نموذج العنقوص بعد الجراحة

Summary

نصف نموذج الفئران للعلص بعد الجراحة الناتج عن التلاعب المعوي. تم تقييم وظيفة العبور المعدي المعوي والتغيرات المرضية وتنشيط الخلايا المناعية بعد 24 ساعة من الجراحة.

Abstract

يعاني معظم المرضى من علاوة ما بعد الجراحة (POI) بعد الجراحة ، والتي ترتبط بزيادة المراضة والوفيات ووقت الإقامة في المستشفى. POI هو نتيجة للتلف الميكانيكي أثناء الجراحة ، مما يؤدي إلى اضطراب الحركة في الجهاز الهضمي. ترتبط آليات POI بالحساسية العصبية الشاذة ، وضعف وظيفة الحاجز الظهاري ، وزيادة الالتهاب الموضعي. ومع ذلك ، لا تزال التفاصيل غامضة. لذلك ، تعتبر نماذج الفئران التجريبية ضرورية لتوضيح الفيزيولوجيا المرضية وآلية إصابة POI ولتطوير علاجات جديدة.

هنا ، نقدم نموذج الفئران ل POI الناتج عن طريق التلاعب المعوي (IM) الذي يشبه الجراحة السريرية. يتم تحقيق ذلك عن طريق التلف الميكانيكي للأمعاء الدقيقة عن طريق تدليك البطن 1-3 مرات بقطعة قطن. تأخر التدفق العضلي في العبور المعدي المعوي بعد 24 ساعة من الجراحة ، كما تم تقييمه من خلال اكتشاف تزقيم FITC-dextran والكشف الفلوري عن الجهاز الهضمي القطعي. علاوة على ذلك ، تم فحص تورم الأنسجة في تحت الغشاء المخاطي وتسلل الخلايا المناعية عن طريق تلطيخ الهيماتوكسيلين واليوزين وقياس التدفق الخلوي. يعد الضغط المناسب للعضلة العضلية وتأثير فرط الدم على الأمعاء أمرا بالغ الأهمية لهذا الإجراء. يمكن استخدام نموذج الفئران هذا من POI لدراسة آليات تلف الأمعاء والتعافي بعد جراحة البطن.

Introduction

العلوص بعد الجراحة (POI) هو متلازمة تشكل تحديا كبيرا في مجال صحة الإنسان ، لا سيما في إدارة المرضى الذين يخضعون لجراحة في البطن. يتميز POI بتأخر التعافي من حركة الجهاز الهضمي ، ويساهم في الإقامة الطويلة في المستشفى وزيادة تكاليف الرعاية الصحية ، ومع ذلك لا يوجد تعريف أو مسببات أو علاج^{محدد 1}. سلطت الأبحاث الحديثة الضوء على الدور المحوري للخلايا المناعية في تطور POI^2،3،4 ، ومع ذلك هناك حاجة إلى مزيد من التحقيق لتوضيح الآليات الأساسية المعنية.

في هذا البروتوكول ، نقدم نموذج الفئران ل POI الناجم عن الجراحة داخل البطن ، والذي يحاكي عن كثب تأثير جراحة البطن على الجهاز الهضمي. كان هدفنا هو توفير طريقة موحدة لنمذجة POI في الفئران ، مما يمكن الباحثين من التحقيق في الفيزيولوجيا المرضية واستكشاف التدخلات العلاجية الجديدة.

يكمن الأساس المنطقي وراء تطوير هذه التقنية واستخدامها في الحاجة إلى نماذج ما قبل السريرية الموثوقة لدراسة POI. غالبا ما تفتقر الأساليب التقليدية لدراسة POI إلى الأهمية الانتقالية أو تفشل في التقاط التفاعل المعقد للعوامل التي تساهم في الحالة. من خلال تقديم نموذج الفئران الذي يكرر السيناريو السريري عن كثب ، يمكن للباحثين التحقيق بدقة أكبر في الآليات الكامنة وراء نقطة الاهتمام واختبار التدخلات العلاجية المحتملة في بيئة تجريبية خاضعة للرقابة.

