Modelo Murino de Íleo Pós-Operatório

Resumo

Descrevemos um modelo murino de íleo paralítico pós-operatório gerado por manipulação intestinal. A função do trânsito gastrointestinal, as alterações patológicas e a ativação das células imunes foram avaliadas 24 h após a cirurgia.

Resumo

A maioria dos pacientes apresenta íleo paralítico pós-operatório (IOP) após a cirurgia, o que está associado ao aumento da morbidade, mortalidade e tempo de hospitalização. A IOP é uma consequência de danos mecânicos durante a cirurgia, resultando em interrupção da motilidade no trato gastrointestinal. Os mecanismos da IOP estão relacionados à sensibilidade neuronal aberrante, função de barreira epitelial prejudicada e aumento da inflamação local. No entanto, os detalhes permanecem enigmáticos. Portanto, modelos murinos experimentais são cruciais para elucidar a fisiopatologia e o mecanismo da lesão de POI e para o desenvolvimento de novas terapias.

Aqui, apresentamos um modelo murino de POI gerado por manipulação intestinal (IM) que é semelhante à cirurgia clínica; Isso é conseguido por danos mecânicos ao intestino delgado, massageando o abdômen 1-3 vezes com um cotonete. IM retardou o trânsito gastrointestinal 24 horas após a cirurgia, conforme avaliado por gavagem FITC-dextrana e detecção de fluorescência do trato digestivo segmentar. Além disso, o edema tecidual da submucosa e a infiltração de células imunes foram investigados por coloração de hematoxilina e eosina e citometria de fluxo. A pressão adequada do IM e um efeito hiperêmico no intestino são críticos para o procedimento. Este modelo murino de POI pode ser utilizado para estudar os mecanismos de dano intestinal e recuperação após cirurgia abdominal.

Introdução

O íleo paralítico pós-operatório (IOP) é uma síndrome que representa um desafio significativo no campo da saúde humana, particularmente no manejo de pacientes submetidos à cirurgia abdominal. Caracterizada pela recuperação tardia da motilidade gastrointestinal, a IOP contribui para internações prolongadas e aumento dos custos com saúde, mas não existe definição, etiologia ou tratamento estabelecidos¹. Pesquisas recentes lançaram luz sobre o papel fundamental das células imunes na progressão do POI ^2,3,4, mas é necessária uma investigação mais aprofundada para elucidar os mecanismos subjacentes envolvidos.

Neste protocolo, apresentamos um modelo murino de IOP induzido por cirurgia intra-abdominal, que imita de perto o impacto da cirurgia abdominal no trato digestivo. Nosso objetivo era fornecer um método padronizado para modelar POI em camundongos, permitindo que os pesquisadores investigassem sua fisiopatologia e explorassem novas intervenções terapêuticas.

A lógica por trás do desenvolvimento e utilização dessa técnica reside na necessidade de modelos pré-clínicos confiáveis para estudar POI. As abordagens tradicionais para estudar o POI geralmente carecem de relevância translacional ou não conseguem capturar a complexa interação de fatores que contribuem para a condição. Ao introduzir um modelo murino que replica de perto o cenário clínico, os pesquisadores podem investigar com mais precisão os mecanismos subjacentes ao POI e testar possíveis intervenções terapêuticas em um ambiente experimental controlado.

Comparado a técnicas alternativas, o modelo murino de POI apresentado neste protocolo oferece várias vantagens. Inicialmente, integramos nossos achados experimentais com avanços recentes para estabelecer um protocolo padronizado e reprodutível para induzir POI em animais experimentais. Este protocolo facilita a avaliação consistente da função do trânsito gastrointestinal. Em segundo lugar, o emprego de coloração histológica e citometria de fluxo permitiu a avaliação do inchaço do tecido, proliferação e ativação de células imunes, produzindo informações valiosas sobre os processos inflamatórios subjacentes ao POI⁵.

