Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מציג את ההתמיינות של אוסטאוקלסטים אנושיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) ומתאר שיטות לאפיון אוסטאוקלסטים ומבשרי אוסטאוקלסט.

Abstract

פרוטוקול זה מפרט את ההתפשטות וההעברה של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים ואת התמיינותם לאוסטאוקלסטים. ראשית, תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים מנותקים לתרחיף חד-תאי לשימוש נוסף בהשראת גוף עוברי. לאחר השראת מזודרמיס, גופים עובריים עוברים התמיינות המטופויטית, ומייצרים אוכלוסיית תאים המטופויטיים צפה. לאחר מכן, התאים ההמטופויטיים שנקטפו עוברים שלב הבשלה של גורם מגרה מושבת מקרופאגים, ולבסוף התמיינות אוסטאוקלסט. לאחר התמיינות אוסטאוקלסט, אוסטאוקלסטים מאופיינים על ידי צביעה עבור TRAP בשילוב עם כתם גרעיני ירוק מתיל. אוסטאוקלסטים נצפים כפוליקריוני TRAP+ מרובי גרעינים. זיהויים יכול להיות נתמך עוד יותר על ידי צביעת Cathepsin K. בדיקות ספיגת עצם ומינרלים מאפשרות אפיון פונקציונלי, המאשר את זהותם של אוסטאוקלסטים בתום לב. פרוטוקול זה מדגים שיטה חזקה ורב-תכליתית להבדיל אוסטאוקלסטים אנושיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים ומאפשר אימוץ קל ביישומים הדורשים כמויות גדולות של אוסטאוקלסטים אנושיים פונקציונליים. ניתן לחזות יישומים בתחומי חקר העצם, חקר הסרטן, הנדסת רקמות ומחקר אנדופרוטזה.

Introduction

אוסטאוקלסטים (OCs) הם סוגי תאים רב-תכליתיים 1,2 שמקורם בהמטופויאטיים, הנמצאים בשימוש נפוץ על ידי חוקרים בתחומים כגון חקר מחלות עצם 3,4, חקר הסרטן 5,6, הנדסת רקמות 7,8 ומחקר אנדופרוטזה 9,10. אף על פי כן, התמיינות OC יכולה להיות מאתגרת מכיוון שמיזוג של מבשרי מונו-גרעיניים לתוך OCs מרובי גרעינים הוא הכרחי כדי ליצור OCs11 פונקציונליים. מספר גורמים ביולוגיים, כגון מפעיל קולטן של ליגנד NF-κB (RANKL) וגורם מגרה מושבת מקרופאגים (M-CSF), נחוצים להתמיינות OC. M-CSF דווח כבעל השפעה חיובית על התפשטות תאים, הישרדות תאים וביטוי RANK 12,13,14. מצד שני, RANKL נקשר ל- RANK, אשר מפעיל מפל איתות במורד הזרם המשרה אוסטאוקלסטוגנזה. ההפעלה מתווכת באמצעות גורם 6 הקשור לקולטן TNF (TRAF6), המוביל לפירוק הגורם הגרעיני של משפר הגן פוליפפטיד קל קאפה במעכב תאי B, אלפא (IκB-α), חלבון קושר הקושר דימרים NF-kB16,17. לפיכך, התפרקות IκB-α משחררת דימרים NF-kB, אשר לאחר מכן עוברים טרנסלוקציה לתוך הגרעין וגורמים לביטוי של גורמי השעתוק c-Fos וגורם גרעיני של תאי T מופעלים 1 (NFATc1). זה, בתורו, מפעיל את השעתוק של מספר רב של חלבונים הקשורים התמיינות OC15,18. חלבונים מווסתים כגון DC-Stamp ו-Atp6v0d2 מתווכים איחוי תאים-תאים של מבשרי OC, מה שמוביל להיווצרות סינקיטיום 19,20,21.

ביחס לתאים ראשוניים אנושיים, CD34+ ו- CD14+ PBMCs הם כיום סוגי התאים הנפוצים ביותר להתמיינות לOCs22. עם זאת, גישה זו מוגבלת על ידי ההטרוגניות באוכלוסיית CD34+ של תאים שנקטפו מתורמים23 ויכולת ההרחבה המוגבלת שלהם. תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים מהווים מקור חלופי לOCs. מכיוון שניתן להפיץ אותם ללא הגבלת זמן24, הם מאפשרים הרחבה ושדרוג של ייצור OC. זה מאפשר הבחנה של מספר גדול של OCs, אשר מאפשר מחקר OC.

