Послеоперационная модель кишечной непроходимости мыши

Резюме

Мы описываем мышиную модель послеоперационной кишечной непроходимости, полученной с помощью кишечных манипуляций. Функция желудочно-кишечного транзита, патологические изменения и активация иммунных клеток оценивались через 24 ч после операции.

Аннотация

Большинство пациентов испытывают послеоперационную кишечную непроходимость (ПОИ) после операции, что связано с повышенной заболеваемостью, смертностью и временем госпитализации. POI является следствием механических повреждений во время хирургического вмешательства, в результате чего нарушается моторика в желудочно-кишечном тракте. Механизмы POI связаны с аберрантной чувствительностью нейронов, нарушением барьерной функции эпителия и усилением местного воспаления. Однако детали остаются загадкой. Таким образом, экспериментальные модели мышей имеют решающее значение для выяснения патофизиологии и механизма повреждения POI, а также для разработки новых методов лечения.

Здесь мы представляем мышиную модель POI, сгенерированную с помощью кишечных манипуляций (ВМ), которая похожа на клиническую хирургию; Это достигается механическим повреждением тонкого кишечника путем массажа живота 1-3 раза ватным тампоном. Задержка желудочно-кишечного транзита через 24 ч после операции, что оценивалось с помощью зондирования FITC-декстрана и флуоресцентного детектирования сегментарного пищеварительного тракта. Кроме того, исследовали отек тканей подслизистой оболочки и инфильтрацию иммунных клеток с помощью окрашивания гематоксилином и эозином и проточной цитометрии. Правильное давление внутримышечного в/м и гиперемическое воздействие на кишечник имеют решающее значение для процедуры. Эта мышиная модель POI может быть использована для изучения механизмов повреждения кишечника и восстановления после абдоминальной хирургии.

Введение

Послеоперационная кишечная непроходимость (ПОИ) — это синдром, который представляет собой серьезную проблему в области здоровья человека, особенно при ведении пациентов, перенесших абдоминальную операцию. Характеризуясь замедленным восстановлением перистальтики желудочно-кишечного тракта, POI способствует более длительному пребыванию в больнице и увеличению расходов на здравоохранение, однако не существует установленного определения, этиологии или лечения¹. Недавние исследования пролили свет на ключевую роль иммунных клеток в прогрессировании POI ^2,3,4, однако необходимы дальнейшие исследования для выяснения основных механизмов.

В этом протоколе мы представляем мышиную модель POI, индуцированную интраабдоминальной хирургией, которая в точности имитирует влияние абдоминальной хирургии на пищеварительный тракт. Наша цель состояла в том, чтобы предоставить стандартизированный метод моделирования POI у мышей, что позволило бы исследователям исследовать его патофизиологию и изучить новые терапевтические вмешательства.

Обоснование разработки и использования этого метода заключается в потребности в надежных доклинических моделях для изучения POI. Традиционные подходы к изучению POI часто не имеют трансляционной релевантности или не учитывают сложное взаимодействие факторов, способствующих заболеванию. Вводя мышиную модель, которая точно повторяет клинический сценарий, исследователи могут более точно исследовать механизмы, лежащие в основе POI, и протестировать потенциальные терапевтические вмешательства в контролируемых экспериментальных условиях.

По сравнению с альтернативными методами, мышиная модель POI, представленная в этом протоколе, имеет ряд преимуществ. Первоначально мы объединили наши экспериментальные результаты с последними достижениями, чтобы создать стандартизированный и воспроизводимый протокол для индуцирования POI у экспериментальных животных. Этот протокол способствует последовательной оценке функции желудочно-кишечного транзита. Во-вторых, использование гистологического окрашивания и проточной цитометрии позволило оценить набухание тканей, пролиферацию и активацию иммунных клеток, что дало ценную информацию о воспалительных процессах, лежащих в основе POI⁵.

