术后肠梗阻鼠模型

摘要

我们描述了通过肠道作产生的术后肠梗阻的小鼠模型。术后 24 h 评估胃肠道运输功能、病理变化和免疫细胞活化。

摘要

大多数患者在手术后会出现术后肠梗阻 （POI），这与发病率、死亡率和住院时间增加有关。POI 是手术过程中机械损伤的结果，导致胃肠道运动中断。POI 的机制与异常的神经元敏感性、上皮屏障功能受损和局部炎症增加有关。然而，细节仍然是个谜。因此，实验小鼠模型对于阐明 POI 损伤的病理生理学和机制以及开发新疗法至关重要。

在这里，我们介绍了一种通过肠道作 （IM） 生成的 POI 小鼠模型，它类似于临床手术;这是通过用棉签按摩腹部 1-3 次对小肠进行机械损伤来实现的。IM 在手术后 24 小时延迟胃肠道运输，通过 FITC-葡聚糖管饲法和节段消化道荧光检测进行评估。此外，通过苏木精和伊红染色和流式细胞术研究粘膜下层的组织肿胀和免疫细胞浸润。适当的 IM 压力和对肠道的充血作用对于手术至关重要。这种 POI 小鼠模型可用于研究腹部手术后肠道损伤和恢复的机制。

引言

术后肠梗阻 （POI） 是一种在人类健康领域构成重大挑战的综合征，尤其是在接受腹部手术的患者的管理方面。POI 的特征是胃肠动力恢复延迟，导致住院时间延长和医疗保健费用增加，但尚无明确的定义、病因或治疗方法¹。最近的研究阐明了免疫细胞在 POI 进展中的关键作用 ^2,3,4，但需要进一步研究以阐明所涉及的潜在机制。

在该方案中，我们引入了腹腔内手术诱导的 POI 小鼠模型，该模型与腹部手术对消化道的影响非常相似。我们的目标是提供一种标准化的小鼠 POI 建模方法，使研究人员能够研究其病理生理学并探索新的治疗干预措施。

开发和利用该技术的基本原理在于需要可靠的临床前模型来研究 POI。研究 POI 的传统方法通常缺乏转化相关性或无法捕捉导致该病症的因素的复杂相互作用。通过引入与临床场景紧密复制的小鼠模型，研究人员可以更准确地研究 POI 的潜在机制，并在受控的实验环境中测试潜在的治疗干预。

与其他技术相比，该方案中提出的 POI 小鼠模型具有几个优点。最初，我们将实验结果与最新进展相结合，建立了在实验动物中诱导 POI 的标准化和可重复的方案。该方案有助于对胃肠道运输功能的一致评估。其次，采用组织学染色和流式细胞术能够评估组织肿胀、免疫细胞增殖和活化，从而对 POI⁵ 背后的炎症过程产生有价值的见解。

在文献的更广泛背景下，建立 POI 的小鼠模型有助于扩大旨在理解这种情况的病理生理学的研究主体。通过弥合基础科学和临床实践之间的差距，临床前模型在开发 POI⁶ 的新型治疗策略方面发挥着关键作用。此外，标准化动物模型的可用性提高了不同实验室之间研究结果的可重复性和可比性。然而，这种 POI 模型依赖于外科手术过程中的机械刺激。其他形式的刺激诱发肠梗阻可能不适合此模型。此外，研究人员在使用此模型规划实验时应考虑动物福利法规、道德考虑和资源可用性等因素。

总之，POI 小鼠模型的引入标志着对这种衰弱性疾病的临床前研究取得了显着进展。此外，我们采用 H&E 染色和流式细胞术来评估组织肿胀和免疫细胞增殖和活化。小鼠 POI 模型的建立将有助于发现 POI 机制并促进 POI 新疗法的开发。

研究方案

动物护理和实验程序按照《动物照护和使用指导原则（中国）》进行，并经北京友谊医院伦理审查委员会（第20-2056号）批准。使用 C57BL/6 小鼠 （8-12 周龄） 进行研究。