מספר פרוטוקולים להבחנה של iPSCs ל- OCs פורסמו 25,26,27. ניתן לחלק את כל תהליך ההתמיינות לחלק התפשטות iPSC, חלק התמיינות מזודרמלי והמטופויאטי, והתמיינות OC. התפשטות של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים לפני תהליך הבידול מאפשרת שדרוג של ייצור המהרה לפני הבידול. קיימות מספר גישות לגבי התמיינות מזודרמלית והמטופויאטית. באופן מסורתי, היווצרות גוף עוברי (EB) שימשה כדי להתמיין תאים hematopoietic, אבל גישות מבוססות monolayer מייצגים אסטרטגיית התמיינות hematopoietic אחרת שאינה דורשת השראת EB. עם זאת, נראה כי מערכות מבוססות מונו-שכבות דורשות אופטימיזציה נוספת, מכיוון שאנו ואחרים מצאנו שגישות מבוססות EB עמידות יותר לבידול של OCs.

במאמר זה אנו מתארים את ההבחנה בין OCs לבין תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים באמצעות פרוטוקול מבוסס EB. פרוטוקול זה הותאם מ- Rössler et al.26 והותאם כדי להגביר את החוסן ולאפשר שימור בהקפאה במהלך תהליך הבידול. ראשית, קצרנו תאים המטופויטיים רק פעם אחת לאחר 10 ימים של התמיינות. תאים המטופויטיים נשמרו אז בהקפאה כדי לאפשר גמישות רבה יותר בתהליך ההתמיינות. בנוסף, הגדלנו את צפיפות זריעת התאים ההמטופויטיים מ-1 x 105 ל-2 x 105 תאים לסמ"ר2 לצורך התמיינות OC. נעשה שימוש בתווך חדש יותר ללא סרום iPSC אנושי (hiPSC-SFM, ראו טבלת חומרים), וציפוי בארות בוצע עם 200-300 מיקרוגרם/מ"ל של תמצית קרום בסיסי (ראו טבלת חומרים) במקום 0.1% ג'לטין. פניצילין/סטרפטומיצין לא נוסף לתקשורת.

הפרוטוקול של Rössler et al.26 הותאם במקור מ-iPSC לפרוטוקול התמיינות מקרופאגים28 המשתמש בהיווצרות EB להתמיינות המטופויטית. בעוד היווצרות EB שימשה במשך זמן ממושך על ידי חוקרים עבור התמיינות hematopoietic29,30, מספר שיטות של אינדוקציה EB תוארו בספרות, כגון צבירה ספונטנית, צנטריפוגה בצלחת באר עגולה תחתית, תרבית טיפה תלויה, תרבית ביוריאקטורים, תרבית צינור חרוט, כלי לרוחב מסתובב לאט, ותרבית ג'ל micromold31. פרוטוקול זה משתמש בצנטריפוגה של iPSCs מנותקים בלוח באר עגול למטה כדי להביא תאי iPSC בודדים לקרבה זה לזה ולאפשר היווצרות כדור (EB), כמתואר להלן.

Protocol

הערה: ניתן למצוא את כל הריאגנטים המשמשים בפרוטוקול זה בטבלת החומרים. אלא אם צוין אחרת, כל חומרי ההדפסה שוונו מראש ל-37°C לפני השימוש. כל שלבי הצנטריפוגה מבוצעים ב-37°C ובאמצעות מצב האצה/האטה האיטי ביותר. אלא אם כן צוין אחרת, סופרנאטנט מוסר תמיד באמצעות פיפטות זכוכית פסטר חד פעמיות.

1. הפשרה והפצה של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים

  1. יום לפני הפשרת תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים יש לצפות באר של צלחת בעלת 6 בארות ב-1 מ"ל תמצית קרום בסיסי בריכוז של 200-300 מק"ג/מ"ל. מניחים את צלחת הבאר על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  2. למחרת, להפשיר ולהעביר את התאים לתוך צינור 15 מ"ל באמצעות פיפטה P1000. Dropwise, להוסיף 5-7 מ"ל של DMEM/F-12 עם 15 mM HEPES.
  3. צנטריפוגה את התאים ב 300 x גרם במשך 5 דקות. הוציאו בעדינות את התאים מהצנטריפוגה, והקפידו לא להפריע לכדורית התא.
  4. הסר בזהירות את הסופרנאטנט עם פיפטה מזכוכית פסטר והשהה מחדש את התאים ב-1 מ"ל של מדיום נטול סרום hiPSC (hiPSC-SFM המכיל 10 מיקרומטר של מעכב Rho kinase (ROCK) Y-27632) באמצעות P1000 עם קצוות רחבים.
  5. שאפו את תמצית קרום הבסיס מהמצופה היטב ביום הקודם (שלב 1.1) והעבירו 1 מ"ל של hiPSC-SFM עם 10 מיקרומטר Y-27632 לבאר. הוסף iPSCs מרחפים לבאר כדי להגיע לנפח סופי של 2 מ"ל לכל באר.
  6. סובבו את הצלחת לפיזור שווה של אגרגטי iPSC לפני הכנסתם לאינקובטור בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2.
  7. בצע שינויים בינוניים מלאים אחת ליומיים באמצעות hiPSC-SFM (ללא תוספת של מעכב ROCK Y-27632). iPSCs בדרך כלל מגיעים 70-80% מפגש לאחר 3-4 ימים של התפשטות.