بالمقارنة مع التقنيات البديلة ، فإن نموذج الفئران ل POI المقدم في هذا البروتوكول يوفر العديد من المزايا. في البداية ، قمنا بدمج النتائج التجريبية التي توصلنا إليها مع التطورات الحديثة لإنشاء بروتوكول موحد وقابل للتكرار لحث POI في التجارب. يسهل هذا البروتوكول التقييم المتسق لوظيفة العبور المعدي المعوي. ثانيا ، مكن استخدام التلوين النسيجي وقياس التدفق الخلوي من تقييم تورم الأنسجة وتكاثر الخلايا المناعية وتنشيطها ، مما أدى إلى رؤى قيمة حول العمليات الالتهابية الكامنة وراء POI⁵.

في السياق الأوسع للأدبيات ، يساهم إنشاء نموذج الفئران ل POI في توسيع مجموعة الأبحاث التي تهدف إلى فهم الفيزيولوجيا المرضية لهذه الحالة. من خلال سد الفجوة بين العلوم الأساسية والممارسة السريرية ، تلعب النماذج قبل السريرية دورا محوريا في تطوير استراتيجيات علاجية جديدة ل POI⁶. علاوة على ذلك ، فإن توافر النماذج الحيوانية الموحدة يعزز قابلية استنساخ نتائج البحث وقابليتها للمقارنة عبر المختبرات المختلفة. ومع ذلك ، يعتمد نموذج POI هذا على التحفيز الميكانيكي أثناء العملية الجراحية. قد لا تكون الأشكال الأخرى من العلوص الناجم عن التحفيز مناسبة لهذا النموذج. بالإضافة إلى ذلك ، يجب على الباحثين مراعاة عوامل مثل لوائح رعاية والاعتبارات الأخلاقية وتوافر الموارد عند التخطيط للتجارب باستخدام هذا النموذج.

باختصار ، يشير إدخال نموذج الفئران ل POI إلى تقدم جدير بالملاحظة في البحث قبل السريري حول هذه الحالة المنهكة. بالإضافة إلى ذلك ، استخدمنا تلطيخ H & E وقياس التدفق الخلوي لتقييم تورم الأنسجة وتكاثر الخلايا المناعية وتنشيطها. ومن شأن إنشاء نموذج نقطة اهتمام الفئران أن يسهل اكتشاف آليات إثبات الاهتمام وتعزيز تطوير علاجات جديدة لنقطة الاهتمام.

Protocol

أجريت رعاية والإجراءات التجريبية وفقا للمبادئ التوجيهية في رعاية واستخدامها (الصين) وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة مراجعة الأخلاقيات في مستشفى الصداقة في بكين (رقم 20-2056). تم استخدام C57BL / 6 فئران (8-12 أسبوعا) للدراسة.

1. التحضير للجراحة

1. قم بتسريع جميع الفئران لمدة 12 ساعة قبل النمذجة المخطط لها لتلبية توحيد الظروف التجريبية (الشكل 1 أ).
2. تحضير وتعقيم الأدوات الجراحية.
3. تحضير مخدر ثلاثي بروموإيثانول ووسادة التدفئة. راقب وسادة التسخين لمنع ارتفاع درجة الحرارة واحتفظ بها عند درجة حرارة ثابتة (37.5 درجة مئوية).

