Modello murino di ileo postoperatorio

Riepilogo

Descriviamo un modello murino di ileo postoperatorio generato tramite manipolazione intestinale. La funzione del transito gastrointestinale, i cambiamenti patologici e l'attivazione delle cellule immunitarie sono stati valutati 24 ore dopo l'intervento chirurgico.

Abstract

La maggior parte dei pazienti sperimenta ileo postoperatorio (POI) dopo l'intervento chirurgico, che è associato a un aumento della morbilità, della mortalità e del tempo di ospedalizzazione. La POI è una conseguenza di un danno meccanico durante l'intervento chirurgico, con conseguente interruzione della motilità nel tratto gastrointestinale. I meccanismi dei POI sono correlati alla sensibilità neuronale aberrante, alla compromissione della funzione della barriera epiteliale e all'aumento dell'infiammazione locale. Tuttavia, i dettagli rimangono enigmatici. Pertanto, i modelli murini sperimentali sono fondamentali per chiarire la fisiopatologia e il meccanismo del danno dei POI e per lo sviluppo di nuove terapie.

Qui, introduciamo un modello murino di POI generato tramite manipolazione intestinale (IM) che è simile alla chirurgia clinica; Ciò si ottiene con un danno meccanico all'intestino tenue massaggiando l'addome 1-3 volte con un batuffolo di cotone. IM ha ritardato il transito gastrointestinale 24 ore dopo l'intervento chirurgico, come valutato mediante sonda gastrica FITC-destrano e rilevamento a fluorescenza del tratto digestivo segmentale. Inoltre, il rigonfiamento tissutale della sottomucosa e l'infiltrazione delle cellule immunitarie sono stati studiati mediante colorazione con ematossilina ed eosina e citometria a flusso. La corretta pressione dell'IM e un effetto iperemico sull'intestino sono fondamentali per la procedura. Questo modello murino di POI può essere utilizzato per studiare i meccanismi del danno intestinale e del recupero dopo la chirurgia addominale.

Introduzione

L'ileo postoperatorio (POI) è una sindrome che rappresenta una sfida significativa nel campo della salute umana, in particolare nella gestione dei pazienti sottoposti a chirurgia addominale. Caratterizzata da un ritardo nel recupero della motilità gastrointestinale, la POI contribuisce a prolungare le degenze ospedaliere e ad aumentare i costi sanitari, ma non esiste una definizione, un'eziologia o un trattamento stabiliti¹. Recenti ricerche hanno fatto luce sul ruolo fondamentale delle cellule immunitarie nella progressione dei POI ^2,3,4, ma sono necessarie ulteriori indagini per chiarire i meccanismi sottostanti coinvolti.

In questo protocollo, introduciamo un modello murino di POI indotto dalla chirurgia intra-addominale, che imita da vicino l'impatto della chirurgia addominale sul tratto digestivo. Il nostro obiettivo era quello di fornire un metodo standardizzato per la modellazione dei POI nei topi, consentendo ai ricercatori di studiarne la fisiopatologia ed esplorare nuovi interventi terapeutici.

Il razionale alla base dello sviluppo e dell'utilizzo di questa tecnica risiede nella necessità di modelli preclinici affidabili per lo studio dei POI. Gli approcci tradizionali allo studio dei POI spesso mancano di rilevanza traslazionale o non riescono a catturare la complessa interazione dei fattori che contribuiscono alla condizione. Introducendo un modello murino che replica fedelmente lo scenario clinico, i ricercatori possono studiare in modo più accurato i meccanismi alla base dei POI e testare potenziali interventi terapeutici in un contesto sperimentale controllato.

Rispetto alle tecniche alternative, il modello murino di POI presentato in questo protocollo offre diversi vantaggi. Inizialmente, abbiamo integrato i nostri risultati sperimentali con i recenti progressi per stabilire un protocollo standardizzato e riproducibile per l'induzione di POI negli animali da esperimento. Questo protocollo facilita la valutazione coerente della funzione del transito gastrointestinale. In secondo luogo, l'impiego della colorazione istologica e della citometria a flusso ha permesso di valutare il gonfiore dei tessuti, la proliferazione e l'attivazione delle cellule immunitarie, fornendo preziose informazioni sui processi infiammatori alla base del POI⁵.