2. iPSCs עוברים

  1. יום אחד לפני העברת iPSCs, מצפים בארות של צלחת 6 בארות עם תמצית קרום בסיסי בריכוז של 200-300 מיקרוגרם / מ"ל. מניחים את צלחת הבאר על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    הערה: ודא שהתאים הגיעו למפגש של 70-80% בקירוב. ודא iPSCs לא מקבל overfluent (יותר מ 80% confluency), כמו זה יקדם דיפרנציאציה ספונטנית.
  2. התחל לעבור iPSCs על ידי הסרת אזורים מובחנים או אזורים עם אגרגטים מתים רבים iPSC מתחת לסטריאומיקרוסקופ באמצעות 10 μL או 20 μL פיפטה קצוות או מגרד תאים. אזורים מובחנים ייראו צפופים יותר או לבנים יותר בצבע.
    הערה: צברי תאים מגרדים עשויים עדיין להתחבר חלקית לתחתית הבאר.
  3. שטפו את קרקעית הבאר מספר פעמים עם פיפטה P1000 רחבה כדי להסיר אגרגטים שעדיין עשויים להיות מחוברים חלקית לתחתית הבאר.
  4. השליכו את המדיום המשומש שבו טופחו ה-iPSCs המכיל את אגרגטי ה-iPSC המנותקים. חזור על שלב הכביסה פעמיים נוספות עם מלח חוצץ פוספט (PBS).
  5. לאחר מכן, להוסיף 1 מ"ל של 5 U/mL Dispase לכל באר. קצוות מושבות iPSC יתרוממו מלוח הבאר, אותו ניתן לצפות תחת המיקרוסקופ הסטריאוסקופי לאחר דגירה של 3-5 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. בזהירות להסיר Dispase כדי למנוע עקירה של אגרגטים מנותקים מעט ולהוסיף 1 מ"ל של DMEM/F-12 עם 15 mM HEPES. השתמשו במרים תאים חד פעמי כדי לפרוס את האגרגטים לגדלים קטנים. ניתן לשפר את העקביות של גדלי צבירת iPSC באמצעות כלי העברת תאי גזע.
  7. לשטוף את אגרגטים iPSC פרוס עם המדיום בבאר ולהעביר את המדיום עם אגרגטים לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל באמצעות פיפטה סרולוגית 5 מ"ל או P1000 עם קצה רחב משעמם.
  8. שטפו את הבאר עם DMEM/F-12 והעבירו את התווך לצינור של 15 מ"ל עם אגרגטים iPSC.
  9. צנטריפוגה את צברי iPSC פרוסים ב 200 x גרם במשך 3 דקות. הסר את הסופרנאטנט עם פיפטה מזכוכית פסטר והוסף 2 מ"ל של hiPSC-SFM כדי לעקור ולהשהות מחדש את תאי ה- iPSC באמצעות פיפטה סרולוגית של 5 מ"ל או P1000 עם קצוות רחבים.
  10. שאפו את שאריות תמצית קרום הבסיס מהצלחת המצופה מראש והוסיפו 1 מ"ל של hiPSC-SFM לכל באר של צלחת 6 הקידוחים.
  11. העבר iPSCs לתוך בארות חדשות של צלחת 6 בארות כך שהנפח הסופי הוא 2 מ"ל של hiPSC-SFM לכל באר באמצעות P1000 עם קצוות משעממים רחבים. בהתאם לקו iPSC, יש למטב את יחסי הפיצול. כאן נעשה שימוש ביחס פיצול של 1:6.
  12. בדוק את הבאר עבור אגרגטים צפים וגודל צבר מתחת לסטריאומיקרוסקופ. באופן אידיאלי, הגודל המצטבר צריך להיות בין 50-200 מיקרומטר.
  13. מערבלים את צלחת הבאר כדי לפזר את התאים באופן שווה על פני הצלחת לאחר העברת האגרגטים ולדגור ב 37 ° C ב 5% CO2 עד 70-80% מפגש.

3. הקפאת תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים

  1. כדי להקפיא תאי iPSC בחזרה, תאי מעבר כמתואר לעיל (ראה שלב פרוטוקול "2. העברת iPSCs"). לאחר שהתאים נחתכו למושבות ונשטפו מתחתית הבאר (שלב 2.10), סובבו את האגרגטים החתוכים במהירות של 200 x גרם למשך 3 דקות. שאפו את הסופר-נאנט.
  2. הוסף 1 מ"ל של אמצעי שימור בהקפאה ללא סרום לכל באר של צלחת 6 בארות לצינור 15 מ"ל והשהה מחדש את האגרגטים החתוכים באמצעות P1000 עם קצה משעמם רחב.
  3. העבר תאים לתוך cryotubes מסומן מראש. סגור צינורות ולהעביר צינורות לתוך מיכל cryopreservation מראש ב 4 ° C. אחסן תאים ב -80 ° C למשך 24-48 שעות.
  4. העברת קריובלים לחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.
    הערה: סיכום סכמטי של תהליך התמיינות OC מומחש באיור 1.