2. التخدير

1. تخدير كل فأر باستخدام ثلاثي البروم الإيثانول.
   1. تمييع ثلاثي بروموإيثانول لتحضير محلول 20 مجم / مل في محلول ملحي عادي. قم بإعطاء 0.2 مل من محلول عمل ثلاثي بروموإيثانول لكل 10 جم من وزن الجسم عن طريق الحقن داخل الصفاق. استخدم مرهم العيون على عيون الفئران لمنع الجفاف أثناء التخدير.
   2. تأكد من تخدير الفئران تماما في غضون 5 دقائق والبقاء مخدرا لمدة 20 دقيقة.
2. قم بتقييم عمق التخدير من خلال ملاحظة عدم قدرة الفأر على البقاء في وضع مستقيم والتحقق من استرخاء العضلات. لاحظ فقدان الحركة الإرادية ، وانعكاس الوميض ، والاستجابة للتحفيز الانعكاسي (قرصة إصبع القدم أو الذيل بضغط قوي).
3. تقييم معدل التنفس ونمط الفأر من خلال مراقبة حركة جدار الصدر والبطن. تأكد من أن معدل التنفس ~ 55-65 نفسا / دقيقة تحت التخدير الأمثل.
4. ضع الماوس المخدر على لوح وثبته بشريط لاصق.
5. بعد تخدير الفئران تماما ، استخدم ماكينة حلاقة كهربائية لإزالة الشعر من البطن. بعد الحلاقة ، امسح كل الشعر المتساقط على البطن باستخدام كرة قطنية مبللة بالمحلول الملحي.
   ملاحظة: تأكد من التهوية المناسبة واستخدام غطاء الدخان أو خزانة السلامة الحيوية عند التعامل مع ثلاثي البروم الإيثانول لتقليل مخاطر التعرض. أثناء الإجراء ، ارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة ، بما في ذلك القفازات ومعاطف المختبر ، لمنع التلامس العرضي مع المواد الكيميائية والمواد البيولوجية.

3. الجراحة

1. مد الأطراف بالكامل لفضح البطن. تأكد من وضع رأس الماوس للحفاظ على مجرى هواء واضح (الشكل 1 ب).
2. تطهير جلد المنطقة الجراحية مرتين باستخدام كرة قطنية مبللة بالكحول بنسبة 75٪. بعد التطهير ، استخدم شاشا طبيا جافا ومعقما لإزالة الكحول الزائد من البطن. يتم تطبيق الليدوكائين (10 ملغ/كغ، تحت الجلد) في المكان المقصود قبل الشق.
3. استخدم مشرطا معقما لعمل شق في الجلد ورفع العضلة المستقيمة البطنية في منتصف البطن باستخدام الملقط.
   1. قم بعمل شق صغير على طول الخط المتوسط لعضلة البطن المستقيمة ، مع الحرص على تجنب إصابة الأعضاء المختلفة في البطن.
   2. تأكد من أن النطاق التقريبي للشق هو كما يلي. تأكد من أن الهامش العلوي للشق هو 6-8 مم من عملية الخنجري للقص ، والهامش السفلي هو 6-8 مم من الأعضاء التناسلية الخارجية ، وطول الشق ~ 1 سم.
4. ضع قطعة من الستارة الجراحية المعقمة أو الشاش المعقم على جانبي شق البطن. استخدم ملقط مرقئ لتثبيت الشاش المعقم على الحواف العلوية والسفلية للشق ، مما يؤدي إلى تعريض الشق (الشكل 1C).
   ملاحظة: في المجموعة الوهمية ، تم تغطية الشق بشاش مبلل لمدة 5 دقائق دون أي عملية جراحية.
5. قم بتثبيت الستارة أو الشاش المعقم بشكل صحيح ، ثم استخدم مسحات قطنية مبللة مسبقا بالمحلول الملحي للضغط برفق على جانبي جدار البطن المجاور للشق. اعصر كمية صغيرة من الأنبوب المعوي من خلال الشق وقم بفضحه عن طريق وضعه على الستارة المعقمة أو الشاش (الشكل 1 د).
6. بلل قطعتين قطنيتين معقتين تماما بمحلول ملحي عادي. أمسك أنسجة الأمعاء برفق باستخدام مسحات القطن المبللة وقم بإزالة الأمعاء الدقيقة بعناية.
   1. حدد موقع القي ثم أخرج الأمعاء بمسحات القطن المعقمة حتى 2 سم قبل المعدة لتجنب لمس البنكرياس. مد الأمعاء من الطرف القريب من رباط البنكرياس والاثني عشر إلى الطرف البعيد من المنطقة اللفائفية.
7. استخدم ضغطا ثابتا على طول الأمعاء الدقيقة بأكملها من الأطراف القريبة إلى الأطراف البعيدة. تأكد من تطبيق قوة موحدة لمدة 5 دقائق حتى تظهر بقع نزيف صغيرة على سطح الأمعاء (الشكل 1 ه).
8. بعد 5 دقائق ، استخدم مسحات قطنية معقمة مبللة مسبقا لوضع جميع الأمعاء الدقيقة بعناية في تجويف البطن ، باتباع الوضع التشريحي الفسيولوجي الطبيعي للأمعاء الدقيقة.
9. قم بتدليك البطن برفق عبر الشاش المعقم وجدار البطن لمدة 3-5 ثوان لضمان استعادة الأمعاء إلى وضعها التشريحي الطبيعي ولمنع انسداد الأمعاء الميكانيكي الاصطناعي أو الالتواء المساريقي بعد الجراحة.
10. حقن 100 ميكرولتر من المحلول الملحي في تجويف البطن لتعويض السوائل المفقودة أثناء العملية وتليين أنسجة البطن.
11. أغلق البطن باستخدام خياطة جراحية 6-0 وقم بإغلاق طبقتين عند شق البطن. ابدأ بإغلاق طبقة العضلات بخيوط مستمرة ، مع الحرص على تجنب تلف أعضاء البطن. ارفع عضلة البطن المستقيمة أثناء الخياطة (الشكل 1F).
12. بعد إغلاق عضلة البطن المستقيمة تماما ، قم بخياطتها بالكامل باستخدام خيوط بسيطة متقطعة باستخدام خياطة جراحية 6-0. حافظ على طول غرزة ~ 0.5 مم وتباعد إبرة ~ 2 مم.
13. بعد إغلاق شق البطن ، امسح المنطقة القريبة من الشق برفق بشاش طبي جاف معقم لإبقائها جافة ونظيفة من الدم أو سوائل الأنسجة أو المحلول الملحي العادي.
14. ضع كمية صغيرة من لاصق الشق الطبي على الشق وحوله لتجنب الانقسام بعد الجراحة.
15. بعد أن يجف لاصق الشق الطبي تماما ، انقل الفئران إلى منشفة ورقية ، وضع المنشفة الورقية للقفص على بطانية ساخنة يتم الحفاظ عليها عند درجة حرارة ثابتة تبلغ 37.5 درجة مئوية حتى تتعافى الفئران تماما. لا تترك دون رقابة حتى تستعيد وعيها الكافي للحفاظ على الاستلقاء القصي.
16. انقل الفئران المستيقظة إلى بيئة حاجز تغذية واسمح لها بالشرب بحرية حتى وقت الكشف.