В более широком контексте литературы создание мышиной модели POI способствует расширению объема исследований, направленных на понимание патофизиологии этого состояния. Преодолевая разрыв между фундаментальной наукой и клинической практикой, доклинические модели играют ключевую роль в разработке новых терапевтических стратегий для POI⁶. Кроме того, доступность стандартизированных моделей на животных повышает воспроизводимость и сопоставимость результатов исследований в различных лабораториях. Тем не менее, эта модель POI основана на механической стимуляции во время хирургической процедуры. Другие формы кишечной непроходимости, вызванной стимуляцией, могут не подходить для этой модели. Кроме того, при планировании экспериментов с использованием этой модели исследователи должны учитывать такие факторы, как правила благополучия животных, этические соображения и доступность ресурсов.

Подводя итог, можно сказать, что внедрение мышиной модели POI означает заметный прогресс в доклинических исследованиях этого изнурительного состояния. Кроме того, мы использовали окрашивание H&E и проточную цитометрию для оценки набухания тканей, а также пролиферации и активации иммунных клеток. Создание мышиной модели POI облегчило бы открытие механизмов POI и способствовало бы разработке новых методов лечения POI.

протокол

Процедуры по уходу за животными и экспериментальные процедуры проводились в соответствии с Руководящими принципами по уходу за животными и их использованию (Китай) и были одобрены Комитетом по этике Пекинской больницы дружбы (No 20-2056). Для исследования использовали мышей C57BL/6 (в возрасте 8-12 недель).

1. Подготовка к операции

1. Проведите все мыши за 12 ч до запланированного моделирования, чтобы соответствовать стандартизации экспериментальных условий (рис. 1А).
2. Подготовьте и простерилизуйте хирургические инструменты.
3. Приготовьте обезболивающий трибромэтанол и грелку. Следите за электрогрелкой, чтобы не допустить перегрева и поддерживать постоянную температуру (37,5 °C).

2. Анестезия

1. Обезболите каждую мышь трибромэтанолом.
   1. Разведите трибромэтанол для приготовления раствора 20 мг/мл в обычном физрастворе. Вводите 0,2 мл рабочего раствора триброметанола на 10 г массы тела путем внутрибрюшинного введения. Используйте офтальмологическую мазь на глазах мышей, чтобы предотвратить сухость во время анестезии.
   2. Убедитесь, что мыши полностью обезболены в течение 5 минут и остаются под наркозом в течение 20 минут.
2. Оцените глубину анестезии, наблюдая за неспособностью мыши оставаться в вертикальном положении, и проверьте расслабление мышц. Наблюдайте за потерей произвольного движения, мигательного рефлекса и реакции на рефлекторную стимуляцию (щипнуть палец ноги или хвост при сильном надавливании).
3. Оцените частоту дыхания и характер дыхания мыши, наблюдая за движениями грудной стенки и брюшной полости. Убедитесь, что частота дыхания составляет ~ 55-65 вдохов/мин под оптимальной анестезией.
4. Поместите мышь под наркозом на доску и закрепите ее скотчем.
5. После того, как мыши были полностью обезболиваны, используйте электрическую бритву для удаления волос с живота. После бритья сотрите все выпавшие волосы на животе с помощью ватного тампона, смоченного в физрастворе.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечьте надлежащую вентиляцию и использование вытяжного шкафа или шкафа биобезопасности при работе с трибромэтанолом, чтобы свести к минимуму риски воздействия. Во время процедуры надевайте соответствующие средства индивидуальной защиты, включая перчатки и лабораторные халаты, чтобы предотвратить случайный контакт с химическими веществами и биологическими материалами.