4. השראת גוף עוברי

  1. לטפח ולהרחיב מספיק iPSCs כמתואר לעיל עבור אינדוקציה EB.
    הערה: ניתן להגדיל את ייצור OC על ידי הגדלת מספר הגופים העובריים, אשר בתורם מייצרים תפוקה כללית גבוהה יותר של תאים המטופויטיים. באר אחת של 70-80% iPSCs מתמזגים מניבה כ 8.4 x 105 תאים לכל באר של צלחת 6 באר. דרושים 12,500 תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים חד-תאיים כדי ליצור גוף עוברי אחד.
  2. שאפו את המדיום המושקע מתרביות iPSC ושטפו את מושבות iPSC עם D-PBS.
  3. הוסיפו 0.5 מ"ל של מגיב דיסוציאציה חד-תאי שחומם מראש לטמפרטורת החדר לכל באר של צלחת בעלת 6 בארות וערבלו את כלי התרבית כך שיצפו את כל משטח הבאר. לדגור על כלי התרבית ב 37 ° C במשך 5-8 דקות.
  4. הסר את כלי הדם מהאינקובטור, שאף מגיב דיסוציאציה של תא בודד, והוסף 1 מ"ל של מדיום התמיינות שלב 1 לבארות, המורכב מתווך נטול סרום hiPSC עם 50 ng/mL חלבון מורפוגנטי של עצם אנושית 4 (hBMP4), 50 ng/mL גורם גדילה אנדותל כלי דם אנושי-165 (hVEGF), 20 ng/mL גורם תאי גזע אנושיים (hSCF), ו-10 מיקרומטר Y-27632.
  5. נתקו תאים בעדינות על ידי שטיפת הבאר בתווך שלב 1. בריכה iPSCs מנותקים לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל.
  6. הוסף 1 מ"ל של מדיום התמיינות שלב 1 לבארות ושטוף את כל התאים שנותרו או השתמש במגרד תאים עבור מושבות שאינן נשטפות בקלות.
  7. לאחר העברת כל התאים לצינור, צנטריפוגה ב 200 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי ליצור גלולה התא. שאפו והשעו מחדש את התאים בסך הכל 2 מ"ל של מדיום התמיינות שלב 1 משוקל מראש באמצעות פיפטה סרולוגית של 5 מ"ל או P1000 עם קצה משעמם רחב.
  8. ספירת תאים באמצעות המוציטומטר או מכשיר ספירת תאים אוטומטי. הוסף את התווך לצינור 15 מ"ל המכיל את תרחיף התא הבודד כדי לצלחת 12,500 תאים לכל באר בתחתית עגולה בעלת חיבור נמוך במיוחד 96 בארות צלחת ב -100 מיקרוליטר של מדיום ההתמיינות שלב 1.
    הערה: תחת המיקרוסקופ, תאים יופיעו כתרחיף חד-תאי עם תאים המפוזרים ברחבי הבאר.
  9. צנטריפוגה את לוחות 96 בארות במשך 3 דקות ב 100 x גרם. לאחר הצנטריפוגה, התאים צריכים להתחיל להידמות לספרואידים כאשר מסתכלים עליהם מתחת למיקרוסקופ. מניחים את הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
  10. שנה מחצית מהמדיום ביום 1 וביום 2 עם מדיום הבידול שלב 1. כדי לשפר את היעילות, השתמש פיפטה רב ערוצית כדי להיפטר 50 μL של מדיום התמיינות שלב 1 משומש לתוך צלחת פטרי.
  11. לאחר השלכת המדיום מלוח 96 הקידוחים, בדוק אם יש EBs תחת המיקרוסקופ הסטריאוסקופי שאולי הוסר בטעות. העבר EBs שהוסרו בטעות לצלחת 96 באר באמצעות פיפטה P1000 עם קצוות נשא רחבים.
  12. הוסף 50 μL של מדיום בידול טרי שלב 1 לכל באר של צלחת חיבור 96 באר תחתית עגולה נמוכה במיוחד באמצעות פיפטה רב ערוצית.