Nel più ampio contesto della letteratura, la definizione di un modello murino di POI contribuisce all'espansione del corpo di ricerca volto a comprendere la fisiopatologia di questa condizione. Colmando il divario tra scienza di base e pratica clinica, i modelli preclinici svolgono un ruolo fondamentale nello sviluppo di nuove strategie terapeutiche per il POI⁶. Inoltre, la disponibilità di modelli animali standardizzati migliora la riproducibilità e la comparabilità dei risultati della ricerca tra diversi laboratori. Tuttavia, questo modello di POI si basa sulla stimolazione meccanica durante la procedura chirurgica. Altre forme di ileo indotto dalla stimolazione potrebbero non essere adatte a questo modello. Inoltre, i ricercatori dovrebbero considerare fattori come le normative sul benessere degli animali, le considerazioni etiche e la disponibilità di risorse quando pianificano esperimenti che utilizzano questo modello.

In sintesi, l'introduzione di un modello murino di POI significa un notevole progresso nella ricerca preclinica su questa condizione debilitante. Inoltre, abbiamo impiegato la colorazione H&E e la citometria a flusso per valutare il rigonfiamento dei tessuti e la proliferazione e l'attivazione delle cellule immunitarie. La creazione di un modello murino di POI faciliterebbe la scoperta dei meccanismi dei POI e promuoverebbe lo sviluppo di nuove terapie per i POI.

Protocollo

La cura degli animali e le procedure sperimentali sono state condotte in conformità con i Principi guida nella cura e nell'uso degli animali (Cina) e sono state approvate dal Comitato di revisione etica dell'Ospedale dell'amicizia di Pechino (n. 20-2056). Per lo studio sono stati utilizzati topi C57BL/6 (8-12 settimane).

1. Preparazione per l'intervento chirurgico

1. Digiunare tutti i topi per 12 ore prima della modellazione pianificata per soddisfare la standardizzazione delle condizioni sperimentali (Figura 1A).
2. Preparare e sterilizzare gli strumenti chirurgici.
3. Preparare l'anestetico tribromoetanolo e il termoforo. Monitorare il termoforo per evitare il surriscaldamento e mantenerlo a una temperatura costante (37,5 °C).

2. Anestesia

1. Anestetizzare ogni topo con tribromoetanolo.
   1. Diluire il tribromoetanolo per preparare una soluzione di 20 mg/mL in soluzione fisiologica. Somministrare 0,2 mL della soluzione di lavoro del tribromoetanolo per 10 g di peso corporeo tramite iniezione intraperitoneale. Usa un unguento oftalmico sugli occhi dei topi per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
   2. Assicurarsi che i topi siano completamente anestetizzati entro 5 minuti e rimangano anestetizzati per 20 minuti.
2. Valutare la profondità dell'anestesia osservando l'incapacità del topo di rimanere in posizione eretta e verificare il rilassamento muscolare. Osservare la perdita del movimento volontario, il riflesso dell'ammiccamento e la risposta alla stimolazione riflessa (pizzicare il dito del piede o della coda con una pressione decisa).
3. Valutare la frequenza respiratoria e il modello del topo monitorando il movimento della parete toracica e dell'addome. Assicurarsi che la frequenza respiratoria sia ~ 55-65 respiri/min in anestesia ottimale.
4. Posiziona il mouse anestetizzato su una tavola e fissalo con del nastro adesivo.
5. Dopo che i topi sono stati completamente anestetizzati, utilizzare un rasoio elettrico per rimuovere i peli dall'addome. Dopo la rasatura, rimuovere tutti i peli sciolti sull'addome con un batuffolo di cotone inumidito con soluzione salina.
   NOTA: Garantire una ventilazione adeguata e l'uso di una cappa aspirante o di una cappa di biosicurezza durante la manipolazione del tribromoetanolo per ridurre al minimo i rischi di esposizione. Durante la procedura, indossare dispositivi di protezione individuale adeguati, inclusi guanti e camici da laboratorio, per evitare il contatto accidentale con sostanze chimiche e materiali biologici.

3. Chirurgia

1. Estendere completamente gli arti per esporre l'addome. Assicurarsi che la testa del mouse sia posizionata in modo da mantenere libere le vie aeree (Figura 1B).
2. Disinfettare due volte la pelle dell'area chirurgica utilizzando un batuffolo di cotone imbevuto di alcol al 75%. Dopo la disinfezione, utilizzare una garza medica asciutta e sterile per rimuovere l'alcol in eccesso dall'addome. Somministrare lidocaina (10 mg/kg, per via sottocutanea) nel sito previsto prima dell'incisione.
3. Usa un bisturi sterile per praticare un'incisione nella pelle e solleva il muscolo retto dell'addome al centro dell'addome usando una pinzetta.
   1. Praticare una piccola incisione lungo la linea mediana del muscolo retto dell'addome, facendo attenzione a evitare lesioni ai vari organi dell'addome.
   2. Assicurarsi che l'intervallo approssimativo dell'incisione sia il seguente. Assicurarsi che il margine superiore dell'incisione sia a 6-8 mm dal processo xifoideo dello sterno, il margine inferiore sia a 6-8 mm dai genitali esterni e la lunghezza dell'incisione sia di ~1 cm.
4. Posizionare un pezzo di telo chirurgico sterile o una garza sterile su entrambi i lati dell'incisione addominale. Utilizzare una pinza emostatica per fissare la garza sterile sui bordi superiore e inferiore dell'incisione, esponendo l'incisione (Figura 1C).
   NOTA: Nel gruppo fittizio, l'incisione è stata coperta con una garza bagnata per 5 minuti senza alcuna operazione chirurgica.
5. Fissare correttamente il telo sterile o la garza, quindi utilizzare due tamponi di cotone pre-inumiditi con soluzione fisiologica per premere delicatamente contro entrambi i lati della parete addominale adiacente all'incisione. Spremere una piccola quantità di tubo intestinale attraverso l'incisione ed esporla posizionandola sul telo sterile o sulla garza (Figura 1D).
6. Inumidire completamente due tamponi di cotone sterili con soluzione fisiologica. Afferrare delicatamente il tessuto intestinale con i batuffoli di cotone inumiditi e rimuovere con cura l'intestino tenue.
   1. Localizzare il cieco e poi estrarre l'intestino con i tamponi di cotone sterili fino a 2 cm prima dello stomaco per evitare di toccare il pancreas. Estendere l'intestino dall'estremità prossimale del legamento pancreato-duodenale all'estremità distale della regione ileocecale.
7. Applicare una pressione costante lungo l'intero intestino tenue, dall'estremità prossimale a quella distale. Garantire un'applicazione uniforme della forza per 5 minuti fino a quando non emergono piccole macchie di sanguinamento sulla superficie intestinale (Figura 1E).
8. Dopo 5 minuti, utilizzare tamponi di cotone sterili pre-inumiditi per riposizionare con cura tutto l'intestino tenue nella cavità addominale, seguendo la normale posizione anatomica fisiologica dell'intestino tenue.
9. Massaggiare delicatamente l'addome sulla garza sterile e sulla parete addominale per 3-5 secondi per garantire che l'intestino venga ripristinato nella sua posizione anatomica naturale e per prevenire l'ostruzione meccanica artificiale dell'intestino o la torsione mesenterica dopo l'intervento chirurgico.
10. Iniettare 100 μL di soluzione salina nella cavità addominale per sostituire i liquidi persi durante l'operazione e lubrificare il tessuto addominale.
11. Chiudere l'addome utilizzando la sutura chirurgica 6-0 ed eseguire una chiusura a due strati in corrispondenza dell'incisione addominale. Inizia chiudendo lo strato muscolare con suture continue, facendo attenzione a evitare danni agli organi addominali. Sollevare il muscolo retto dell'addome durante la sutura (Figura 1F).
12. Dopo aver chiuso completamente il muscolo retto dell'addome, suturarlo completamente con semplici suture intermittenti utilizzando una sutura chirurgica 6-0. Mantenere una lunghezza del punto di ~0,5 mm e una distanza tra gli aghi di ~2 mm.
13. Dopo aver chiuso l'incisione addominale, strofinare delicatamente l'area vicino all'incisione con una garza medica sterile asciutta per mantenerla asciutta e pulita da sangue, liquido tissutale o soluzione fisiologica.
14. Applicare una piccola quantità di adesivo per incisioni mediche su e intorno all'incisione per evitare spaccature dopo l'intervento chirurgico.
15. Dopo che l'adesivo per incisione medica si è completamente asciugato, trasferire i topi su un tovagliolo di carta e posizionare il tovagliolo di carta della gabbia su una coperta riscaldata mantenuta a una temperatura costante di 37,5 °C fino a quando i topi non si riprendono completamente. Non lasciare gli animali incustoditi fino a quando non hanno ripreso conoscenza sufficiente per mantenere la decubito sternale.
16. Trasferisci i topi svegli nell'ambiente di barriera per l'alimentazione degli animali e lasciali bere liberamente fino al momento del rilevamento.