1. 手术准备

1. 在计划建模之前，将所有小鼠禁食 12 小时，以满足实验条件的标准化（图 1A）。
2. 准备手术器械并对其进行消毒。
3. 准备麻醉剂三溴乙醇和加热垫。监控加热垫以防止过热，并将其保持在恒定的温度 （37.5 °C）。

2. 麻醉

1. 用三溴乙醇麻醉每只小鼠。
   1. 稀释三溴乙醇，在生理盐水中制备 20 mg/mL 溶液。通过腹膜内注射每 10 克体重施用 0.2 mL 三溴乙醇工作溶液。在小鼠的眼睛上使用眼药膏，以防止麻醉时干燥。
   2. 确保小鼠在 5 分钟内完全麻醉并保持麻醉 20 分钟。
2. 通过观察小鼠无法保持直立并检查肌肉松弛来评估麻醉深度。观察自主运动、眨眼反射和对反射刺激的反应（用力按压时捏住脚趾或尾巴）的丧失。
3. 通过监测胸壁和腹部的运动来评估小鼠的呼吸频率和模式。确保在最佳麻醉下呼吸频率为 ~ 55-65 次呼吸/分钟。
4. 将麻醉的鼠标放在板上并用胶带固定。
5. 小鼠完全麻醉后，使用电动剃毛器去除腹部毛发。剃须后，用蘸有盐水的棉球擦去腹部所有松散的毛发。
   注:处理三溴乙醇时，请确保适当通风并使用通风柜或生物安全柜，以最大限度地降低接触风险。在检查过程中，请佩戴适当的个人防护设备，包括手套和实验室外套，以防止意外接触化学品和生物材料。

3. 手术

1. 充分伸展四肢，露出腹部。确保鼠标头部的位置保持气道畅通（图 1B）。
2. 使用浸泡了 75% 酒精的棉球对手术区域的皮肤进行两次消毒。消毒后，使用干燥、无菌的医用纱布去除腹部多余的酒精。在切口前在预定部位施用利多卡因（10 mg/kg，皮下注射）。
3. 使用无菌手术刀在皮肤上切开一个切口，然后用镊子抬起腹部中间的腹直肌。
   1. 沿着腹直肌的正中线做一个小切口，注意避免损伤腹部的各个器官。
   2. 确保切口的大致范围如下。确保切口上缘距胸骨剑突 6-8 毫米，下缘距外生殖器 6-8 毫米，切口长度为 ~1 厘米。
4. 在腹部切口两侧放置一块无菌手术单或无菌纱布。使用止血钳将无菌纱布固定在切口的上下边缘，露出切口（图 1C）。
   注意:假手术组用湿纱布覆盖切口 5 分钟，无任何手术。
5. 正确固定无菌窗帘或纱布，然后用两根预先蘸有生理盐水的棉签轻轻按压靠近切口的腹壁两侧。通过切口挤出少量肠管，并将其放在无菌窗帘或纱布上暴露出来（图 1D）。
6. 用生理盐水完全润湿两根无菌棉签。用湿润的棉签轻轻抓住肠道组织，小心地取出小肠。
   1. 找到盲肠，然后用无菌棉签取出肠道，直到胃前 2 厘米，以避免接触胰腺。将肠道从胰十二指肠韧带的近端延伸到回盲部区域的远端。
7. 从近端到远端沿整个小肠施加一致的压力。确保均匀用力 5 分钟，直到肠表面出现小出血点（图 1E）。
8. 5 分钟后，按照小肠的正常生理解剖位置，使用预先湿润的无菌棉签小心地将所有小肠放回腹腔。
9. 在无菌纱布和腹壁上轻轻按摩腹部 3-5 秒，以确保肠道恢复到自然解剖位置，并防止手术后人为机械性肠梗阻或肠系膜扭转。
10. 将 100 μL 生理盐水注入腹腔，以补充手术过程中流失的液体并润滑腹部组织。
11. 使用 6-0 手术缝合线闭合腹部，并在腹部切口处进行两层闭合。首先用连续缝合闭合肌肉层，注意避免损伤腹部器官。在缝合过程中抬起腹直肌（图 1F）。
12. 完全闭合腹直肌后，使用 6-0 手术缝合线用简单的间歇缝合将其完全缝合。保持 ~0.5 mm 的针距和 ~2 mm 的针距。
13. 闭合腹部切口后，用干燥的无菌医用纱布轻轻擦拭切口附近的区域，以保持干燥并远离血液、组织液或生理盐水。
14. 在切口上和切口周围涂抹少量医用切口粘合剂，以避免手术后开裂。
15. 医用切口胶粘剂完全干燥后，将小鼠转移到纸巾上，将笼式纸巾放在保持 37.5 °C 恒温的加热毯上，直到小鼠完全恢复。在动物恢复足够的意识以维持胸骨卧位之前，不要让它们无人看管。
16. 将清醒的小鼠转移到动物摄食屏障环境中，让它们自由饮水，直到检测时间。