5. הבחנה hematopoietic

  1. יום אחד לפני תחילת התמיינות hematopoietic, לצפות באר של צלחת 6 בארות עם 1 מ"ל של תמצית קרום הבסיס בריכוז של 200-300 מיקרוגרם / מ"ל. מניחים את צלחת הבאר על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    הערה: כל באר תקבל 8 EBs בנקודה מאוחרת יותר של פרוטוקול זה. בהתאם למספר EBs מוכנים, בארות מעיל בהתאם.
  2. שאפו את עודפי תמצית הממברנה הבסיסית ומלאו מראש בארות של צלחת 6 בארות עם 3 מ"ל של מדיום התמיינות שלב 2, המורכב מתווך בסיסי hematopoietic אליו 2 mM Ultraglutamine, 55 μM 2-mercaptoethanol, 25 ng/mL אנושי interleukin 3 (hIL-3), ו 100 ng/mL אנושי מקרופאג מושבה גורם מגרה (hM-CSF) אנושי.
  3. בעזרת P1000 עם קצוות רחבים, העבירו 8 EBs לכל באר של צלחת 6 הקידוחים. לאחר ההעברה, יש לאשר בעין או מתחת לסטריאומיקרוסקופ כי 8 EBs נמצאים בכל באר.
    הערה: לאחר יום אחד, ה- EBs הצפים ייצמדו לקרקעית הבאר. במהלך 5-7 הימים הבאים, אוכלוסיית תאים צפים המורכבת מתאים המטופויטיים אמורה להיות גלויה. תקופת התמיינות hematopoietic יכול להיות מגוון, החל מ 7 ימים. הבחנה במשך 10 ימים הראתה אוכלוסייה hematopoietic המורכבת מתת-אוכלוסיות גדולות CD45+, CD14+ ו- CD11b+ .
  4. לאחר 5 ימים של טיפול עם מדיום התמיינות שלב 2, בצע שינוי בינוני על ידי הסרת המדיום בילה וניפוקו לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל. פיפטה לאט כדי לנסות להסיר כמה שפחות תאים צפים ולשמור על לחץ הגזירה נמוך ככל האפשר. פיפטינג מתחת לסטריאומיקרוסקופ יכול לסייע במניעת הסרה בשוגג של תאים.
  5. מיד להוסיף 1 מ"ל של מדיום דיפרנציאציה שלב 2 טרי לבארות. על מנת לשחזר כל תאים hematopoietic צף כי עשוי להיות כבר נוכח בשלב זה בתהליך ההתמיינות, לא להשליך את המדיום שניתן. במקום זאת, סובבו את הצינור עם המדיום המשומש ב 300 x גרם במשך 5 דקות, ושאפו את supernatant.
  6. הוסף תווך התמיינות טרי שלב 2 לצינור והשהה מחדש על מנת לנתק תאים שאולי הועברו עם התווך המשומש.
  7. הוסף 2 מ"ל של מדיום ההתמיינות הטרי שלב 2 עם התאים המשוחזרים לכל באר, שהיה מלא בעבר ב -1 מ"ל של מדיום ההתמיינות שלב 2.
  8. ביום 10 של התמיינות hematopoietic, לבדוק נוכחות של מספר גדול של תאים hematopoietic צפים. קציר על ידי איסוף אותם בצינור 50 מ"ל. ניתן להקפיא אותם בחזרה ב-10% DMSO, 50% FBS ו-40% בינוני או להשתמש בהם באופן מיידי כדי להתמיין ל-OCs.

6. התבגרות M-CSF ובידול OC

  1. תאי זרע בריכוז של 200,000 תאים לסמ"ק2 על תרבית רקמה מטופלים היטב בצלחות ומטפלים באלפא-MEM, בתוספת 10% FBS ו-50 ננוגרם/מ"ל hM-CSF.
  2. כדי לבצע בדיקות פונקציונליות או הדמיה, נתק את התאים הבשלים M-CSF 3 ימים לאחר הזריעה על ידי שטיפה עם PBS שחומם מראש ל 37 ° C באמצעות P1000 עם קצה בור רחב. ייתכן שיהיה צורך בשלבי שטיפה חוזרים ונשנים כדי לנתק תאים באופן מלא.
  3. מעבירים את התאים המנותקים לצינור של 15 מ"ל באמצעות P1000 עם קצה בור רחב וצנטריפוגה במהירות של 300 x גרם למשך 5 דקות. השליכו את הסופרנטנט.
  4. השהה מחדש והמיס את גלולת התא עם מדיום התמיינות OC, המורכב מאלפא-MEM בתוספת 10% FBS, 50 ng/mL hM-CSF ו-80 ng/mL hRANKL. לספור את התאים באמצעות המוציטומטר או מכשיר ספירת תאים אוטומטי ולזרוע מחדש תאים שהבשילו M-CSF בצפיפות של 200,00-250,000 תאים לסמ"ק2 בכלי תרבית מתאים לבדיקות פונקציונליות או הדמיה (כלומר, בדיקות ספיגת עצם, שקופיות כיסוי להדמיה, וכו ').
  5. להבדיל עם מדיום התמיינות OC במשך 7-9 ימים. בצע שינוי בינוני מלא היטב עם מדיום התמיינות OC טרי כל 2-3 ימים.
    הערה: OCs מרובי גרעינים מופיעים בדרך כלל לאחר 5-7 ימים.