3. Хирургия

1. Полностью вытяните конечности, чтобы обнажить живот. Убедитесь, что голова мыши расположена так, чтобы дыхательные пути оставались чистыми (рисунок 1B).
2. Дважды продезинфицируйте кожу хирургической области с помощью ватного тампона, смоченного в 75% спирте. После дезинфекции используйте сухую стерильную медицинскую марлю для удаления излишков спирта из области живота. Введите лидокаин (10 мг/кг, подкожно) в предполагаемое место до разреза.
3. С помощью стерильного скальпеля сделайте разрез на коже и подтяните прямую мышцу живота в середине живота с помощью пинцета.
   1. Сделайте небольшой разрез по срединной линии прямой мышцы живота, стараясь не травмировать различные органы брюшной полости.
   2. Убедитесь, что приблизительный диапазон разреза следующий. Следите за тем, чтобы верхний край разреза находился на расстоянии 6-8 мм от мечевидного отростка грудины, нижний край – на расстоянии 6-8 мм от наружных половых органов, а длина разреза – ~1 см.
4. Поместите кусок стерильной хирургической простыни или стерильной марли с обеих сторон разреза брюшной полости. С помощью гемостатических щипцов зафиксируйте стерильную марлю на верхнем и нижнем краях разреза, обнажив разрез (рисунок 1В).
   ПРИМЕЧАНИЕ: В фиктивной группе разрез был закрыт влажной марлей в течение 5 минут без какой-либо хирургической операции.
5. Правильно зафиксируйте стерильную простыню или марлю, затем с помощью двух ватных тампонов, предварительно смоченных физиологическим раствором, аккуратно прижмите обе стороны брюшной стенки, прилегающей к разрезу. Выдавите небольшое количество кишечной трубки через разрез и обнажите его, поместив на стерильную простыню или марлю (рисунок 1D).
6. Полностью смочите два стерильных ватных тампона обычным физиологическим раствором. Аккуратно обхватите ткани кишечника смоченными ватными тампонами и осторожно удалите тонкую кишку.
   1. Найдите слепую кишку, а затем выньте кишечник стерильными ватными тампонами за 2 см до желудка, чтобы не касаться поджелудочной железы. Протяните кишечник от проксимального конца панкреато-дуоденальной связки до дистального конца илеоцекальной области.
7. Оказывайте постоянное давление вдоль всей тонкой кишки от проксимального до дистального конца. Обеспечьте равномерное приложение силы в течение 5 минут, пока на поверхности кишечника не появятся небольшие кровоточащие пятна (Рисунок 1E).
8. Через 5 минут с помощью предварительно смоченных стерильных ватных тампонов осторожно поместите всю тонкую кишку обратно в брюшную полость, следуя нормальному физиологическому анатомическому положению тонкой кишки.
9. Мягко массируйте живот через стерильную марлю и брюшную стенку в течение 3-5 с, чтобы убедиться, что кишечник восстановлен в своем естественном анатомическом положении и предотвратить искусственную механическую кишечную непроходимость или перекрут брыжейки после операции.
10. Введите 100 мкл физиологического раствора в брюшную полость для восполнения потерянной жидкости во время операции и смазывания тканей брюшной полости.
11. Закройте брюшную полость с помощью хирургического шва 6-0 и выполните двухслойное закрытие на разрезе брюшной полости. Начните с закрытия мышечного слоя непрерывными швами, стараясь не повредить органы брюшной полости. Подтяните прямую мышцу живота во время наложения швов (рисунок 1F).
12. После полного закрытия прямой мышцы живота полностью зашить ее простыми прерывистыми швами с использованием хирургического шва 6-0. Поддерживайте длину стежков ~0,5 мм и расстояние между иглами ~2 мм.
13. После закрытия разреза на брюшной полости аккуратно протрите область возле разреза сухой стерильной медицинской марлей, чтобы она оставалась сухой и чистой от крови, тканевой жидкости или обычного физиологического раствора.
14. Нанесите небольшое количество медицинского клея для разреза на разрез и вокруг него, чтобы избежать расслоения после операции.
15. После того как медицинский клей для разреза полностью высохнет, переложите мышей на бумажное полотенце и положите бумажное полотенце клетки на подогретое одеяло, поддерживаемое постоянной температурой 37,5 °C до полного выздоровления мышей. Не оставляйте животных без присмотра до тех пор, пока они не придут в сознание, достаточное для поддержания лежачего положения на грудине.
16. Перенесите проснувшихся мышей в барьерную среду кормления животных и дайте им свободно пить до момента обнаружения.