4. فحص العبور المعدي المعوي

1. إعطاء 200 ميكرولتر من محلول FITC-dextran (5 مجم / مل في PBS) للفئران الصائمة عن طريق التزقيم بعد 22.5 ساعة من الجراحة (الشكل 1 أ).
2. قتل الفئران رحيما باستخدام طريقة وافقت عليها اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامها (IACUC) ، مثل استنشاق ثاني أكسيد الكربون₂ متبوعا بخلع عنق الرحم.
   1. لعزل الجهاز الهضمي ، قم بعمل شق خط الوسط من الحجاب الحاجز إلى الحوض ، وإزالة الأنسجة الضامة والأعضاء المحيطة بعناية.
   2. افصل الجهاز الهضمي عن الأنسجة والأعضاء المحيطة ، مع التأكد من تضمين الجهاز بأكمله من المعدة إلى فتحة الشرج.
3. قسم الجهاز الهضمي إلى 15 جزءا متساويا (من المعدة إلى القولون) ، مرقمة بالتتابع من 1 إلى 15 بناء على الموضع الفسيولوجي (التسلسل: St -S1: S10-Ce-L1: L3) (الشكل 2 أ).
4. قم بتقطيع كل جزء من أنسجة الأمعاء بمحتواه إلى قطع بقياس 1-4 مم وضعها في أنابيب طرد مركزي منفصلة سعة 1.5 مل تحتوي على 1 مل من DPBS.
5. دوامة أنابيب الطرد المركزي لمدة 10 ثوان لتجانس العينات.
6. الطرد المركزي الأنابيب عند 500 × غرام لمدة 1 دقيقة. اجمع المادة الطافية لقياس كمية التألق FITC باستخدام قارئ صفيحة دقيقة متعدد الأوضاع.
7. صف العبور المعدي المعوي عن طريق حساب المركز الهندسي (GC) ل FITC-dextran والحساب باستخدام الصيغة التالية: (Σ [٪ FITC لكل قطعة × رقم مقطع]) / 100.