תוצאות

ניטור מורפולוגיה של התא לאורך תהליך ההתמיינות
כל התוצאות המתוארות להלן נוצרו באמצעות קו MCND-TENS2 iPSC עבור התמיינות OC. קו iPSC זה שימש בעבר במספר מחקרים32,33. עם זאת, קווי iPSC אחרים שימשו בהצלחה גם עם פרוטוקול בידול זה.

הערכה חזותית סדירה מגל?...

Discussion

פרוטוקול זה מציע שיטה אמינה וחזקה להבדיל iPSCs ל- OCs. עם זאת, ישנם מספר מלכודות שניתן להיתקל בהן לאורך תהליך הבידול. קווי iPSC אנושיים שנוצרו מתאים ממקורות רקמה שונים התמינו בהצלחה באמצעות פרוטוקולזה 33. בעת הקפאת iPSCs בחזרה (ראה שלב פרוטוקול "3. הקפאת iPSCs לאחור"), באר אחת בנקודת המעבר הו?...

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים.

Acknowledgements

המחברים רוצים להודות לחברי מעבדת ג'יאצ'לי על עזרתם ותמיכתם הטכנית. אנו מודים למרכז W. M. Keck Microscopy Center ולמנהל מרכז Keck, ד"ר נתנאל פיטרס, על הסיוע בהשגת תמונות המיקרוסקופ הקונפוקלי והמיקרוסקופ הרחב. אנו מודים גם ל-Flow Core Facility של UW ולמנהל מתקן Flow Core, Aurelio Silvestroni, על התמיכה והסיוע הטכני. לבסוף, אנו מודים לחנה בלומקה על התמיכה באיור ובעיצוב גרפי.

המימון ניתן באמצעות מענק המכונים הלאומיים לבריאות R35 HL139602-01. אנו מכירים גם במענק S10 של NIH S10 OD016240 למימון מכשירים במרכז W. M. Keck וכן במענק NIH 1S10OD024979-01A1 למימון מכשירים במתקן UW Flow Core.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2-MercaptoethanolSigma AldrichM6250-10ML
Antibody - Anti-Cathepsin K Abcamab19027
Antibody - APC-conjugated Anti-Human CD45BD555485
Antibody - APC-conjugated Mouse IgG1, κ Isotype ControlBD555751
Antibody - BV711-conjugated Anti-Human CD14BD563372
Antibody - BV711-conjugates Mouse IgG2b, κ Isotype ControlBD563125
Antibody - Goat Anti-Rabbit IgG H&L Alexa Fluor® 647Abcamab150079
Antibody - PE-conjugated Anti-Human CD14R&D SystemsFAB3832P-025
Antibody - PE-conjugated Anti-Human Integrin alpha M/CD11bR&D SystemsFAB16991P-025
Antibody - PE-Cy7-conjugated Anti-Human CD34BD560710
Antibody - PE-Cy7-conjugated Mouse IgG1 κ Isotype ControlBD557872
Antibody - PE/Cyanine5-conjugated Anti-Human CD11bBiolegend301308
Antibody - PE/Cyanine5-conjugated Mouse IgG1, κ Isotype CtrlBiolegend400118
Antibody - PerCP-Cy5.5-conjugated Mouse IgG1 κ Isotype ControlBD550795
Antibody - PerCpCy5.5-conjugated Anti-Human CD43BD563521
Bone Resorption Assay KitCosmoBioUSACSR-BRA-24KIT
Countess 3 Automated Cell CounterThermoFisher16812556
Cultrex Stem Cell Qualified Reduced Growth Factor Basement Membrane ExtractR&D Sytems3434-010-02Basal membrane extract
DAPIR&D Systems5748/10
Dispase (5 U/mL)STEMCELL Technologies7913
DMEM/F-12 with 15 mM HEPESStem Cell36254
DMSOSigma AldrichD2650
DPBSSigma AldrichD8537-500ML
Human Bone Morphogenetic Protein 4 (hBMP4)STEMCELL Technologies78211
Human IL-3STEMCELL Technologies78146.1
Human Macrophage Colony-stimulating Factor (hM-CSF)STEMCELL Technologies78150.1
Human Soluble Receptor Activator of Nuclear Factor-κB Ligand (hsRANKL)STEMCELL Technologies78214.1
Human Stem Cell Factor (hSCF)STEMCELL Technologies78155.1
Human TruStain FcX (Fc Receptor Blocking Solution)Biolegend422301
Human Vascular Endothelial Growth Factor-165 (hVEGF165)STEMCELL Technologies78073
Invitrogen Rhodamine PhalloidinInvitrogenR415
MEM α, nucleosides, no phenol redThermoFisher41061029
mFreSRSTEMCELL Technologies05855Serum free cryopreservation medium
mTeSR Plus mediumSTEMCELL Technologies100-0276Human iPSC-serum free medium (hiPSC-SFM)
Nunclon Sphera 96-Well, Nunclon Sphera-Treated, U-Shaped-Bottom MicroplateThermo Scientific174925Round bottom ultra-low attachment 96-well plate
P1000 Wide Bore TipsThermoFisher2079GPK
ROCK-Inhibitor Y-27632STEMCELL Technologies72304
StemSpan SFEMStemCell09650Hematopoietic cell culture medium
TrypLE Select Enzyme (1X), no phenol redThermo Fisher12563011Single-cell dissociation reagent
UltraglutamineBioscience LonzaBE17-605E/U1
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell MediumBioscience Lonza04-418QHematopoietic basal medium
µ-Slide 8 Well HighIbidi80806

