Modelo murino de íleo postoperatorio

Resumen

Describimos un modelo murino de íleo postoperatorio generado por manipulación intestinal. Se evaluó la función del tránsito gastrointestinal, los cambios patológicos y la activación de las células inmunitarias 24 h después de la cirugía.

Resumen

La mayoría de los pacientes experimentan íleo postoperatorio (IOP) después de la cirugía, lo que se asocia con un aumento de la morbilidad, la mortalidad y el tiempo de hospitalización. La POI es una consecuencia del daño mecánico durante la cirugía, lo que resulta en la interrupción de la motilidad en el tracto gastrointestinal. Los mecanismos de la POI están relacionados con una sensibilidad neuronal aberrante, un deterioro de la función de la barrera epitelial y un aumento de la inflamación local. Sin embargo, los detalles siguen siendo enigmáticos. Por lo tanto, los modelos murinos experimentales son cruciales para dilucidar la fisiopatología y el mecanismo de la lesión por POI y para el desarrollo de nuevas terapias.

Aquí, presentamos un modelo murino de POI generado a través de la manipulación intestinal (IM) que es similar a la cirugía clínica; Esto se logra mediante el daño mecánico del intestino delgado masajeando el abdomen de 1 a 3 veces con un hisopo de algodón. La IM retrasó el tránsito gastrointestinal a las 24 h de la cirugía, evaluado por sonda nasogástrica de dextrano FITC y detección fluorescente del tracto digestivo segmentario. Además, se investigó la inflamación tisular de la submucosa y la infiltración de células inmunitarias mediante tinción con hematoxilina y eosina y citometría de flujo. La presión adecuada del IM y un efecto hiperémico en el intestino son críticos para el procedimiento. Este modelo murino de POI se puede utilizar para estudiar los mecanismos del daño intestinal y la recuperación después de la cirugía abdominal.

Introducción

El íleo postoperatorio (IOP) es un síndrome que plantea un reto importante en el campo de la salud humana, especialmente en el manejo de los pacientes sometidos a cirugía abdominal. Caracterizada por una recuperación tardía de la motilidad gastrointestinal, la IOP contribuye a estancias hospitalarias prolongadas y a un aumento de los costos de atención médica, sin embargo, no existe una definición, etiología o tratamiento establecidos¹. Investigaciones recientes han arrojado luz sobre el papel fundamental de las células inmunitarias en la progresión de la POI ^2,3,4, pero se requiere más investigación para dilucidar los mecanismos subyacentes involucrados.

En este protocolo, introducimos un modelo murino de POI inducido por cirugía intraabdominal, que imita de cerca el impacto de la cirugía abdominal en el tracto digestivo. Nuestro objetivo era proporcionar un método estandarizado para modelar POI en ratones, permitiendo a los investigadores investigar su fisiopatología y explorar nuevas intervenciones terapéuticas.

La justificación del desarrollo y la utilización de esta técnica radica en la necesidad de contar con modelos preclínicos fiables para estudiar la POI. Los enfoques tradicionales para estudiar la POI a menudo carecen de relevancia traslacional o no logran captar la compleja interacción de los factores que contribuyen a la afección. Al introducir un modelo murino que replica de cerca el escenario clínico, los investigadores pueden investigar con mayor precisión los mecanismos subyacentes a la POI y probar posibles intervenciones terapéuticas en un entorno experimental controlado.

En comparación con las técnicas alternativas, el modelo murino de POI presentado en este protocolo ofrece varias ventajas. Inicialmente, integramos nuestros hallazgos experimentales con los avances recientes para establecer un protocolo estandarizado y reproducible para inducir POI en animales de experimentación. Este protocolo facilita la evaluación consistente de la función del tránsito gastrointestinal. En segundo lugar, el empleo de la tinción histológica y la citometría de flujo permitió evaluar la hinchazón del tejido, la proliferación y la activación de las células inmunitarias, lo que proporcionó información valiosa sobre los procesos inflamatorios subyacentes a la POI⁵.