4. Saggio del transito gastrointestinale

1. Somministrare 200 μL di soluzione di FITC-destrano (5 mg/mL in PBS) ai topi a digiuno tramite sonda gastrica 22,5 ore dopo l'intervento chirurgico (Figura 1A).
2. Sopprimere i topi utilizzando un metodo approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), come l'inalazione di CO₂ seguita da lussazione cervicale.
   1. Per isolare il tratto digestivo, praticare un'incisione sulla linea mediana dal diaframma al bacino, rimuovendo con cura i tessuti connettivi e gli organi circostanti.
   2. Separare il tratto digestivo dai tessuti e dagli organi circostanti, assicurandosi che l'intero tratto dallo stomaco all'ano sia incluso.
3. Dividere il tubo digerente in 15 segmenti uguali (dallo stomaco al colon), numerati in sequenza da 1 a 15 in base alla posizione fisiologica (sequenza: St -S1:S10-Ce-L1:L3) (Figura 2A).
4. Tagliare ogni segmento di tessuto intestinale con il suo contenuto in pezzi di 1-4 mm e metterli in provette da centrifuga separate da 1,5 ml contenenti 1 ml di DPBS.
5. Agitare le provette da centrifuga per 10 s per omogeneizzare i campioni.
6. Centrifugare le provette a 500 × g per 1 min. Raccogliere il surnatante per la quantificazione della fluorescenza FITC utilizzando un lettore di micropiastre multimodale.
7. Descrivi il transito gastrointestinale calcolando il centro geometrico (GC) del FITC-destrano e calcola utilizzando la seguente formula: (Σ[% FITC per segmento x numero di segmento])/100.

5. Inclusione di paraffina e colorazione con ematossilina ed eosina (HE)

1. Eutanasia dei topi mediante inalazione di CO₂ seguita da lussazione cervicale dopo 24 ore. Eseguire l'inclusione di paraffina e i saggi gastrointestinali sullo stesso animale.
2. Aprire la cavità addominale e raccogliere il tessuto dell'intestino tenue per ulteriori analisi.
3. Fissare l'intero intestino con contenuto intestinale nel fissativo di Carnoy (60% metanolo + 10% acido acetico + 30% cloroformio) a 4 °C per 2 ore.
4. Deacidificare il tessuto risciacquando due volte con metanolo per 30 minuti ogni volta.
5. Sostituire il metanolo con l'etanolo due volte per 30 minuti ogni volta.
6. Deacidificare il tessuto risciacquando due volte con metanolo per 30 minuti ogni volta. Per ottenere la trasparenza del tessuto con lo xilene, immergere il tessuto nello xilene e incubare per 1 ora.
7. Incorporare il tessuto nella cera di paraffina utilizzando una macchina per l'inclusione della paraffina. Tagliare il tessuto incorporato in fette spesse 4 μm utilizzando un microtomo.
   NOTA: Dividi l'intestino tenue in diverse cere per migliorare le prestazioni. Etichettare correttamente i segmenti per identificarne la posizione.
8. Eseguire la colorazione HE utilizzando il kit di colorazione HE. Sigillare i vetrini ed esaminarli al microscopio per l'analisi.