References

  1. Bar-Shavit, Z. The osteoclast: A multinucleated, hematopoietic-origin, bone-resorbing osteoimmune cell. Journal of Cellular Biochemistry. 102 (5), 1130-1139 (2007).
  2. Boyce, B. F. Advances in the regulation of osteoclasts and osteoclast functions. Journal of Dental Research. 92 (10), 860-867 (2013).
  3. Buranaphatthana, W., et al. Engineered osteoclasts resorb necrotic alveolar bone in anti-RANKL antibody-treated mice. Bone. 153, 116144 (2021).
  4. Wang, L., et al. Isolation, purification, and differentiation of osteoclast precursors from rat bone marrow. Journal of Visualized Experiments. 2019 (147), e58895 (2019).
  5. Mercatali, L., et al. Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines. Journal of Visualized Experiments. (127), e56311 (2017).
  6. Marino, S., Bishop, R. T., de Ridder, D., Delgado-Calle, J., Reagan, M. R. 2D and 3D in vitro co-culture for cancer and bone cell interaction studies. Methods in Molecular Biology. 1914, 71-98 (2019).
  7. Rementer, C. W., et al. An inducible, ligand-independent receptor activator of NF-κB gene to control osteoclast differentiation from monocytic precursors. PloS One. 8 (12), e0084465 (2013).
  8. Rementer, C., et al. Engineered myeloid precursors differentiate into osteoclasts and resorb heterotopic ossification in mice. Research Square Priprint. , 2156913 (2022).
  9. Bjelić, D., Finšgar, M. Bioactive coatings with anti-osteoclast therapeutic agents for bone implants: Enhanced compliance and prolonged implant life. Pharmacological Research. 176, 106060 (2022).
  10. Minkin, C., Marinho, V. C. Role of the osteoclast at the bone-implant interface. Advances in dental research. 13, 49-56 (1999).
  11. Kodama, J., Kaito, T. Osteoclast multinucleation: Review of current literature. International Journal of Molecular Sciences. 21 (16), 1-35 (2020).
  12. Mun, S. H., Park, P. S. U., Park-Min, K. H. The M-CSF receptor in osteoclasts and beyond. Experimental & Molecular Medicine. 52 (8), 1239-1254 (2020).
  13. Plotkin, L. I., Bivi, N. Local regulation of bone cell function. Basic and Applied Bone Biology. , 47-73 (2014).
  14. Hodge, J. M., Kirkland, M. A., Nicholson, G. C. Multiple roles of M-CSF in human osteoclastogenesis. Journal of Cellular Biochemistry. 102 (3), 759-768 (2007).
  15. Ono, T., Nakashima, T. Recent advances in osteoclast biology. Histochemistry and Cell Biology. 149 (4), 325-341 (2018).
  16. Boyce, B. F., Xiu, Y., Li, J., Xing, L., Yao, Z. NF-κB-mediated regulation of osteoclastogenesis. Endocrinology and Metabolism. 30 (1), 35 (2015).
  17. Novack, D. V. Role of NF-κB in the skeleton. Cell Research. 21 (1), 169-182 (2010).
  18. Kim, K., Lee, S. H., Jung, H. K., Choi, Y., Kim, N. NFATc1 induces osteoclast fusion via up-regulation of Atp6v0d2 and the dendritic cell-specific transmembrane protein (DC-STAMP). Molecular Endocrinology. 22 (1), 176-185 (2008).
  19. Wu, H., Xu, G., Li, Y. P. Atp6v0d2 is an essential component of the osteoclast-specific proton pump that mediates extracellular acidification in bone resorption. Journal of Bone and Mineral Research. 24 (5), 871 (2009).
  20. Vignery, A. Macrophage fusion: The making of osteoclasts and giant cells. The Journal of Experimental Medicine. 202 (3), 337 (2005).
  21. Chiu, Y. H., Ritchlin, C. T. DC-STAMP: A key regulator in osteoclast differentiation. Journal of Cellular Physiology. 231 (11), 2402 (2016).
  22. Riedlova, P., Sood, S., Goodyear, C. S., Ansalone, C. Differentiation of functional osteoclasts from human peripheral blood CD14+ monocytes. Journal of Visualized Experiments. (191), e64698 (2023).
  23. Gothot, A., Pyatt, R., McMahel, J., Rice, S., Srour, E. F. Functional heterogeneity of human CD34+ cells isolated in subcompartments of the G0 /G1 phase of the cell cycle. Blood. 90 (11), 4384-4393 (1997).