4. Анализ желудочно-кишечного транзита

1. Введите 200 мкл раствора ФИТК-декстрана (5 мг/мл в PBS) голодающим мышам через зонд через 22,5 ч после операции (рис. 1A).
2. Усыпляйте мышей с помощью метода, одобренного Комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC), например, вдыхание_CO2 с последующим вывихом шейки матки.
   1. Чтобы изолировать пищеварительный тракт, сделайте разрез по средней линии от диафрагмы до таза, аккуратно удаляя окружающие соединительные ткани и органы.
   2. Отделите пищеварительный тракт от окружающих тканей и органов, обеспечив включение в него всего тракта от желудка до анального отверстия.
3. Разделите пищеварительный тракт на 15 равных сегментов (от желудка до толстой кишки), пронумерованных последовательно от 1 до 15 в зависимости от физиологического положения (последовательность: St -S1:S10-Ce-L1:L3) (рисунок 2A).
4. Разрежьте каждый сегмент кишечной ткани с его содержимым на кусочки размером 1-4 мм и поместите их в отдельные центрифужные пробирки объемом 1,5 мл, содержащие 1 мл DPBS.
5. Сделайте вихревые пробирки центрифуги в течение 10 с для гомогенизации образцов.
6. Центрифугируйте пробирки при 500 × г в течение 1 мин. Соберите надосадочную жидкость для количественного определения флуоресценции FITC с помощью многорежимного считывателя микропланшетов.
7. Опишите желудочно-кишечный транзит, рассчитав геометрический центр (GC) FITC-декстрана, и рассчитайте по следующей формуле: (Σ[% FITC на сегмент x номер сегмента])/100.

5. Заделка парафина и окрашивание гематоксилином и эозином (HE)

1. Усыпьте мышей путем ингаляции_CO2 с последующим вывихом шейки матки через 24 часа. Проведите заделку парафина и желудочно-кишечные анализы на одном и том же животном.
2. Вскрыть брюшную полость и собрать ткани тонкого кишечника для дальнейшего анализа.
3. Зафиксировать весь кишечник с содержимым кишечника в фиксаторе Карноя (60% метанола + 10% уксусной кислоты + 30% хлороформа) при температуре 4 °C в течение 2 ч.
4. Обескислите ткань, дважды промыв метанолом в течение 30 минут каждый раз.
5. Замените метанол на этанол дважды в течение 30 минут каждый раз.
6. Обескислите ткань, дважды промыв метанолом в течение 30 минут каждый раз. Чтобы добиться прозрачности тканей с помощью ксилола, погрузите ткань в ксилол и инкубируйте в течение 1 ч.
7. Погрузите ткань в парафин с помощью машины для заделки парафина. Нарежьте заложенную ткань на ломтики толщиной 4 мкм с помощью микротома.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Разделите тонкую кишку на разные воски для улучшения производительности. Правильно пометьте сегменты, чтобы определить их расположение.
8. Выполняйте окрашивание HE с помощью набора для окрашивания HE. Запечатайте предметные стекла и рассмотрите их под микроскопом для анализа.

