Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يعرض هذا البروتوكول تمايز الخلايا الآكلة للعظم البشري عن الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) ويصف طرق توصيف الخلايا الآكلة للعظم وسلائف ناقضة العظم.

Abstract

يفصل هذا البروتوكول انتشار وتمرير iPSCs البشرية وتمايزها إلى ناقضات عظمية. أولا ، يتم فصل iPSCs إلى تعليق أحادي الخلية لمزيد من الاستخدام في تحريض الجسم الجنيني. بعد تحريض الأديم المتوسط ، تخضع الأجسام الجنينية لتمايز المكونة للدم ، مما ينتج عنه مجموعة خلايا مكونة للدم عائمة. بعد ذلك ، تخضع الخلايا المكونة للدم المحصودة لخطوة نضوج عامل تحفيز مستعمرة البلاعم ، وأخيرا تمايز ناقضة العظم. بعد تمايز ناقضة العظم ، تتميز الخلايا الآكلة للعظم بتلطيخ TRAP بالتزامن مع بقعة نووية خضراء ميثيل. لوحظت الخلايا الآكلة للعظم على أنها متعددة النوى ، TRAP + متعددة النوى. يمكن دعم تحديدهم بشكل أكبر من خلال تلطيخ Cathepsin K. تسمح مقايسات ارتشاف العظام والمعادن بالتوصيف الوظيفي ، مما يؤكد هوية الخلايا الآكلة للعظم حسنة النية. يوضح هذا البروتوكول طريقة قوية ومتعددة الاستخدامات للتمييز بين الخلايا الآكلة للأخطاء البشرية والخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات البشرية ويسمح باعتمادها بسهولة في التطبيقات التي تتطلب كميات كبيرة من ناقضات العظم البشرية الوظيفية. يمكن تصور التطبيقات في مجالات أبحاث العظام وأبحاث السرطان وهندسة الأنسجة وأبحاث الأطراف الاصطناعية.

Introduction

الخلايا الآكلة للعظم (OCs) هي مشتقة من المكونة للدم 1,2 ، وأنواع خلايا متعددة الاستخدامات يشيع استخدامها من قبل الباحثين في مجالات مثل أبحاث أمراض العظام 3,4 ، وأبحاث السرطان 5,6 ، وهندسة الأنسجة 7,8 ، وأبحاث الأطراف الاصطناعية 9,10. ومع ذلك ، يمكن أن يكون تمايز OC أمرا صعبا لأن اندماج السلائف أحادية النواة في OCs متعددة النوى ضروري لإنشاء OCsوظيفية 11. العديد من العوامل البيولوجية ، مثل منشط مستقبلات NF-κB ligand (RANKL) وعامل تحفيز مستعمرة البلاعم (M-CSF) ، ضرورية لتمايز OC. تم الإبلاغ عن أن M-CSF له تأثير إيجابي على تكاثر الخلايا وبقاء الخلايا وتعبير RANK12،13،14. من ناحية أخرى ، يرتبط RANKL ب RANK ، الذي ينشط شلالات الإشارات النهائية التي تحفز تكوين العظم. يتم التوسط في التنشيط عبر العامل المرتبط بمستقبلات TNF 6 (TRAF6) ، مما يؤدي إلى تدهور العامل النووي لمحسن جين كابا الببتيد الضوئي في مثبط الخلايا البائية ، ألفا (IκB-α) ، وهو بروتين ملزم يربط ثنائيات NF-kB16,17. ومن ثم ، فإن تحلل IκB-α يطلق ثنائيات NF-kB ، والتي تنتقل بعد ذلك إلى النواة وتحفز التعبير عن عوامل النسخ c-Fos والعامل النووي للخلايا التائية المنشطة 1 (NFATc1). وهذا بدوره يؤدي إلى نسخ العديد من البروتينات المرتبطة بالتمايز OC15,18. تتوسط البروتينات غير المنظمة مثل DC-Stamp و Atp6v0d2 اندماج الخلايا الخلوية لسلائف OC ، مما يؤدي إلى تكوين الخلايا المخلوية19،20،21.

فيما يتعلق بالخلايا الأولية البشرية ، تعد CD34 + و CD14 + PBMCs حاليا أكثر أنواع الخلايا استخداما للتمايز إلى OCs22. ومع ذلك ، فإن هذا النهج محدود بسبب عدم التجانس داخل مجموعة CD34 + للخلايا المحصودة من المتبرعين23 وقابليتها المحدودة للتوسع. تقدم iPSCs البشرية مصدرا بديلا ل OCs. نظرا لأنه يمكن نشرها إلى أجل غير مسمى24 ، فإنها تسمح بالتوسع ورفع مستوى إنتاج OC. هذا يسمح بتمييز أعداد كبيرة من OCs ، مما يسهل أبحاث OC.