No contexto mais amplo da literatura, o estabelecimento de um modelo murino de POI contribui para a expansão do corpo de pesquisas destinadas a compreender a fisiopatologia dessa condição. Ao preencher a lacuna entre a ciência básica e a prática clínica, os modelos pré-clínicos desempenham um papel fundamental no desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para o POI⁶. Além disso, a disponibilidade de modelos animais padronizados aumenta a reprodutibilidade e comparabilidade dos resultados da pesquisa em diferentes laboratórios. No entanto, esse modelo de POI depende da estimulação mecânica durante o procedimento cirúrgico. Outras formas de íleo paralítico induzido por estimulação podem não ser adequadas para este modelo. Além disso, os pesquisadores devem considerar fatores como regulamentos de bem-estar animal, considerações éticas e disponibilidade de recursos ao planejar experimentos usando esse modelo.

Em resumo, a introdução de um modelo murino de POI significa um avanço notável na pesquisa pré-clínica sobre essa condição debilitante. Além disso, empregamos coloração H & E e citometria de fluxo para avaliar o inchaço do tecido e a proliferação e ativação de células imunes. O estabelecimento de um modelo de POI murino facilitaria a descoberta de mecanismos de POI e promoveria o desenvolvimento de novas terapias para POI.

Protocolo

Os cuidados com os animais e os procedimentos experimentais foram conduzidos de acordo com os Princípios Orientadores no Cuidado e Uso de Animais (China) e foram aprovados pelo Comitê de Revisão de Ética do Hospital da Amizade de Pequim (NO. 20-2056). Camundongos C57BL/6 (8-12 semanas de idade) foram usados para o estudo.

1. Preparação para a cirurgia

1. Jejue todos os camundongos por 12 h antes da modelagem planejada para atender à padronização das condições experimentais (Figura 1A).
2. Prepare e esterilize instrumentos cirúrgicos.
3. Prepare o tribromoetanol anestésico e a almofada de aquecimento. Monitore a almofada de aquecimento para evitar superaquecimento e mantenha-a a uma temperatura consistente (37.5 °C).

2. Anestesia

1. Anestesiar cada camundongo com tribromoetanol.
   1. Diluir o tribromoetanol para preparar uma solução de 20 mg/ml em solução salina normal. Administrar 0,2 ml da solução de trabalho de tribromoetanol por 10 g de peso corporal através de injeção intraperitoneal. Use pomada oftálmica nos olhos dos camundongos para evitar o ressecamento durante a anestesia.
   2. Certifique-se de que os ratos estejam completamente anestesiados em 5 minutos e permaneçam anestesiados por 20 minutos.
2. Avalie a profundidade da anestesia observando a incapacidade do mouse de permanecer em pé e verifique se há relaxamento muscular. Observe a perda de movimento voluntário, reflexo de piscar e resposta à estimulação reflexa (pinça do dedo do pé ou da cauda com pressão firme).
3. Avalie a frequência respiratória e o padrão do camundongo monitorando o movimento da parede torácica e do abdômen. Certifique-se de que a frequência respiratória seja de ~ 55-65 respirações/min sob anestesia ideal.
4. Coloque o mouse anestesiado em uma placa e prenda-o com fita adesiva.
5. Depois que os ratos estiverem completamente anestesiados, use um barbeador elétrico para remover os pelos do abdômen. Após o barbear, limpe todos os pelos soltos do abdômen usando uma bola de algodão umedecida com solução salina.
   NOTA: Garanta a ventilação adequada e o uso de uma capela de exaustão ou gabinete de biossegurança ao manusear o tribromoetanol para minimizar os riscos de exposição. Durante o procedimento, use equipamento de proteção individual adequado, incluindo luvas e jalecos, para evitar o contato acidental com produtos químicos e materiais biológicos.