6. Выделение иммунных клеток и проточная цитометрия

1. Приготовьте следующие растворы.
   1. Раствор для предварительного разложения: Приготовьте сбалансированный раствор соли Хэнка без Ca⁺ и Mg²⁺ с 1 мМ дитиотреитола (DTT) и 10 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА).
   2. Раствор для разложения: Приготовьте раствор, содержащий 200 мкг/мл ДНКазы I, 500 мкг/мл коллагеназы IV, 4% FBS и 100 мкМ буфера HEPES в RPMI 1640.
   3. Буфер для сортировки магнитных клеток (MACS): Приготовьте буфер, содержащий 5 г/л BSA и 2 мМ ЭДТА в PBS без Ca²⁺ или Mg²⁺.
2. Удалите каловое содержимое, промыв кишечник обычным физиологическим раствором. Удалите пейеровы пятна и соединительную ткань тонкой кишки. Разрежьте тонкую кишку, раскройте в продольном направлении, а затем разрежьте на сегменты по 1 см в ледяной PBS.
3. Промойте сегменты кишечника раствором для предварительного переваривания при температуре 37 °C в течение 20 минут на орбитальном шейкере. Соберите раствор для предварительного переваривания и отфильтруйте его через клеточные фильтры 70 мкм, чтобы получить внутриэпителиальные лимфоциты (ИЭЛ).
4. Расщепляйте сегменты в растворе для варки в течение 30 минут, а затем фильтруйте суспензию через клеточные фильтры размером 70 мкм для получения собственных лимфоцитов (LPL).
5. Центрифугируйте клетки LPL при 500 × г в течение 10 мин и выбросьте надосадочную жидкость.
6. Промойте и суспензируйте клетки с DPBS (азид натрия, трис и без белка) в концентрации 1 x 10⁶ клеток/100 μл.
7. Инкубируйте клетки с флуоресцентным красителем жизнеспособности (1:500) в течение 15 минут при комнатной температуре (RT) в темноте.
8. Суспензируйте клетки с помощью буфера MACS и центрифугируйте их при 500 × г в течение 5 минут.
9. Подсчитайте окрашенные клетки с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика клеток. Ресуспендируйте клетки в концентрации 1 x 10⁶ клеток/100 мкл буфера MACS. Проводят окрашивание антител (1:200-1:400) путем добавления соответствующего объема антитела к клеточной суспензии и инкубируют при 4°С в течение 15 мин.
10. Промойте ячейки, как описано в пункте 6.8.
11. Обнаружение образцов с помощью проточной цитометрии и анализ данных с помощью соответствующего программного обеспечения для проточной цитометрии ^7,8.

Результаты

В этом протоколе POI был вызван хирургическим путем с помощью кишечных манипуляций (ВМ), что аналогично эффекту клинической хирургии. В фиктивной группе разрез был сделан без в/м. Мышей POI умерщвляли через 24 часа после операции POI вместе с мышами с фиктивной контрольной г...

Обсуждение

Успех операции зависит от нескольких важнейших этапов. Во-первых, поддержание консистенции во время интрамуральной хирургии кишечника (ВМ) является обязательным для того, чтобы вызвать обширное повреждение тонкой кишки. Надлежащее давление, оказываемое во время про?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M HEPES	Thermo	15630080
APC anti-mouse I-A/I-E (MHC-II)	Biolegend	107614
APC anti-mouse TCRb	Biolegend	109212
APC/Cy7 anti-mouse CD4	Biolegend	100414
APC/Cy7 anti-mouse Ly6G	Biolegend	127624
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD69	Biolegend	104545
Brilliant Violet 421 anti-mouse F4/80	Biolegend	123132
Brilliant Violet 785 anti-mouse/human CD44	Biolegend	103041
BUV395 anti-mouse CD8a	BD	563786
BUV737 anti-mouse CD3e	BD	612771
Collagenase IV	Sigma-Aldrich	C5138
Culture Microscope	CKX53	Olympus
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase I)	Sigma-Aldrich	DN25-5G
DL-Dithiothreitol solution	Sigma-Aldrich	43816-10ML
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS-100G
FITC anti-mouse CD45	Biolegend	147709
FITC-dextran (70 kWM)	Sigma-Aldrich	FD70-100MG	Gastrointestinal Transit Assay
HE staining kit	solarbio	G1120
PE anti-mouse CD11b	Biolegend	101208
PE anti-mouse PD-1	Biolegend	114118
PE/Cy7 anti-mouse CD11c	Biolegend	117318
Percoll	GE (Pharmacia)	17-0891-01
Symphony A5 Flow cytometer	BD	-	Immune cell detection and sorting
Tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402	Anesthesia
Varioskan LUX	Thermo	N16699	Multimode microplate reader
Zombie Aqua Fixable Viability kit	Biolegend	423102	Fluorescent viability dye