  24. Dinella, J., Koster, M. I., Koch, P. J. Use of induced pluripotent stem cells in dermatological research. The Journal of Investigative Dermatology. 134 (8), e23 (2014).
  25. Grigoriadis, A. E., et al. Directed differentiation of hematopoietic precursors and functional osteoclasts from human ES and iPS cells. Blood. 115 (14), 2769-2776 (2010).
  26. Rössler, U., et al. Efficient generation of osteoclasts from human induced pluripotent stem cells and functional investigations of lethal CLCN7-related osteopetrosis. Journal of Bone and Mineral Research: The Official Journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 36 (8), 1621-1635 (2021).
  27. Chen, I. -. P. Differentiation of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) into osteoclasts. Bio-Protocol. 10 (24), e3854-e3854 (2020).
  28. Buchrieser, J., James, W., Moore, M. D. Human induced pluripotent stem cell-derived macrophages share ontogeny with MYB-independent tissue-resident macrophages. Stem Cell Reports. 8 (2), 334-345 (2017).
  29. Abe, K., et al. Endoderm-specific gene expression in embryonic stem cells differentiated to embryoid bodies. Experimental Cell Research. 229 (1), 27-34 (1996).
  30. Perlingeiro, R. C. R., Kyba, M., Daley, G. Q. Clonal analysis of differentiating embryonic stem cells reveals a hematopoietic progenitor with primitive erythroid and adult lymphoid-myeloid potential. Development. 128 (22), 4597-4604 (2001).
  31. Pettinato, G., Wen, X., Zhang, N. Engineering strategies for the formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 24 (14), 1595 (2015).
  32. Ruiz, J. P., et al. Robust generation of erythroid and multilineage hematopoietic progenitors from human iPSCs using a scalable monolayer culture system. Stem Cell Research. 41, 101600 (2019).
  33. Blümke, A., et al. Comparison of osteoclast differentiation protocols from human induced pluripotent stem cells of different tissue origins. Stem Cell Research & Therapy. 14 (1), 319 (2023).
  34. Klepikova, A., et al. iPSC-Derived Macrophages: The differentiation protocol affects cell immune characteristics and differentiation trajectories. International Journal of Molecular Sciences. 23 (24), 16087 (2022).
  35. Neely, M. D., Tidball, A. M., Aboud, A. A., Ess, K. C., Bowman, A. B. Induced pluripotent stem cells (iPSCs): An emerging model system for the study of human neurotoxicology. Neuromethods. 56, 27-61 (2011).
  36. Doulatov, S., et al. Induction of multipotential hematopoietic progenitors from human pluripotent stem cells via re-specification of lineage-restricted precursors. Cell Stem Cell. 13 (4), 459-470 (2013).
  37. Van Winkle, A. P., Gates, I. D., Kallos, M. S. Mass transfer limitations in embryoid bodies during human embryonic stem cell differentiation. Cells, Tissues, Organs. 196 (1), 34-47 (2012).
  38. Kim, J. M., et al. Assessment of differentiation aspects by the morphological classification of embryoid bodies derived from human embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 20 (11), 1925-1935 (2011).
  39. Mohr, J. C., et al. The microwell control of embryoid body size in order to regulate cardiac differentiation of human embryonic stem cells. Biomaterials. 31 (7), 1885-1893 (2010).
  40. Lopez-Yrigoyen, M., et al. Production and characterization of human macrophages from pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (158), e61038 (2020).
  41. Cao, X., et al. Differentiation and functional comparison of monocytes and macrophages from hiPSCs with peripheral blood derivatives. Stem Cell Reports. 12 (6), 1282 (2019).
  42. Omata, Y., et al. Interspecies single-cell RNA-seq analysis reveals the novel trajectory of osteoclast differentiation and therapeutic targets. JBMR Plus. 6 (7), e10631 (2022).
  43. Hodge, J. M., Kirkland, M. A., Nicholson, G. C. Multiple roles of M-CSF in human osteoclastogenesis. Journal of Cellular Biochemistry. 102 (3), 759-768 (2007).
  44. Kim, N., Takami, M., Rho, J., