수술 후 케이지 바닥에 놓는 표준 권장 지원 치료 식단 젤 또는 매쉬가 포함되어야 합니다.

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결과

허혈 유도 능력에 대한 검증은 트리페닐 테트라졸륨 클로라이드(TTC) 및 시리우스 레드(SR) 염색, 심장 트로포닌 I 측정, LGE(Late gadolinium enhancement) MR 영상의 4가지 테스트로 수행되었습니다. 통계적 유의성은 제한된 표본 크기를 고려하여 Mann-Whitney 비모수 검정을 사용하여 평가되었습니다. 통계적 유의성은 p < 0.05에 기인하였다.

급성 실험(TTC 염색...

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토론

이 연구에서 소개된 새로운 원격 교합 기술은 초기 수술 시 직접적인 혈관 조작의 필요성을 피하고 초기 재관류 심근의 동시 다중 모드 이미징을 허용함으로써 허혈 재관류 손상 모델링 분야의 연구를 발전시킬 수 있는 고유한 플랫폼을 제공합니다. 트로포닌-I 측정, LGE 조영제 MRI, TTC 및 SR 염색을 포함한 포괄적인 특성 분석은 제안된 기술이 현재의 황금 표준(즉, ?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-0 silk suture	Sharpoint Products	DC-2515N
5-0 polypropylene suture	Ethicon	8710H
7-0 polypropylene suture	Ethicon	8206H
ACCLARENT Balloon Inflation Device	Johnson&Johnson MedTech	BID30
Acepromazine	Kela
BD Vialon 18 G	BD	381347
BD Vialon 20 G	BD	381334
Betadine Solution	Purdue Pharma	25655-41-8
Buprenorphine (Buprenex Injectable)	Reckitt Benkiser Healthcare	NDC 12496-0757-1
Carp Zoom Styl Knijplood 2.1 g (lead fishing weights)	Visdeal.nl
Dumont #3 Forceps	Fine Science Tools	11231-30
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-30
Fine Scissors	Fine Science Tools	14040-10
Fucidine gel	Leo Pharma
Isoflurane	Abbott	NDC 5260-04-05
KD Mouse/Rat Eye Speculum	World Precision Instruments	501897
KD mouse/rat eye speculum	World Precision Instruments	501897
Ketamine	Dechra
Light source	Zeiss	KL 1500 LCD
MRI system	Bruker BioSpin, Ettlingen, Germany	BioSpec 70/30
NatriumChloride 0.9%	Baxter
Nocturnal Infrared Heat Lamp	Zoo Med Laboratories, Inc.	RS-75
ParaVision software	Bruker BioSpin	version 6.0.1
polyethylene tubing PE-10	SAI Infusion technologies	PE-10
polyethylene tubing PE-50	SAI Infusion technologies	PE-50
remote IRI tool (PMMA)	homemade
Rodent Surgical Monitor	Indus instruments
Segment v4.0	Medviso, segment.heiberg.se	R12067
Self-gated gradient echo sequence	Bruker BioSpin, Ettlingen, Germany	IntraGate, ParaVision 6.0.1
Slim Elongated Needle Holder	Fine Science Tools	12005-15
Sure-Seal Mouse/Rat Induction Chamber	World Precision Instruments	EZ-178
Tubing Connectors, Poly, Y Shape	Westlab	072025-0001
Ultraverse 035 PTA Dilatation Catheter: 5mm x 40mm, 17 ATM RBP balloon on 130 cm long catheter	Bard Peripheral Vascular, Inc.	00801741092671
Veet (depilatory creme)	Reckitt Benkiser Healthcare
Ventilator, MiniVent Model 845	Hugo Sachs	73-0043
Vidisic	BAUSCH & LOMB PHARMA	685313
Xylazine	Bayer