تم نشر العديد من البروتوكولات للتمييز بين iPSCs إلى OCs25،26،27. يمكن تقسيم عملية التمايز بأكملها إلى جزء انتشار iPSC ، وجزء تمايز الأديم المتوسط والمكونة للدم ، وتمايز OC. يسمح انتشار iPSCs قبل عملية التمايز برفع مستوى إنتاج OC قبل التمايز. توجد عدة طرق فيما يتعلق بالتمايز بين الأديم المتوسط والمكونة للدم. تقليديا ، تم استخدام تكوين الجسم الجنيني (EB) للتمييز بين الخلايا المكونة للدم ، لكن الأساليب القائمة على أحادية الطبقة تمثل استراتيجية تمايز أخرى مكونة للدم لا تتطلب تحريض EB. ومع ذلك ، يبدو أن الأنظمة القائمة على الطبقة الواحدة تتطلب مزيدا من التحسين ، حيث وجدنا نحن وآخرون أن الأساليب القائمة على EB أكثر قوة للتمييز بين OCs.

هنا ، نصف تمايز OCs عن iPSCs البشرية باستخدام بروتوكول قائم على EB. تم تكييف هذا البروتوكول من Rössler et al.26 وتعديله لزيادة المتانة والسماح بالحفظ بالتبريد أثناء عملية التمايز. أولا ، حصدنا الخلايا المكونة للدم مرة واحدة فقط بعد 10 أيام من التمايز. ثم تم حفظ الخلايا المكونة للدم بالتبريد للسماح بمزيد من المرونة أثناء عملية التمايز. بالإضافة إلى ذلك ، قمنا بزيادة كثافة بذر الخلايا المكونة للدم من 1 × 105 إلى 2 × 105 خلايا / سم2 لتمايز OC. تم استخدام وسط بشري أحدث خال من مصل iPSC (hiPSC-SFM ، انظر جدول المواد) ، وتم طلاء الآبار ب 200-300 ميكروغرام / مل من مستخلص الغشاء القاعدي (انظر جدول المواد) بدلا من 0.1٪ جيلاتين. لم تتم إضافة البنسلين / الستربتومايسين إلى وسائل الإعلام.

تم تكييف بروتوكول Rössler et al.26 في الأصل من iPSC إلى بروتوكول تمايز البلاعم28 الذي يستخدم تكوين EB للتمايز المكونة للدم. بينما تم استخدام تكوين EB لفترة طويلة من قبل الباحثين للتمايز المكونة للدم29،30 ، تم وصف العديد من طرق تحريض EB في الأدبيات ، مثل التجميع التلقائي ، والطرد المركزي في صفيحة بئر مستديرة القاع ، وثقافة قطرة معلقة ، وثقافة المفاعل الحيوي ، وثقافة الأنبوب المخروطي ، والوعاء الجانبي البطيء الدوران ، وثقافة هلام micromold31. يستخدم هذا البروتوكول الطرد المركزي ل iPSCs المنفصلة في لوحة بئر مستديرة القاع لتقريب خلايا iPSC المفردة من بعضها البعض وللسماح بتكوين الكرة (EB) ، كما هو موضح أدناه.

Protocol

ملاحظة: يمكن العثور على جميع الكواشف المستخدمة في هذا البروتوكول في جدول المواد. ما لم ينص على خلاف ذلك ، تمت موازنة جميع الوسائط مسبقا إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام. يتم تنفيذ جميع خطوات الطرد المركزي عند 37 درجة مئوية وباستخدام أبطأ وضع تسارع / تباطؤ. ما لم ينص على خلاف ذلك ، تتم إزالة المادة الطافية دائما باستخدام ماصات باستور الزجاجية التي تستخدم لمرة واحدة.

1. إذابة وانتشار iPSCs البشرية

  1. قبل يوم واحد من إذابة iPSCs ، قم بتغطية بئر من صفيحة 6 آبار ب 1 مل من مستخلص الغشاء القاعدي بتركيز 200-300 ميكروغرام / مل. ضع صفيحة البئر على حرارة 4 درجات مئوية طوال الليل.
  2. في اليوم التالي ، قم بإذابة الخلايا ونقلها إلى أنبوب سعة 15 مل باستخدام ماصة P1000. بالتنقيط ، أضف 5-7 مل من DMEM / F-12 مع 15 مللي متر HEPES.
  3. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 300 × غرام لمدة 5 دقائق. قم بإزالة الخلايا برفق من جهاز الطرد المركزي ، وتأكد من عدم إزعاج حبيبات الخلية.
  4. قم بإزالة المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة زجاجية باستور وأعد تعليق الخلايا في 1 مل من الوسط الخالي من مصل hiPSC (hiPSC-SFM الذي يحتوي على 10 ميكرومتر من مثبط Rho kinase (ROCK) Y-27632) باستخدام P1000 مع أطراف تجويف عريضة.
  5. نضح مستخلص الغشاء القاعدي من البئر المطلي في اليوم السابق (الخطوة 1.1) ونقل 1 مل من hiPSC-SFM مع 10 ميكرومتر Y-27632 إلى البئر. أضف iPSCs المعاد تعليقها إلى البئر للوصول إلى حجم نهائي يبلغ 2 مل لكل بئر.
  6. قم بتدوير اللوحة لتوزيع مجاميع iPSC بالتساوي قبل وضعها في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
  7. قم بإجراء تغييرات متوسطة كاملة كل يوم باستخدام hiPSC-SFM (بدون إضافة مثبط ROCK Y-27632). عادة ما تصل iPSCs إلى التقاء 70-80٪ بعد 3-4 أيام من الانتشار.