En el contexto más amplio de la literatura, el establecimiento de un modelo murino de POI contribuye a la expansión del cuerpo de investigación destinado a comprender la fisiopatología de esta afección. Al tender un puente entre la ciencia básica y la práctica clínica, los modelos preclínicos desempeñan un papel fundamental en el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas para la POI⁶. Además, la disponibilidad de modelos animales estandarizados mejora la reproducibilidad y la comparabilidad de los resultados de la investigación en diferentes laboratorios. Sin embargo, este modelo de POI se basa en la estimulación mecánica durante el procedimiento quirúrgico. Otras formas de íleo inducido por estimulación pueden no ser adecuadas para este modelo. Además, los investigadores deben tener en cuenta factores como las regulaciones de bienestar animal, las consideraciones éticas y la disponibilidad de recursos al planificar experimentos con este modelo.

En resumen, la introducción de un modelo murino de POI significa un avance notable en la investigación preclínica sobre esta condición debilitante. Además, empleamos la tinción de H&E y la citometría de flujo para evaluar la hinchazón del tejido y la proliferación y activación de las células inmunitarias. El establecimiento de un modelo murino de POI facilitaría el descubrimiento de los mecanismos de POI y promovería el desarrollo de nuevas terapias para el POI.

Protocolo

El cuidado de los animales y los procedimientos experimentales se llevaron a cabo de acuerdo con los Principios Rectores en el Cuidado y Uso de los Animales (China) y fueron aprobados por el Comité de Revisión de Ética del Hospital de la Amistad de Beijing (NO. 20-2056). Para el estudio se utilizaron ratones C57BL/6 (8-12 semanas de edad).

1. Preparación para la cirugía

1. Ayuno todos los ratones durante 12 h antes del modelado planificado para cumplir con la estandarización de las condiciones experimentales (Figura 1A).
2. Preparar y esterilizar instrumentos quirúrgicos.
3. Prepare el anestésico tribromoetanol y la almohadilla térmica. Controle la almohadilla térmica para evitar el sobrecalentamiento y manténgala a una temperatura constante (37,5 °C).

2. Anestesia

1. Anestesiar a cada ratón con tribromoetanol.
   1. Diluya el tribromoetanol para preparar una solución de 20 mg/ml en solución salina normal. Administrar 0,2 mL de la solución de trabajo de tribromoetanol por cada 10 g de peso corporal mediante inyección intraperitoneal. Use ungüento oftálmico en los ojos de los ratones para prevenir la sequedad mientras están bajo anestesia.
   2. Asegúrese de que los ratones estén completamente anestesiados dentro de los 5 minutos y permanezcan anestesiados durante 20 minutos.
2. Evalúe la profundidad de la anestesia observando la incapacidad del ratón para permanecer erguido y verifique la relajación muscular. Observe la pérdida del movimiento voluntario, el reflejo de parpadeo y la respuesta a la estimulación refleja (pellizco del dedo del pie o de la cola con presión firme).
3. Evalúe la frecuencia respiratoria y el patrón del ratón mediante el control del movimiento de la pared torácica y el abdomen. Asegúrese de que la frecuencia respiratoria sea de ~ 55-65 respiraciones/min bajo anestesia óptima.
4. Coloque el ratón anestesiado en una tabla y asegúrelo con cinta adhesiva.
5. Después de que los ratones estén completamente anestesiados, use una afeitadora eléctrica para eliminar el vello del abdomen. Después del afeitado, limpie todo el vello suelto del abdomen con una bola de algodón humedecida con solución salina.
   NOTA: Asegúrese de que la ventilación y el uso adecuados de una campana extractora o una cabina de bioseguridad manipulen tribromoetanol para minimizar los riesgos de exposición. Durante el procedimiento, use equipo de protección personal adecuado, incluidos guantes y batas de laboratorio, para evitar el contacto accidental con productos químicos y materiales biológicos.

3. Cirugía

1. Extiende completamente las extremidades para exponer el abdomen. Asegúrese de que la cabeza del ratón esté colocada de manera que mantenga las vías respiratorias despejadas (Figura 1B).
2. Desinfectar la piel de la zona quirúrgica dos veces con un algodón empapado con alcohol al 75%. Después de la desinfección, use una gasa médica seca y estéril para eliminar el exceso de alcohol del abdomen. Administrar lidocaína (10 mg/kg, por vía subcutánea) en el sitio previsto antes de la incisión.
3. Use un bisturí estéril para hacer una incisión en la piel y levante el músculo recto abdominal en el medio del abdomen con pinzas.
   1. Haga una pequeña incisión a lo largo de la línea media del músculo recto abdominal, teniendo cuidado de evitar lesiones en varios órganos del abdomen.
   2. Asegúrese de que el rango aproximado de la incisión sea el siguiente. Asegúrese de que el margen superior de la incisión esté a 6-8 mm de la apófisis xifoides del esternón, el margen inferior esté a 6-8 mm de los genitales externos y la longitud de la incisión sea de ~ 1 cm.
4. Coloque un pedazo de paño quirúrgico estéril o una gasa estéril a ambos lados de la incisión abdominal. Utilice pinzas hemostáticas para fijar la gasa estéril en los bordes superior e inferior de la incisión, exponiendo la incisión (Figura 1C).
   NOTA: En el grupo simulado, la incisión se cubrió con gasa húmeda durante 5 minutos sin ninguna operación quirúrgica.
5. Fije adecuadamente el paño o la gasa estéril, luego use dos hisopos de algodón previamente humedecidos con solución salina para presionar suavemente contra ambos lados de la pared abdominal adyacente a la incisión. Exprima una pequeña cantidad del tubo intestinal a través de la incisión y expóngalo colocándolo sobre el paño o gasa estéril (Figura 1D).
6. Humedezca completamente dos bastoncillos de algodón estériles con solución salina normal. Agarre suavemente el tejido intestinal con los bastoncillos de algodón humedecidos y retire con cuidado el intestino delgado.
   1. Localice el ciego y luego extraiga el intestino con los hisopos de algodón estériles hasta 2 cm antes del estómago para evitar tocar el páncreas. Extiende el intestino desde el extremo proximal del ligamento pancreato-duodenal hasta el extremo distal de la región ileocecal.
7. Aplique una presión constante a lo largo de todo el intestino delgado desde los extremos proximal hasta los distales. Asegurar la aplicación uniforme de la fuerza durante 5 min hasta que aparezcan pequeños puntos sangrantes en la superficie intestinal (Figura 1E).
8. Después de 5 minutos, use hisopos de algodón estériles prehumedecidos para colocar cuidadosamente todo el intestino delgado nuevamente en la cavidad abdominal, siguiendo la posición anatómica fisiológica normal del intestino delgado.
9. Masajee suavemente el abdomen a través de la gasa estéril y la pared abdominal durante 3-5 segundos para asegurar que el intestino se restablezca a su posición anatómica natural y para prevenir la obstrucción intestinal mecánica artificial o la torsión mesentérica después de la cirugía.
10. Inyectar 100 μL de solución salina en la cavidad abdominal para reponer los líquidos perdidos durante la operación y lubricar el tejido abdominal.
11. Cierre el abdomen con sutura quirúrgica 6-0 y realice un cierre de dos capas en la incisión abdominal. Comience cerrando la capa muscular con suturas continuas, teniendo cuidado de evitar daños en los órganos abdominales. Levante el músculo recto abdominal durante la sutura (Figura 1F).
12. Después de cerrar completamente el músculo recto abdominal, suturarlo completamente con suturas intermitentes simples utilizando una sutura quirúrgica 6-0. Mantenga una longitud de puntada de ~0,5 mm y un espaciado de aguja de ~2 mm.
13. Después de cerrar la incisión abdominal, limpie suavemente el área cercana a la incisión con una gasa médica estéril y seca para mantenerla seca y limpia de sangre, líquido tisular o solución salina normal.
14. Aplique una pequeña cantidad de adhesivo médico para incisiones dentro y alrededor de la incisión para evitar que se parta después de la cirugía.
15. Después de que el adhesivo de incisión médica se haya secado por completo, transfiera los ratones a una toalla de papel y coloque la toalla de papel de la jaula sobre una manta térmica mantenida a una temperatura constante de 37,5 °C hasta que los ratones se recuperen por completo. No deje a los animales desatendidos hasta que hayan recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal.
16. Transfiera a los ratones despiertos al entorno de la barrera de alimentación animal y permítales beber libremente hasta el momento de la detección.