3. Cirurgia

1. Estenda totalmente os membros para expor o abdômen. Certifique-se de que a cabeça do mouse esteja posicionada para manter as vias aéreas desobstruídas (Figura 1B).
2. Desinfete a pele da área cirúrgica duas vezes usando uma bola de algodão embebida em álcool 75%. Após a desinfecção, use uma gaze médica seca e estéril para remover o excesso de álcool do abdômen. Administre lidocaína (10 mg/kg, por via subcutânea) no local pretendido antes da incisão.
3. Use um bisturi estéril para fazer uma incisão na pele e levante o músculo reto abdominal no meio do abdômen usando uma pinça.
   1. Faça uma pequena incisão ao longo da linha mediana do músculo reto abdominal, tomando cuidado para evitar lesões em vários órgãos do abdômen.
   2. Certifique-se de que o alcance aproximado da incisão seja o seguinte. Certifique-se de que a margem superior da incisão esteja a 6-8 mm do processo xifóide do esterno, a margem inferior a 6-8 mm da genitália externa e o comprimento da incisão seja de ~ 1 cm.
4. Coloque um pedaço de campo cirúrgico estéril ou gaze estéril em ambos os lados da incisão abdominal. Utilizar pinça hemostática para fixar a gaze estéril nas bordas superior e inferior da incisão, expondo a incisão (Figura 1C).
   NOTA: No grupo simulado, a incisão foi coberta com gaze úmida por 5 min sem qualquer operação cirúrgica.
5. Fixe adequadamente o campo estéril ou gaze e, em seguida, use dois cotonetes pré-umedecidos com solução salina para pressionar suavemente os dois lados da parede abdominal adjacente à incisão. Esprema uma pequena quantidade do tubo intestinal através da incisão e exponha-o colocando-o sobre o campo estéril ou gaze (Figura 1D).
6. Umedeça completamente dois cotonetes estéreis com solução salina normal. Segure suavemente o tecido intestinal com os cotonetes umedecidos e remova cuidadosamente o intestino delgado.
   1. Localize o ceco e retire o intestino com os cotonetes estéreis até 2 cm antes do estômago para evitar tocar no pâncreas. Estenda o intestino da extremidade proximal do ligamento pâncreas-duodenal até a extremidade distal da região ileocecal.
7. Aplique pressão consistente ao longo de todo o intestino delgado, das extremidades proximal às distais. Garanta a aplicação de força uniforme por 5 min até que pequenos pontos de sangramento surjam na superfície intestinal ( Figura 1E ).
8. Após 5 min, use cotonetes estéreis pré-umedecidos para colocar cuidadosamente todo o intestino delgado de volta na cavidade abdominal, seguindo a posição anatômica fisiológica normal do intestino delgado.
9. Massageie suavemente o abdômen através da gaze estéril e da parede abdominal por 3-5 s para garantir que o intestino seja restaurado à sua posição anatômica natural e para evitar obstrução intestinal mecânica artificial ou torção mesentérica após a cirurgia.
10. Injete 100 μL de solução salina na cavidade abdominal para repor os fluidos perdidos durante a operação e lubrificar o tecido abdominal.
11. Feche o abdome com sutura cirúrgica 6-0 e faça um fechamento em duas camadas na incisão abdominal. Comece fechando a camada muscular com suturas contínuas, tomando cuidado para evitar danos aos órgãos abdominais. Levante o músculo reto abdominal durante a sutura (Figura 1F).
12. Depois de fechar completamente o músculo reto abdominal, suture-o completamente com suturas intermitentes simples usando uma sutura cirúrgica 6-0. Mantenha um comprimento de ponto de ~0,5 mm e um espaçamento entre agulhas de ~2 mm.
13. Depois de fechar a incisão abdominal, limpe suavemente a área próxima à incisão com gaze médica estéril seca para mantê-la seca e limpa de sangue, fluido tecidual ou solução salina normal.
14. Aplique uma pequena quantidade de adesivo de incisão médica na incisão e ao redor dela para evitar rachaduras após a cirurgia.
15. Depois que o adesivo de incisão médica secar completamente, transfira os camundongos para uma toalha de papel e coloque a toalha de papel da gaiola em um cobertor aquecido mantido a uma temperatura constante de 37,5 ° C até que os camundongos se recuperem totalmente. Não deixe os animais sozinhos até que tenham recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal.
16. Transfira os camundongos acordados para o ambiente de barreira de alimentação animal e deixe-os beber livremente até o momento da detecção.