2. تمرير iPSCs

  1. قبل يوم واحد من تمرير iPSCs ، قم بتغطية آبار صفيحة 6 آبار بمستخلص غشاء قاعدي بتركيز 200-300 ميكروغرام / مل. ضع صفيحة البئر على حرارة 4 درجات مئوية طوال الليل.
    ملاحظة: تأكد من أن الخلايا قد وصلت إلى التقاء 70-80٪ تقريبا. تأكد من عدم فرط التلاقى بين iPSCs (أكثر من 80٪ من التقارب) ، لأن هذا سيعزز التمايز التلقائي.
  2. ابدأ في تمرير iPSCs عن طريق إزالة المناطق أو المناطق المتمايزة التي تحتوي على العديد من مجاميع iPSC الميتة تحت المجهر المجسم باستخدام أطراف ماصة 10 ميكرولتر أو 20 ميكرولتر أو مكشطة خلوية. ستظهر المناطق المتباينة أكثر كثافة أو بياضا في اللون.
    ملاحظة: قد تظل مجاميع الخلايا المكشطة متصلة جزئيا بقاع البئر.
  3. اغسل قاع البئر عدة مرات باستخدام ماصة P1000 ذات تجويف عريض لإزالة أي ركام قد لا يزال متصلا جزئيا بقاع البئر.
  4. تخلص من الوسط المستهلك الذي تمت فيه زراعة iPSCs والذي يحتوي على مجاميع iPSC المنفصلة. كرر خطوة الغسيل مرتين أخريين باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
  5. بعد ذلك ، أضف 1 مل من 5 U / mL Dispase لكل بئر. سوف ترتفع حواف مستعمرات iPSC من لوحة البئر ، والتي يمكن ملاحظتها تحت المجهر المجسم بعد 3-5 دقائق من الحضانة في درجة حرارة الغرفة.
  6. قم بإزالة Dispase بعناية لتجنب إزاحة الركام المنفصل قليلا وأضف 1 مل من DMEM / F-12 مع 15 mM HEPES. استخدم رافع الخلايا القابل للتصرف لتقطيع الركام إلى أحجام صغيرة. يمكن تحسين اتساق أحجام مجاميع iPSC باستخدام أداة تمرير الخلايا الجذعية.
  7. اغسل شرائح iPSC مع الوسط في البئر وانقل الوسط مع الركام إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل باستخدام ماصة مصلية سعة 5 مل أو P1000 بطرف تجويف عريض.
  8. اشطف البئر باستخدام DMEM / F-12 وانقل الوسط إلى أنبوب سعة 15 مل باستخدام ركام iPSC.
  9. أجهزة الطرد المركزي مجاميع iPSC المقطعة عند 200 × جم لمدة 3 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة زجاجية باستور وأضف 2 مل من hiPSC-SFM لإزاحة وإعادة تعليق iPSCs باستخدام ماصة مصلية سعة 5 مل أو P1000 مع أطراف تجويف عريضة.
  10. نضح مستخلص الغشاء القاعدي المتبقي من لوحة (لوحات) البئر المطلية مسبقا وأضف 1 مل من hiPSC-SFM إلى كل بئر من لوحة 6 آبار.
  11. انقل iPSCs إلى آبار جديدة من لوحة ذات 6 آبار بحيث يكون الحجم النهائي 2 مل من hiPSC-SFM لكل بئر باستخدام P1000 مع أطراف تجويف عريضة. اعتمادا على خط iPSC ، يجب تحسين نسب الانقسام. هنا ، تم استخدام نسبة تقسيم 1: 6.
  12. افحص البئر بحثا عن الركام العائم وحجم الركام تحت المجهر المجسم. من الناحية المثالية ، يجب أن يكون الحجم الكلي بين 50-200 ميكرومتر.
  13. قم بتدوير صفيحة البئر لتوزيع الخلايا بالتساوي عبر اللوحة بعد نقل الركام واحتضانها عند 37 درجة مئوية عند 5٪ CO2 حتى التقاء 70-80٪.

3. تجميد iPSCs مرة أخرى

  1. لتجميد خلايا iPSC مرة أخرى ، تمر الخلايا كما هو موضح أعلاه (انظر خطوة البروتوكول "2. تمرير iPSCs"). بعد تقطيع الخلايا إلى مستعمرات وغسلها من قاع البئر (الخطوة 2.10) ، قم بتدوير الركام المقطع إلى أسفل عند 200 × جم لمدة 3 دقائق. نضح الطاف.
  2. أضف 1 مل من وسط الحفظ بالتبريد الخالي من المصل لكل بئر من صفيحة 6 آبار إلى أنبوب 15 مل وأعد تعليق الركام المقطع باستخدام P1000 بطرف تجويف عريض.
  3. نقل الخلايا إلى أنابيب التبريد المسمى مسبقا. أغلق الأنابيب وأنابيب النقل في حاوية الحفظ بالتبريد المبردة مسبقا عند 4 درجات مئوية. قم بتخزين الخلايا في -80 درجة مئوية لمدة 24-48 ساعة.
  4. نقل cryovials إلى النيتروجين السائل للتخزين على المدى الطويل.
    ملاحظة: يوضح الشكل 1 ملخصا تخطيطيا لعملية تمايز OC.