5. تضمين البارافين وتلوين الهيماتوكسيلين والأيوزين (HE)

1. القتل الرحيم للفئران عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون₂ متبوعا بخلع عنق الرحم بعد 24 ساعة. قم بإجراء فحوصات تضمين البارافين والجهاز الهضمي على نفس.
2. افتح تجويف البطن واجمع أنسجة الأمعاء الدقيقة لمزيد من التحليل.
3. قم بإصلاح الأمعاء بأكملها بمحتوى معوي في مثبت كارنوي (60٪ ميثانول + 10٪ حمض الأسيتيك + 30٪ كلوروفورم) عند 4 درجات مئوية لمدة ساعتين.
4. قم بإزالة حموضة الأنسجة عن طريق شطفها مرتين بالميثانول لمدة 30 دقيقة في كل مرة.
5. استبدل الميثانول بالإيثانول مرتين لمدة 30 دقيقة في كل مرة.
6. قم بإزالة حموضة الأنسجة عن طريق شطفها مرتين بالميثانول لمدة 30 دقيقة في كل مرة. لتحقيق شفافية الأنسجة باستخدام الزيلين ، اغمر الأنسجة في الزيلين واحتضن لمدة 1 ساعة.
7. قم بتضمين الأنسجة في شمع البارافين باستخدام آلة تضمين البارافين. قطع الأنسجة المضمنة إلى شرائح بسمك 4 ميكرومتر باستخدام ميكروتوم.
   ملاحظة: قسم الأمعاء الدقيقة إلى شموع مختلفة لتحسين الأداء. قم بتسمية المقاطع بشكل صحيح لتحديد موقعها.
8. قم بإجراء تلطيخ HE باستخدام مجموعة تلطيخ HE. أغلق الشرائح وفحصها تحت المجهر لتحليلها.

6. عزل الخلايا المناعية وقياس التدفق الخلوي

1. تحضير الحلول التالية.
   1. محلول ما قبل الهضم: قم بإعداد محلول الملح المتوازن من هانك بدون Ca²⁺ و Mg²⁺ مع 1 ملي مولار من dithiothreitol (DTT) و 10 ملي مولار من حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA).
   2. محلول الهضم: قم بإعداد محلول يحتوي على 200 ميكروغرام / مل DNAase I و 500 ميكروغرام / مل كولاجيناز IV و 4٪ FBS و 100 ميكرومتر عازلة HEPES في RPMI 1640.
   3. المخزن المؤقت لأعمال فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا (MACS): قم بإعداد مخزن مؤقت يحتوي على 5 جم / لتر BSA و 2 ملي مولار EDTA في PBS بدون Ca²⁺ أو Mg²⁺.
2. قم بإزالة محتويات البراز عن طريق غسل الأمعاء بالمحلول الملحي العادي. قم بإزالة بقع باير والنسيج الضام للأمعاء الدقيقة. اقطع الأمعاء الدقيقة مفتوحة طوليا ثم قطعها إلى شرائح بحجم 1 سم في PBS مثلج.
3. اغسل أجزاء الأمعاء بمحلول ما قبل الهضم عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة على شاكر مداري. اجمع محلول ما قبل الهضم وقم بتصفيته من خلال مصافي خلايا 70 ميكرومتر للحصول على الخلايا الليمفاوية داخل الظهارة (IELs).
4. هضم الأجزاء الموجودة في محلول الهضم لمدة 30 دقيقة ثم قم بتصفية المعلق من خلال مصافي خلايا 70 ميكرومتر للحصول على الخلايا الليمفاوية الصفيحية المخصوصة (LPLs).
5. قم بالطرد المركزي لخلايا LPL عند 500 × جم لمدة 10 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية.
6. اغسل الخلايا وعلقها باستخدام DPBS (أزيد الصوديوم ، تريس ، وخالي من البروتين) بتركيز 1 × 10⁶ خلايا / 100 ميكرولتر.
7. احتضان الخلايا بصبغة الفلورسنت للبقاء (1: 500) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) في الظلام.
8. قم بتعليق الخلايا باستخدام المخزن المؤقت MACS وقم بطردها عند 500 × جم لمدة 5 دقائق.
9. عد الخلايا الملطخة باستخدام مقياس كثافة الدم أو عداد الخلايا الآلي. أعد تعليق الخلايا بتركيز 1 × 10⁶ خلايا / 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت MACS. قم بتلطيخ الأجسام المضادة (1: 200-1: 400) عن طريق إضافة الحجم المناسب من الجسم المضاد إلى تعليق الخلية واحتضانه عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة.
10. اغسل الخلايا كما هو موضح في الخطوة 6.8.
11. اكتشف العينات باستخدام قياس التدفق الخلوي وحلل البيانات باستخدام برنامج قياس التدفق الخلوي المرتبط^7،8.