4. Ensayo de tránsito gastrointestinal

1. Administrar 200 μL de solución de FITC-dextrano (5 mg/mL en PBS) a los ratones en ayunas por sonda nasogástrica 22,5 h después de la cirugía (Figura 1A).
2. Eutanasia de los ratones utilizando un método aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC), como la inhalación de CO₂ seguida de dislocación cervical.
   1. Para aislar el tracto digestivo, haz una incisión en la línea media desde el diafragma hasta la pelvis, extirpando con cuidado los tejidos conectivos y los órganos circundantes.
   2. Separe el tracto digestivo de los tejidos y órganos circundantes, asegurándose de que se incluya todo el tracto desde el estómago hasta el ano.
3. Divida el tracto digestivo en 15 segmentos iguales (desde el estómago hasta el colon), numerados secuencialmente del 1 al 15 según la posición fisiológica (secuencia: St -S1:S10-Ce-L1:L3) (Figura 2A).
4. Corte cada segmento de tejido intestinal con su contenido en trozos de 1 a 4 mm y colóquelos en tubos de centrífuga separados de 1,5 mL que contengan 1 mL de DPBS.
5. Agite los tubos de centrífuga durante 10 s para homogeneizar las muestras.
6. Centrifugar los tubos a 500 × g durante 1 min. Recoja el sobrenadante para la cuantificación de fluorescencia FITC utilizando un lector de microplacas multimodo.
7. Describa el tránsito gastrointestinal calculando el centro geométrico (GC) del FITC-dextrano y calcule utilizando la siguiente fórmula: (Σ[% FITC por segmento x número de segmento])/100.

5. Inclusión de parafina y tinción con hematoxilina y eosina (HE)

1. Eutanasia de los ratones por inhalación de CO₂ seguida de luxación cervical después de 24 h. Realizar ensayos de inclusión en parafina y gastrointestinales en el mismo animal.
2. Abra la cavidad abdominal y recoja el tejido del intestino delgado para su posterior análisis.
3. Fijar todo el intestino con contenido intestinal en el fijador de Carnoy (60% metanol + 10% ácido acético + 30% cloroformo) a 4 °C durante 2 h.
4. Desacidifique el tejido enjuagando dos veces con metanol durante 30 minutos cada vez.
5. Reemplace el metanol con etanol dos veces durante 30 minutos cada vez.
6. Desacidifique el tejido enjuagando dos veces con metanol durante 30 minutos cada vez. Para lograr la transparencia del tejido con xileno, sumerja el tejido en xileno e incube durante 1 h.
7. Incruste el tejido en cera de parafina utilizando una máquina de inclusión de parafina. Corta el tejido incrustado en rodajas de 4 μm de grosor con un micrótomo.
   NOTA: Divida el intestino delgado en diferentes ceras para mejorar el rendimiento. Etiquete correctamente los segmentos para identificar su ubicación.
8. Realice la tinción HE con el kit de tinción HE. Selle los portaobjetos y examínelos bajo un microscopio para su análisis.