4. 胃肠道运输试验

1. 手术后 22.5 小时通过强饲法向禁食小鼠施用 200 μL FITC-葡聚糖溶液（PBS 中 5 mg/mL）（图 1A）。
2. 使用机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 批准的方法对小鼠实施安乐死，例如吸入 CO₂ 然后进行颈椎脱位。
   1. 为了隔离消化道，从横膈膜到骨盆做一个中线切口，小心地去除周围的结缔组织和器官。
   2. 将消化道与周围组织和器官分开，确保包括从胃到肛门的整个消化道。
3. 将消化道分成 15 个相等的部分（从胃到结肠），根据生理位置（顺序:St -S1:S10-Ce-L1:L3）从 1 到 15 依次编号（图 2A）。
4. 将每段肠道组织及其内容物切成 1-4 毫米的小块，并将它们放入含有 1 mL DPBS 的单独 1.5 mL 离心管中。
5. 涡旋离心管 10 秒以使样品均质化。
6. 将试管以 500 × g 离心 1 分钟。使用多功能酶标仪收集上清液进行 FITC 荧光定量。
7. 通过计算 FITC-葡聚糖的几何中心 （GC） 来描述胃肠道运输，并使用以下公式计算:（Σ[% 每段 FITC x 段号]）/100。

5. 石蜡包埋和苏木精和伊红 （HE） 染色

1. 通过吸入 CO₂ 对小鼠实施安乐死，然后在 24 小时后进行颈椎脱位。对同一只动物进行石蜡包埋和胃肠道检测。
2. 打开腹腔并收集小肠组织以进行进一步分析。
3. 将肠道内容物固定在 Carnoy 固定剂（60% 甲醇 + 10% 乙酸 + 30% 氯仿）中，在 4 °C 下放置 2 小时。
4. 用甲醇冲洗两次，每次 30 分钟，使组织脱酸。
5. 用乙醇替换甲醇两次，每次 30 分钟。
6. 用甲醇冲洗两次，每次 30 分钟，使组织脱酸。为了用二甲苯实现组织透明，将组织浸入二甲苯中并孵育 1 小时。
7. 使用石蜡包埋机将组织包埋在石蜡中。使用切片机将包埋的组织切成 4 μm 厚的切片。
   注意:将小肠分成不同的蜡以提高性能。正确标记区段以识别其位置。
8. 使用 HE 染色试剂盒进行 HE 染色。密封载玻片并在显微镜下检查它们以进行分析。