النتائج

في هذا البروتوكول ، تم إحداث POI جراحيا عن طريق التلاعب المعوي (IM) ، والذي يشبه تأثير الجراحة السريرية. في المجموعة الوهمية ، تم إجراء شق بدون IM. تم التضحية بفئران POI بعد 24 ساعة من جراحة POI جنبا إلى جنب مع الفئران الوهمية للتحكم في الوهم. تم الكشف عن الوظيفة الحرجة للجهاز الهض?...

Discussion

يعتمد نجاح الجراحة على عدة خطوات حاسمة. أولا ، يعد الحفاظ على الاتساق أثناء الجراحة داخل الأمعاء (IM) أمرا ضروريا لإحداث إصابة واسعة النطاق للأمعاء الدقيقة. يعد الضغط المناسب المطبق أثناء إجراء العضل العضلي والتأثير الناتج عن فرط الدم على الأمعاء أمرا بالغ الأهمية لنجاح ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M HEPES	Thermo	15630080
APC anti-mouse I-A/I-E (MHC-II)	Biolegend	107614
APC anti-mouse TCRb	Biolegend	109212
APC/Cy7 anti-mouse CD4	Biolegend	100414
APC/Cy7 anti-mouse Ly6G	Biolegend	127624
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD69	Biolegend	104545
Brilliant Violet 421 anti-mouse F4/80	Biolegend	123132
Brilliant Violet 785 anti-mouse/human CD44	Biolegend	103041
BUV395 anti-mouse CD8a	BD	563786
BUV737 anti-mouse CD3e	BD	612771
Collagenase IV	Sigma-Aldrich	C5138
Culture Microscope	CKX53	Olympus
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase I)	Sigma-Aldrich	DN25-5G
DL-Dithiothreitol solution	Sigma-Aldrich	43816-10ML
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS-100G
FITC anti-mouse CD45	Biolegend	147709
FITC-dextran (70 kWM)	Sigma-Aldrich	FD70-100MG	Gastrointestinal Transit Assay
HE staining kit	solarbio	G1120
PE anti-mouse CD11b	Biolegend	101208
PE anti-mouse PD-1	Biolegend	114118
PE/Cy7 anti-mouse CD11c	Biolegend	117318
Percoll	GE (Pharmacia)	17-0891-01
Symphony A5 Flow cytometer	BD	-	Immune cell detection and sorting
Tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402	Anesthesia
Varioskan LUX	Thermo	N16699	Multimode microplate reader
Zombie Aqua Fixable Viability kit	Biolegend	423102	Fluorescent viability dye