6. Isolamento delle cellule immunitarie e citometria a flusso

1. Prepara le seguenti soluzioni.
   1. Soluzione di predigestione: Preparare la soluzione salina bilanciata di Hank senza Ca²⁺ e Mg²⁺ con 1 mM di ditiotreitolo (DTT) e 10 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA).
   2. Soluzione di digestione: preparare una soluzione contenente 200 μg/mL di DNAasi I, 500 μg/mL di collagenasi IV, FBS al 4% e 100 μM di tampone HEPES in RPMI 1640.
   3. Tampone MACS (Magnetic-Activated Cell Sorting Works): preparare un tampone contenente 5 g/L di BSA e 2 mM di EDTA in PBS senza Ca²⁺ o Mg²⁺.
2. Rimuovere il contenuto fecale lavando l'intestino con soluzione fisiologica. Rimuovere le chiazze di Peyer e il tessuto connettivo dell'intestino tenue. Tagliare l'intestino tenue aperto longitudinalmente e poi tagliarlo a spicchi di 1 cm in PBS ghiacciato.
3. Lavare i segmenti intestinali con una soluzione di predigestione a 37 °C per 20 minuti su un agitatore orbitale. Raccogliere la soluzione di predigestione e filtrarla attraverso filtri cellulari da 70 μm per ottenere linfociti intraepiteliali (IEL).
4. Digerire i segmenti nella soluzione di digestione per 30 minuti e poi filtrare la sospensione attraverso filtri cellulari da 70 μm per ottenere linfociti della lamina propria (LPL).
5. Centrifugare le celle LPL a 500 × g per 10 minuti e scartare il surnatante.
6. Lavare e sospendere le cellule con DPBS (azoturo di sodio, Tris e privo di proteine) a una concentrazione di 1 x 10⁶ cellule/100 μL.
7. Incubare le cellule con un colorante fluorescente di vitalità (1:500) per 15 minuti a temperatura ambiente (RT) al buio.
8. Sospendere le celle con il tampone MACS e centrifugarle a 500 × g per 5 min.
9. Contare le cellule colorate utilizzando un emocitometro o un contatore automatico di cellule. Risospendere le cellule a una concentrazione di 1 x 10⁶ cellule/100 μL di tampone MACS. Eseguire la colorazione degli anticorpi (1:200-1:400) aggiungendo il volume appropriato di anticorpi alla sospensione cellulare e incubando a 4 °C per 15 minuti.
10. Lavare le celle come descritto al punto 6.8.
11. Rileva i campioni utilizzando la citometria a flusso e analizza i dati con il software di citometria a flusso associato ^7,8.

Risultati

In questo protocollo, la POI è stata indotta chirurgicamente dalla manipolazione intestinale (IM), che è simile all'effetto della chirurgia clinica. Nel gruppo fittizio, è stata praticata un'incisione senza l'IM. I topi POI sono stati sacrificati 24 ore dopo l'intervento chirurgico insieme ai topi di controllo fittizi. La funzione critica del tratto digestivo, la funzione di transito del contenuto, è stata rilevata mediante sonda gastrica di FITC-destrano. Il modello POI è stato con...

Discussione

Il successo della chirurgia si basa su diversi passaggi critici. In primo luogo, mantenere la coerenza durante la chirurgia intramurale intestinale (IM) è fondamentale per indurre lesioni estese all'intestino tenue. La corretta pressione applicata durante la procedura IM e il conseguente effetto iperemico sull'intestino sono fondamentali per il successo chirurgico. L'osservazione dell'intero tratto digestivo che diventava rosa e mostrava macchie emorragiche rosse dopo lo sfregamento con...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M HEPES	Thermo	15630080
APC anti-mouse I-A/I-E (MHC-II)	Biolegend	107614
APC anti-mouse TCRb	Biolegend	109212
APC/Cy7 anti-mouse CD4	Biolegend	100414
APC/Cy7 anti-mouse Ly6G	Biolegend	127624
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD69	Biolegend	104545
Brilliant Violet 421 anti-mouse F4/80	Biolegend	123132
Brilliant Violet 785 anti-mouse/human CD44	Biolegend	103041
BUV395 anti-mouse CD8a	BD	563786
BUV737 anti-mouse CD3e	BD	612771
Collagenase IV	Sigma-Aldrich	C5138
Culture Microscope	CKX53	Olympus
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase I)	Sigma-Aldrich	DN25-5G
DL-Dithiothreitol solution	Sigma-Aldrich	43816-10ML
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS-100G
FITC anti-mouse CD45	Biolegend	147709
FITC-dextran (70 kWM)	Sigma-Aldrich	FD70-100MG	Gastrointestinal Transit Assay
HE staining kit	solarbio	G1120
PE anti-mouse CD11b	Biolegend	101208
PE anti-mouse PD-1	Biolegend	114118
PE/Cy7 anti-mouse CD11c	Biolegend	117318
Percoll	GE (Pharmacia)	17-0891-01
Symphony A5 Flow cytometer	BD	-	Immune cell detection and sorting
Tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402	Anesthesia
Varioskan LUX	Thermo	N16699	Multimode microplate reader
Zombie Aqua Fixable Viability kit	Biolegend	423102	Fluorescent viability dye