4. تحريض الجسم الجنيني

  1. زراعة وتوسيع ما يكفي من iPSCs كما هو موضح أعلاه لتحريض EB.
    ملاحظة: يمكن زيادة إنتاج OC عن طريق زيادة عدد الأجسام الجنينية ، والتي بدورها تنتج إنتاجية أعلى بشكل عام من الخلايا المكونة للدم. ينتج بئر واحد من 70-80٪ من iPSCs المتقاربة ما يقرب من 8.4 × 105 خلايا لكل بئر من بئر 6 آبار. هناك حاجة إلى 12500 iPSCs أحادية الخلية لتشكيل جسم جنيني واحد.
  2. استنشاق الوسيط المستهلك من ثقافات iPSC وشطف مستعمرات iPSC باستخدام D-PBS.
  3. أضف 0.5 مل من كاشف تفكك الخلية أحادي الخلية المسخن مسبقا إلى درجة حرارة الغرفة إلى كل بئر من صفيحة 6 آبار وقم بتدوير وعاء الاستزراع لتغطية سطح البئر بالكامل. احتضان وعاء الاستزراع على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 5-8 دقائق.
  4. قم بإزالة الوعاء من الحاضنة ، واستنشق كاشف تفكك الخلية المفردة ، وأضف 1 مل من وسط تمايز المرحلة 1 إلى الآبار ، والذي يتكون من وسط خال من مصل hiPSC مع 50 نانوغرام / مل بروتين مورفوجيني للعظام البشرية 4 (hBMP4) ، 50 نانوغرام / مل عامل نمو بطانة الأوعية الدموية البشرية -165 (hVEGF) ، 20 نانوغرام / مل عامل الخلايا الجذعية البشرية (hSCF) ، و 10 ميكرومتر Y-27632.
  5. افصل الخلايا برفق عن طريق شطف البئر بوسط المرحلة 1. تجمع فصل iPSCs في أنبوب مخروطي 15 مل.
  6. أضف 1 مل من وسط تمايز المرحلة 1 إلى الآبار واغسل أي خلايا متبقية أو استخدم مكشطة الخلايا للمستعمرات التي لا تغسل بسهولة.
  7. بعد نقل جميع الخلايا إلى الأنبوب ، يتم استخدام أجهزة الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لتشكيل حبيبات خلوية. نضح الخلايا وإعادة تعليقها في إجمالي 2 مل من وسط التمايز المتوازن مسبقا من المرحلة 1 باستخدام ماصة مصلية 5 مل أو P1000 مع طرف تجويف عريض.
  8. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم أو جهاز عد الخلايا الآلي. أضف الوسط إلى الأنبوب سعة 15 مل الذي يحتوي على تعليق الخلية الواحدة إلى لوحة 12500 خلية لكل بئر في لوحة 96 بئر ذات قاع دائري منخفض للغاية في 100 ميكرولتر من وسط التمايز من المرحلة 1.
    ملاحظة: تحت المجهر ، ستظهر الخلايا كتعليق خلية واحدة مع خلايا منتشرة في جميع أنحاء البئر.
  9. أجهزة الطرد المركزي لوحات 96 بئر لمدة 3 دقائق في 100 × غرام. بعد الطرد المركزي ، يجب أن تبدأ الخلايا في تشبه الأجسام الكروية عند عرضها تحت المجهر. ضع اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
  10. قم بتغيير نصف الوسيط في اليوم 1 واليوم 2 باستخدام وسيط تمايز المرحلة 1. لتحسين الكفاءة ، استخدم ماصة متعددة القنوات للتخلص من 50 ميكرولتر من وسيط تمايز المرحلة 1 المستهلك في طبق بتري.
  11. بعد التخلص من الوسط من لوحة 96 بئرا ، تحقق من وجود EBs تحت المجهر المجسم الذي ربما تمت إزالته عن طريق الخطأ. انقل EBs التي تمت إزالتها عن طريق الخطأ إلى لوحة 96 بئرا باستخدام ماصة P1000 مع أطراف تجويف عريضة.
  12. أضف 50 ميكرولتر من وسط التمايز الطازج من المرحلة 1 إلى كل بئر من لوحة 96 بئرا ذات قاع دائري منخفض للغاية باستخدام ماصة متعددة القنوات.