4. Ensaio de trânsito gastrointestinal

1. Administre 200 μL de solução de FITC-dextrana (5 mg / mL em PBS) aos camundongos em jejum por gavagem 22,5 h após a cirurgia (Figura 1A).
2. Eutanasiar os camundongos usando um método aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC), como inalação de CO₂ seguida de luxação cervical.
   1. Para isolar o trato digestivo, faça uma incisão na linha média do diafragma até a pelve, removendo cuidadosamente os tecidos e órgãos conjuntivos circundantes.
   2. Separe o trato digestivo dos tecidos e órgãos circundantes, garantindo que todo o trato do estômago ao ânus seja incluído.
3. Divida o trato digestivo em 15 segmentos iguais (do estômago ao cólon), numerados sequencialmente de 1 a 15 com base na posição fisiológica (sequência: St -S1: S10-Ce-L1: L3) (Figura 2A).
4. Corte cada segmento de tecido intestinal com seu conteúdo em pedaços medindo 1-4 mm e coloque-os em tubos de centrífuga separados de 1,5 mL contendo 1 mL de DPBS.
5. Vortex os tubos da centrífuga por 10 s para homogeneizar as amostras.
6. Centrifugue os tubos a 500 × g por 1 min. Colete o sobrenadante para quantificação de fluorescência FITC usando um leitor de microplacas multimodo.
7. Descreva o trânsito gastrointestinal calculando o centro geométrico (GC) do FITC-dextrano e calcule usando a seguinte fórmula: (Σ [% FITC por segmento x número de segmento])/100.

5. Inclusão em parafina e coloração de hematoxilina e eosina (HE)

1. Eutanasiar os camundongos por inalação de CO₂ seguida de luxação cervical após 24 h. Realize ensaios de inclusão de parafina e gastrointestinais no mesmo animal.
2. Abra a cavidade abdominal e colete o tecido do intestino delgado para análise posterior.
3. Fixe todo o intestino com conteúdo intestinal no fixador de Carnoy (60% de metanol + 10% de ácido acético + 30% de clorofórmio) a 4 °C por 2 h.
4. Desacidifique o tecido enxaguando duas vezes com metanol por 30 min de cada vez.
5. Substitua o metanol por etanol duas vezes por 30 minutos de cada vez.
6. Desacidifique o tecido enxaguando duas vezes com metanol por 30 min de cada vez. Para obter transparência tecidual com xileno, mergulhe o tecido em xileno e incube por 1 h.
7. Incorpore o tecido em cera de parafina usando uma máquina de inclusão de parafina. Corte o tecido incorporado em fatias de 4 μm de espessura usando um micrótomo.
   NOTA: Divida o intestino delgado em diferentes ceras para melhorar o desempenho. Rotule corretamente os segmentos para identificar sua localização.
8. Realize a coloração HE usando o kit de coloração HE. Sele as lâminas e examine-as ao microscópio para análise.