6. 免疫细胞分离和流式细胞术

1. 准备以下解决方案。
   1. 消化前溶液:用 1 mM 二硫苏糖醇 （DTT） 和 10 mM 乙二胺四乙酸 （EDTA） 制备不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 Hank 平衡盐溶液。
   2. 消化液:在 RPMI 1640 中制备含有 200 μg/mL DNAase I、500 μg/mL 胶原酶 IV、4% FBS 和 100 μM HEPES 缓冲液的溶液。
   3. 磁激活细胞分选工作 （MACS） 缓冲液:在不含 Ca²⁺ 或 Mg²⁺ 的 PBS 中制备含有 5 g/L BSA 和 2 mM EDTA 的缓冲液。
2. 用生理盐水清洗肠道以去除粪便内容物。去除小肠的 Peyer 斑和结缔组织。将小肠纵向切开，然后在冰冷的 PBS 中切成 1 cm 的段。
3. 在轨道振荡器上用 37 °C 的预消化溶液洗涤肠段 20 分钟。收集预消化溶液并通过 70 μm 细胞过滤器过滤以获得上皮内淋巴细胞 （IEL）。
4. 消化液中的片段消化 30 分钟，然后通过 70 μm 细胞过滤器过滤悬浮液以获得固有层淋巴细胞 （LPL）。
5. 将 LPL 细胞以 500 × g 离心 10 分钟，并弃去上清液。
6. 用浓度为 1 x 10⁶ 个细胞/100 μL 的 DPBS（叠氮化钠、无 Tris 和蛋白质）洗涤并悬浮细胞。
7. 将细胞与荧光活力染料 （1:500） 在室温 （RT） 下避光孵育 15 分钟。
8. 用 MACS 缓冲液悬浮细胞，并以 500 × g 离心 5 分钟。
9. 使用血细胞计数器或自动细胞计数仪对染色的细胞进行计数。以 1 x 10⁶ 个细胞/100 μL MACS 缓冲液的浓度重悬细胞。通过向细胞悬液中加入适当体积的抗体并在 4 °C 下孵育 15 分钟来进行抗体染色 （1:200-1:400）。
10. 按照步骤 6.8 中的说明洗涤细胞。
11. 使用流式细胞术检测样品，并使用相关的流式细胞术软件分析数据 ^7,8。

结果

在该方案中，POI 是通过肠道作 （IM） 手术诱导的，这与临床手术的效果相似。在假手术组中，在没有 IM 的情况下做了一个切口。POI 手术后 24 小时处死 POI 小鼠和假对照小鼠。消化道的关键功能，内容物转运功能，通过灌胃 FITC-葡聚糖检测。POI 模型被认为是成功的，因为小肠近端的 FITC 强度增加（图 2B）。计算平均 GCs 以量化 IM 的传输功能障碍并?...

讨论

手术的成功取决于几个关键步骤。首先，在肠壁内 （IM） 手术中保持一致性对于诱导小肠的广泛损伤是必不可少的。在 IM 手术过程中施加适当的压力以及由此产生的对肠道的充血作用对于手术成功至关重要。用棉签摩擦后观察到整个消化道变成粉红色并出现红色出血点，这是手术成功的指标。此外，确保手术后平均 GC 值保持在 5 左右表明，与假手术小鼠相比，该模型是...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M HEPES	Thermo	15630080
APC anti-mouse I-A/I-E (MHC-II)	Biolegend	107614
APC anti-mouse TCRb	Biolegend	109212
APC/Cy7 anti-mouse CD4	Biolegend	100414
APC/Cy7 anti-mouse Ly6G	Biolegend	127624
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD69	Biolegend	104545
Brilliant Violet 421 anti-mouse F4/80	Biolegend	123132
Brilliant Violet 785 anti-mouse/human CD44	Biolegend	103041
BUV395 anti-mouse CD8a	BD	563786
BUV737 anti-mouse CD3e	BD	612771
Collagenase IV	Sigma-Aldrich	C5138
Culture Microscope	CKX53	Olympus
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase I)	Sigma-Aldrich	DN25-5G
DL-Dithiothreitol solution	Sigma-Aldrich	43816-10ML
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS-100G
FITC anti-mouse CD45	Biolegend	147709
FITC-dextran (70 kWM)	Sigma-Aldrich	FD70-100MG	Gastrointestinal Transit Assay
HE staining kit	solarbio	G1120
PE anti-mouse CD11b	Biolegend	101208
PE anti-mouse PD-1	Biolegend	114118
PE/Cy7 anti-mouse CD11c	Biolegend	117318
Percoll	GE (Pharmacia)	17-0891-01
Symphony A5 Flow cytometer	BD	-	Immune cell detection and sorting
Tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402	Anesthesia
Varioskan LUX	Thermo	N16699	Multimode microplate reader
Zombie Aqua Fixable Viability kit	Biolegend	423102	Fluorescent viability dye