5. تمايز المكونة للدم

  1. قبل يوم واحد من بدء التمايز المكونة للدم ، قم بتغطية بئر من صفيحة 6 آبار ب 1 مل من مستخلص الغشاء القاعدي بتركيز 200-300 ميكروغرام / مل. ضع صفيحة البئر على حرارة 4 درجات مئوية طوال الليل.
    ملاحظة: سيتلقى كل بئر 8 EBs في وقت لاحق من هذا البروتوكول. اعتمادا على عدد EBs المعدة ، قم بتغطية الآبار في المقابل.
  2. نضح مستخلص الغشاء القاعدي الزائد وملء الآبار مسبقا للوحة المكونة من 6 آبار ب 3 مل من وسط التمايز من المرحلة 2 ، والذي يتكون من وسط قاعدي مكون للدم يضاف إليه 2 mM Ultraglutamine ، و 55 μM 2-mercaptoethanol ، و 25 ng / mL interleukin 3 (hIL-3) ، و 100 ng / mL عامل تحفيز مستعمرة البلاعم البشرية (hM-CSF).
  3. باستخدام P1000 مع أطراف تجويف عريضة ، انقل 8 EBs إلى كل بئر من اللوحة المكونة من 6 آبار. بعد النقل ، تأكد بالعين أو تحت المجهر المجسم من وجود 8 EBs في كل بئر.
    ملاحظة: بعد يوم 1 ، سوف تلتزم EBs العائمة بقاع البئر. في الأيام 5-7 التالية ، يجب أن تصبح مجموعة الخلايا العائمة التي تضم خلايا المكونة للدم مرئية. يمكن أن تختلف فترة تمايز المكونة للدم ، بدءا من 7 أيام. أظهر التمايز لمدة 10 أيام مجموعة مكونة للدم تتكون من مجموعات فرعية كبيرة من CD45 + و CD14 + و CD11b + .
  4. بعد 5 أيام من العلاج بوسط التمايز من المرحلة 2 ، قم بإجراء تغيير متوسط عن طريق إزالة الوسط المستهلك وتوزيعه في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. ماصة ببطء لمحاولة إزالة أقل قدر ممكن من الخلايا العائمة والحفاظ على إجهاد القص عند أدنى مستوى ممكن. يمكن أن يساعد السحب تحت المجهر المجسم في تجنب الإزالة العرضية للخلايا.
  5. أضف على الفور 1 مل من وسط التمايز الطازج من المرحلة 2 إلى الآبار. من أجل استعادة أي خلايا مكونة للدم عائمة قد تكون موجودة بالفعل في هذه المرحلة من عملية التمايز ، لا تتخلص من الوسط المستغنى. بدلا من ذلك ، قم بتدوير الأنبوب باستخدام الوسيط المستهلك عند 300 × جم لمدة 5 دقائق ، واستنشاق المادة الطافية.
  6. أضف وسيط تمايز جديد من المرحلة 2 إلى الأنبوب وأعد تعليقه لفصل الخلايا التي ربما تم نقلها باستخدام الوسط المستهلك.
  7. أضف 2 مل من وسط التمايز الجديد للمرحلة 2 مع الخلايا المستردة في كل بئر ، والذي كان مملوءا مسبقا ب 1 مل من وسط تمايز المرحلة 2.
  8. في اليوم 10 من تمايز المكونة للدم ، تحقق من وجود أعداد كبيرة من الخلايا المكونة للدم العائمة. الحصاد عن طريق جمعها في أنبوب 50 مل. يمكن تجميدها مرة أخرى في 10٪ DMSO و 50٪ FBS و 40٪ متوسطة أو استخدامها على الفور لتمييز الخلايا إلى OCs.

6. نضج M-CSF وتمايز OC

  1. خلايا البذور بتركيز 200000 خلية / سم2 على زراعة الأنسجة تعامل بشكل جيد مع لوحات وتعالج مع alpha-MEM ، مع استكمال 10 ٪ FBS و 50 نانوغرام / مل hM-CSF.
  2. لإجراء فحوصات وظيفية أو تصوير ، افصل الخلايا الناضجة M-CSF بعد 3 أيام من البذر عن طريق الغسيل باستخدام PBS المسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية باستخدام P1000 بطرف تجويف عريض. قد تكون هناك حاجة إلى خطوات غسيل متكررة لفصل الخلايا بالكامل.
  3. انقل الخلايا المنفصلة إلى أنبوب سعة 15 مل باستخدام P1000 بطرف تجويف عريض وجهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية.
  4. إعادة تعليق وإذابة حبيبات الخلية باستخدام وسيط تمايز OC ، الذي يتكون من alpha-MEM المكمل ب 10٪ FBS و 50 نانوغرام / مل hM-CSF و 80 نانوغرام / مل hRANKL. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم أو جهاز عد الخلايا الآلي وأعد زرع الخلايا الناضجة M-CSF بكثافة 200,00-250,000 خلية / سم2 في أداة استزراع مناسبة للمقايسات الوظيفية أو التصوير (على سبيل المثال ، مقايسات ارتشاف العظام ، شرائح الغطاء للتصوير ، إلخ).
  5. التفريق مع وسيط تمايز OC لمدة 7-9 أيام. قم بإجراء تغيير متوسط بئر كامل باستخدام وسيط تمايز OC الطازج كل 2-3 أيام.
    ملاحظة: تظهر OCs متعددة النوى عادة بعد 5-7 أيام.