6. Isolamento de células imunes e citometria de fluxo

1. Prepare as seguintes soluções.
   1. Solução de pré-digestão: Prepare a solução salina balanceada de Hank sem Ca²⁺ e Mg²⁺ com 1 mM de ditiotreitol (DTT) e 10 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA).
   2. Solução de digestão: Prepare uma solução contendo 200 μg / mL de DNAase I, 500 μg / mL de colagenase IV, 4% de FBS e 100 μM de tampão HEPES em RPMI 1640.
   3. Tampão de trabalho de classificação de células ativadas por magnetismo (MACS): Prepare um tampão contendo 5 g/L de BSA e 2 mM de EDTA em PBS sem Ca²⁺ ou Mg²⁺.
2. Remova o conteúdo fecal lavando os intestinos com solução salina normal. Remova as placas de Peyer e o tecido conjuntivo do intestino delgado. Corte o intestino delgado longitudinalmente e, em seguida, corte em segmentos de 1 cm em PBS gelado.
3. Lave os segmentos intestinais com solução de pré-digestão a 37 °C durante 20 minutos num agitador orbital. Coletar a solução de pré-digestão e filtrá-la através de filtros de células de 70 μm para obter linfócitos intraepiteliais (IELs).
4. Digerir os segmentos na solução de digestão durante 30 minutos e, em seguida, filtrar a suspensão através de filtros celulares de 70 μm para obter linfócitos de lâmina própria (LPL).
5. Centrifugue as células LPL a 500 × g por 10 min e descarte o sobrenadante.
6. Lave e suspenda as células com DPBS (azida sódica, Tris e livre de proteínas) a uma concentração de 1 x 10⁶ células / 100 μL.
7. Incube as células com um corante de viabilidade fluorescente (1:500) por 15 min em temperatura ambiente (RT) no escuro.
8. Suspender as células com tampão MACS e centrifugá-las a 500 × g durante 5 min.
9. Conte as células coradas usando um hemocitômetro ou contador de células automatizado. Ressuspenda as células a uma concentração de 1 x 10⁶ células/100 μL de tampão MACS. Realize a coloração de anticorpos (1:200-1:400) adicionando o volume apropriado de anticorpo à suspensão celular e incubando a 4 °C por 15 min.
10. Lave as células conforme descrito na etapa 6.8.
11. Detecte as amostras usando citometria de fluxo e analise os dados com o software de citometria de fluxo associado ^7,8.

Resultados

Nesse protocolo, a IOP foi induzida cirurgicamente por manipulação intestinal (MI), que é semelhante ao efeito da cirurgia clínica. No grupo sham, foi feita uma incisão sem o MI. Os camundongos POI foram sacrificados 24 horas após a cirurgia de POI, juntamente com os camundongos controle simulados. A função crítica do trato digestivo, função de trânsito de conteúdo, foi detectada por gavagem de FITC-dextrana. O modelo POI foi considerado bem-sucedido porque a intensidade do ...

Discussão

O sucesso da cirurgia depende de várias etapas críticas. Primeiro, manter a consistência durante a cirurgia intramural intestinal (IM) é imperativo para induzir lesões extensas no intestino delgado. A pressão adequada aplicada durante o procedimento IM e o efeito hiperêmico resultante no intestino são cruciais para o sucesso cirúrgico. A observação de todo o trato digestivo ficando rosado e exibindo manchas hemorrágicas vermelhas após esfregar com um cotonete serviu como um ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M HEPES	Thermo	15630080
APC anti-mouse I-A/I-E (MHC-II)	Biolegend	107614
APC anti-mouse TCRb	Biolegend	109212
APC/Cy7 anti-mouse CD4	Biolegend	100414
APC/Cy7 anti-mouse Ly6G	Biolegend	127624
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD69	Biolegend	104545
Brilliant Violet 421 anti-mouse F4/80	Biolegend	123132
Brilliant Violet 785 anti-mouse/human CD44	Biolegend	103041
BUV395 anti-mouse CD8a	BD	563786
BUV737 anti-mouse CD3e	BD	612771
Collagenase IV	Sigma-Aldrich	C5138
Culture Microscope	CKX53	Olympus
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase I)	Sigma-Aldrich	DN25-5G
DL-Dithiothreitol solution	Sigma-Aldrich	43816-10ML
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS-100G
FITC anti-mouse CD45	Biolegend	147709
FITC-dextran (70 kWM)	Sigma-Aldrich	FD70-100MG	Gastrointestinal Transit Assay
HE staining kit	solarbio	G1120
PE anti-mouse CD11b	Biolegend	101208
PE anti-mouse PD-1	Biolegend	114118
PE/Cy7 anti-mouse CD11c	Biolegend	117318
Percoll	GE (Pharmacia)	17-0891-01
Symphony A5 Flow cytometer	BD	-	Immune cell detection and sorting
Tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402	Anesthesia
Varioskan LUX	Thermo	N16699	Multimode microplate reader
Zombie Aqua Fixable Viability kit	Biolegend	423102	Fluorescent viability dye