6. Aislamiento de células inmunitarias y citometría de flujo

1. Prepare las siguientes soluciones.
   1. Solución de predigestión: Prepare la solución salina equilibrada de Hank sin Ca²⁺ y Mg²⁺ con 1 mM de ditiotreitol (DTT) y 10 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA).
   2. Solución de digestión: Prepare una solución que contenga 200 μg/mL de ADNasa I, 500 μg/mL de colagenasa IV, 4% de FBS y 100 μM de tampón HEPES en RPMI 1640.
   3. Tampón de trabajos de clasificación de células activadas magnéticamente (MACS): Prepare un tampón que contenga 5 g/L de BSA y 2 mM de EDTA en PBS sin Ca²⁺ o Mg²⁺.
2. Elimine el contenido fecal lavando los intestinos con solución salina normal. Retirar los parches de Peyer y el tejido conectivo del intestino delgado. Cortar el intestino delgado abierto longitudinalmente y luego cortar en segmentos de 1 cm en PBS helado.
3. Lavar los segmentos intestinales con solución de predigestión a 37 °C durante 20 min en un agitador orbital. Recoger la solución de predigestión y filtrarla a través de filtros de células de 70 μm para obtener linfocitos intraepiteliales (LIE).
4. Digiera los segmentos en la solución de digestión durante 30 min y luego filtre la suspensión a través de filtros celulares de 70 μm para obtener linfocitos de lámina propia (LPL).
5. Centrifugar las células LPL a 500 × g durante 10 minutos y desechar el sobrenadante.
6. Lave y suspenda las células con DPBS (azida sódica, Tris y sin proteínas) a una concentración de 1 x 10⁶ células/100 μL.
7. Incubar las células con un colorante fluorescente de viabilidad (1:500) durante 15 min a temperatura ambiente (RT) en la oscuridad.
8. Suspender las células con tampón MACS y centrifugarlas a 500 × g durante 5 min.
9. Cuente las células teñidas con un hemocitómetro o un contador de células automatizado. Vuelva a suspender las células a una concentración de 1 x 10⁶ células/100 μL de tampón MACS. Realizar la tinción de anticuerpos (1:200-1:400) añadiendo el volumen adecuado de anticuerpo a la suspensión celular e incubando a 4 °C durante 15 min.
10. Lave las células como se describe en el paso 6.8.
11. Detecte las muestras mediante citometría de flujo y analice los datos con el software de citometría de flujo asociado ^7,8.

Resultados

En este protocolo, la POI fue inducida quirúrgicamente por manipulación intestinal (IM), que es similar al efecto de la cirugía clínica. En el grupo simulado, se realizó una incisión sin el IM. Los ratones POI fueron sacrificados 24 horas después de la cirugía POI junto con ratones de control simulados. La función crítica del tracto digestivo, la función de tránsito del contenido, se detectó por sonda nasogástrica de FITC-dextrano. El modelo POI se consideró exitoso porque...

Discusión

El éxito de la cirugía depende de varios pasos críticos. En primer lugar, mantener la consistencia durante la cirugía intestinal intramural (IM) es imperativo para inducir una lesión extensa en el intestino delgado. La presión adecuada aplicada durante el procedimiento IM y el efecto hiperémico resultante en el intestino son cruciales para el éxito quirúrgico. La observación de todo el tracto digestivo volviéndose rosado y mostrando manchas hemorrágicas rojas después de frot...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M HEPES	Thermo	15630080
APC anti-mouse I-A/I-E (MHC-II)	Biolegend	107614
APC anti-mouse TCRb	Biolegend	109212
APC/Cy7 anti-mouse CD4	Biolegend	100414
APC/Cy7 anti-mouse Ly6G	Biolegend	127624
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD69	Biolegend	104545
Brilliant Violet 421 anti-mouse F4/80	Biolegend	123132
Brilliant Violet 785 anti-mouse/human CD44	Biolegend	103041
BUV395 anti-mouse CD8a	BD	563786
BUV737 anti-mouse CD3e	BD	612771
Collagenase IV	Sigma-Aldrich	C5138
Culture Microscope	CKX53	Olympus
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase I)	Sigma-Aldrich	DN25-5G
DL-Dithiothreitol solution	Sigma-Aldrich	43816-10ML
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS-100G
FITC anti-mouse CD45	Biolegend	147709
FITC-dextran (70 kWM)	Sigma-Aldrich	FD70-100MG	Gastrointestinal Transit Assay
HE staining kit	solarbio	G1120
PE anti-mouse CD11b	Biolegend	101208
PE anti-mouse PD-1	Biolegend	114118
PE/Cy7 anti-mouse CD11c	Biolegend	117318
Percoll	GE (Pharmacia)	17-0891-01
Symphony A5 Flow cytometer	BD	-	Immune cell detection and sorting
Tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402	Anesthesia
Varioskan LUX	Thermo	N16699	Multimode microplate reader
Zombie Aqua Fixable Viability kit	Biolegend	423102	Fluorescent viability dye