النتائج

مراقبة مورفولوجيا الخلية طوال عملية التمايز
تم إنشاء جميع النتائج الموضحة أدناه باستخدام خط MCND-TENS2 iPSC لتمايز OC. تم استخدام خط iPSC هذا سابقا في العديد من الدراسات 32,33. ومع ذلك ، تم أيضا استخدام خطوط iPSC الأخرى بنجاح مع بروتوكول التمايز هذا.

Discussion

يوفر هذا البروتوكول طريقة موثوقة وقوية للتمييز بين iPSCs إلى OCs. ومع ذلك ، هناك العديد من المزالق التي يمكن مواجهتها خلال عملية التمايز. تم تمييز خطوط iPSC البشرية المتولدة من خلايا من أصول أنسجة مختلفة بنجاح باستخدام هذا البروتوكول33. عند تجميد iPSCs مرة أخرى (انظر خطوة البروتوكول "3. ?...

Disclosures

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.

Acknowledgements

يود المؤلفون أن يشكروا أعضاء مختبر Giachelli على مساعدتهم الفنية ودعمهم. نشكر مركز W. M. Keck المجهري ومدير مركز Keck ، الدكتور Nathanial Peters ، للمساعدة في الحصول على الفحص المجهري متحد البؤر والصور المجهرية واسعة المجال. كما نشكر مرفق UW Flow Core ومدير مرفق التدفق الأساسي ، Aurelio Silvestroni ، على الدعم الفني والمساعدة. أخيرا ، نشكر Hannah Blümke على الدعم في الرسم التوضيحي والتصميم الجرافيكي.

تم توفير التمويل من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة R35 HL139602-01. نعترف أيضا بمنحة NIH S10 S10 OD016240 لتمويل الأدوات في مركز W. M. Keck بالإضافة إلى منحة NIH 1S10OD024979-01A1 لتمويل الأدوات في مرفق UW Flow الأساسي.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2-MercaptoethanolSigma AldrichM6250-10ML
Antibody - Anti-Cathepsin K Abcamab19027
Antibody - APC-conjugated Anti-Human CD45BD555485
Antibody - APC-conjugated Mouse IgG1, κ Isotype ControlBD555751
Antibody - BV711-conjugated Anti-Human CD14BD563372
Antibody - BV711-conjugates Mouse IgG2b, κ Isotype ControlBD563125
Antibody - Goat Anti-Rabbit IgG H&L Alexa Fluor® 647Abcamab150079
Antibody - PE-conjugated Anti-Human CD14R&D SystemsFAB3832P-025
Antibody - PE-conjugated Anti-Human Integrin alpha M/CD11bR&D SystemsFAB16991P-025
Antibody - PE-Cy7-conjugated Anti-Human CD34BD560710
Antibody - PE-Cy7-conjugated Mouse IgG1 κ Isotype ControlBD557872
Antibody - PE/Cyanine5-conjugated Anti-Human CD11bBiolegend301308
Antibody - PE/Cyanine5-conjugated Mouse IgG1, κ Isotype CtrlBiolegend400118
Antibody - PerCP-Cy5.5-conjugated Mouse IgG1 κ Isotype ControlBD550795
Antibody - PerCpCy5.5-conjugated Anti-Human CD43BD563521
Bone Resorption Assay KitCosmoBioUSACSR-BRA-24KIT
Countess 3 Automated Cell CounterThermoFisher16812556
Cultrex Stem Cell Qualified Reduced Growth Factor Basement Membrane ExtractR&D Sytems3434-010-02Basal membrane extract
DAPIR&D Systems5748/10
Dispase (5 U/mL)STEMCELL Technologies7913
DMEM/F-12 with 15 mM HEPESStem Cell36254
DMSOSigma AldrichD2650
DPBSSigma AldrichD8537-500ML
Human Bone Morphogenetic Protein 4 (hBMP4)STEMCELL Technologies78211
Human IL-3STEMCELL Technologies78146.1
Human Macrophage Colony-stimulating Factor (hM-CSF)STEMCELL Technologies78150.1
Human Soluble Receptor Activator of Nuclear Factor-κB Ligand (hsRANKL)STEMCELL Technologies78214.1
Human Stem Cell Factor (hSCF)STEMCELL Technologies78155.1
Human TruStain FcX (Fc Receptor Blocking Solution)Biolegend422301
Human Vascular Endothelial Growth Factor-165 (hVEGF165)STEMCELL Technologies78073
Invitrogen Rhodamine PhalloidinInvitrogenR415
MEM α, nucleosides, no phenol redThermoFisher41061029
mFreSRSTEMCELL Technologies05855Serum free cryopreservation medium
mTeSR Plus mediumSTEMCELL Technologies100-0276Human iPSC-serum free medium (hiPSC-SFM)
Nunclon Sphera 96-Well, Nunclon Sphera-Treated, U-Shaped-Bottom MicroplateThermo Scientific174925Round bottom ultra-low attachment 96-well plate
P1000 Wide Bore TipsThermoFisher2079GPK
ROCK-Inhibitor Y-27632STEMCELL Technologies72304
StemSpan SFEMStemCell09650Hematopoietic cell culture medium
TrypLE Select Enzyme (1X), no phenol redThermo Fisher12563011Single-cell dissociation reagent
UltraglutamineBioscience LonzaBE17-605E/U1
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell MediumBioscience Lonza04-418QHematopoietic basal medium
µ-Slide 8 Well HighIbidi80806

References

  1. Bar-Shavit, Z. The osteoclast: A multinucleated, hematopoietic-origin, bone-resorbing osteoimmune cell. Journal of Cellular Biochemistry. 102 (5), 1130-1139 (2007).
  2. Boyce, B. F. Advances in the regulation of osteoclasts and osteoclast functions. Journal of Dental Research. 92 (10), 860-867 (2013).
  3. Buranaphatthana, W., et al. Engineered osteoclasts resorb necrotic alveolar bone in anti-RANKL antibody-treated mice. Bone. 153, 116144 (2021).
  4. Wang, L., et al. Isolation, purification, and differentiation of osteoclast precursors from rat bone marrow. Journal of Visualized Experiments. 2019 (147), e58895 (2019).
  5. Mercatali, L., et al. Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines. Journal of Visualized Experiments. (127), e56311 (2017).
  6. Marino, S., Bishop, R. T., de Ridder, D., Delgado-Calle, J., Reagan, M. R. 2D and 3D in vitro co-culture for cancer and bone cell interaction studies. Methods in Molecular Biology. 1914, 71-98 (2019).
  7. Rementer, C. W., et al. An inducible, ligand-independent receptor activator of NF-κB gene to control osteoclast differentiation from monocytic precursors. PloS One. 8 (12), e0084465 (2013).
  8. Rementer, C., et al. Engineered myeloid precursors differentiate into osteoclasts and resorb heterotopic ossification in mice. Research Square Priprint. , 2156913 (2022).
  9. Bjelić, D., Finšgar, M. Bioactive coatings with anti-osteoclast therapeutic agents for bone implants: Enhanced compliance and prolonged implant life. Pharmacological Research. 176, 106060 (2022).
  10. Minkin, C., Marinho, V. C. Role of the osteoclast at the bone-implant interface. Advances in dental research. 13, 49-56 (1999).
  11. Kodama, J., Kaito, T. Osteoclast multinucleation: Review of current literature. International Journal of Molecular Sciences. 21 (16), 1-35 (2020).
  12. Mun, S. H., Park, P. S. U., Park-Min, K. H. The M-CSF receptor in osteoclasts and beyond. Experimental & Molecular Medicine. 52 (8), 1239-1254 (2020).
  13. Plotkin, L. I., Bivi, N. Local regulation of bone cell function. Basic and Applied Bone Biology. , 47-73 (2014).
  14. Hodge, J. M., Kirkland, M. A., Nicholson, G. C. Multiple roles of M-CSF in human osteoclastogenesis. Journal of Cellular Biochemistry. 102 (3), 759-768 (2007).
  15. Ono, T., Nakashima, T. Recent advances in osteoclast biology. Histochemistry and Cell Biology. 149 (4), 325-341 (2018).
  16. Boyce, B. F., Xiu, Y., Li, J., Xing, L., Yao, Z. NF-κB-mediated regulation of osteoclastogenesis. Endocrinology and Metabolism. 30 (1), 35 (2015).
  17. Novack, D. V. Role of NF-κB in the skeleton. Cell Research. 21 (1), 169-182 (2010).
  18. Kim, K., Lee, S. H., Jung, H. K., Choi, Y., Kim, N. NFATc1 induces osteoclast fusion via up-regulation of Atp6v0d2 and the dendritic cell-specific transmembrane protein (DC-STAMP). Molecular Endocrinology. 22 (1), 176-185 (2008).
  19. Wu, H., Xu, G., Li, Y. P. Atp6v0d2 is an essential component of the osteoclast-specific proton pump that mediates extracellular acidification in bone resorption. Journal of Bone and Mineral Research. 24 (5), 871 (2009).
  20. Vignery, A. Macrophage fusion: The making of osteoclasts and giant cells. The Journal of Experimental Medicine. 202 (3), 337 (2005).
  21. Chiu, Y. H., Ritchlin, C. T. DC-STAMP: A key regulator in osteoclast differentiation. Journal of Cellular Physiology. 231 (11), 2402 (2016).
  22. Riedlova, P., Sood, S., Goodyear, C. S., Ansalone, C. Differentiation of functional osteoclasts from human peripheral blood CD14+ monocytes. Journal of Visualized Experiments. (191), e64698 (2023).
  23. Gothot, A., Pyatt, R., McMahel, J., Rice, S., Srour, E. F. Functional heterogeneity of human CD34+ cells isolated in subcompartments of the G0 /G1 phase of the cell cycle. Blood. 90 (11), 4384-4393 (1997).
  24. Dinella, J., Koster, M. I., Koch, P. J. Use of induced pluripotent stem cells in dermatological research. The Journal of Investigative Dermatology. 134 (8), e23 (2014).
  25. Grigoriadis, A. E., et al. Directed differentiation of hematopoietic precursors and functional osteoclasts from human ES and iPS cells. Blood. 115 (14), 2769-2776 (2010).
  26. Rössler, U., et al. Efficient generation of osteoclasts from human induced pluripotent stem cells and functional investigations of lethal CLCN7-related osteopetrosis. Journal of Bone and Mineral Research: The Official Journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 36 (8), 1621-1635 (2021).
  27. Chen, I. -. P. Differentiation of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) into osteoclasts. Bio-Protocol. 10 (24), e3854-e3854 (2020).
  28. Buchrieser, J., James, W., Moore, M. D. Human induced pluripotent stem cell-derived macrophages share ontogeny with MYB-independent tissue-resident macrophages. Stem Cell Reports. 8 (2), 334-345 (2017).
  29. Abe, K., et al. Endoderm-specific gene expression in embryonic stem cells differentiated to embryoid bodies. Experimental Cell Research. 229 (1), 27-34 (1996).
  30. Perlingeiro, R. C. R., Kyba, M., Daley, G. Q. Clonal analysis of differentiating embryonic stem cells reveals a hematopoietic progenitor with primitive erythroid and adult lymphoid-myeloid potential. Development. 128 (22), 4597-4604 (2001).
  31. Pettinato, G., Wen, X., Zhang, N. Engineering strategies for the formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 24 (14), 1595 (2015).
  32. Ruiz, J. P., et al. Robust generation of erythroid and multilineage hematopoietic progenitors from human iPSCs using a scalable monolayer culture system. Stem Cell Research. 41, 101600 (2019).
  33. Blümke, A., et al. Comparison of osteoclast differentiation protocols from human induced pluripotent stem cells of different tissue origins. Stem Cell Research & Therapy. 14 (1), 319 (2023).
  34. Klepikova, A., et al. iPSC-Derived Macrophages: The differentiation protocol affects cell immune characteristics and differentiation trajectories. International Journal of Molecular Sciences. 23 (24), 16087 (2022).
  35. Neely, M. D., Tidball, A. M., Aboud, A. A., Ess, K. C., Bowman, A. B. Induced pluripotent stem cells (iPSCs): An emerging model system for the study of human neurotoxicology. Neuromethods. 56, 27-61 (2011).
  36. Doulatov, S., et al. Induction of multipotential hematopoietic progenitors from human pluripotent stem cells via re-specification of lineage-restricted precursors. Cell Stem Cell. 13 (4), 459-470 (2013).
  37. Van Winkle, A. P., Gates, I. D., Kallos, M. S. Mass transfer limitations in embryoid bodies during human embryonic stem cell differentiation. Cells, Tissues, Organs. 196 (1), 34-47 (2012).
  38. Kim, J. M., et al. Assessment of differentiation aspects by the morphological classification of embryoid bodies derived from human embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 20 (11), 1925-1935 (2011).
  39. Mohr, J. C., et al. The microwell control of embryoid body size in order to regulate cardiac differentiation of human embryonic stem cells. Biomaterials. 31 (7), 1885-1893 (2010).
  40. Lopez-Yrigoyen, M., et al. Production and characterization of human macrophages from pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (158), e61038 (2020).
  41. Cao, X., et al. Differentiation and functional comparison of monocytes and macrophages from hiPSCs with peripheral blood derivatives. Stem Cell Reports. 12 (6), 1282 (2019).
  42. Omata, Y., et al. Interspecies single-cell RNA-seq analysis reveals the novel trajectory of osteoclast differentiation and therapeutic targets. JBMR Plus. 6 (7), e10631 (2022).
  43. Hodge, J. M., Kirkland, M. A., Nicholson, G. C. Multiple roles of M-CSF in human osteoclastogenesis. Journal of Cellular Biochemistry. 102 (3), 759-768 (2007).
  44. Kim, N., Takami, M., Rho, J., Josien, R., Choi, Y. A novel member of the leukocyte receptor complex regulates osteoclast differentiation. The Journal of Experimental Medicine. 195 (2), 201 (2002).
  45. Nedeva, I. R., Vitale, M., Elson, A., Hoyland, J. A., Bella, J. Role of OSCAR signaling in psteoclastogenesis and bone disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 641162 (2021).
  46. Bernhardt, A., Schamel, M., Gbureck, U., Gelinsky, M. Osteoclastic differentiation and resorption is modulated by bioactive metal ions Co2+, Cu2+ and Cr3+ incorporated into calcium phosphate bone cements. PLoS One. 12 (8), e0182109 (2017).
  47. Akasaka, T., et al. Different micro/nano-scale patterns of surface materials influence osteoclastogenesis and actin structure. Nano Research. 15 (5), 4201-4211 (2022).
  48. Hobolt-Pedersen, A. S., Delaissé, J. M., Søe, K. Osteoclast fusion is based on heterogeneity between fusion partners. Calcified Tissue International. 95 (1), 73 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

205

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved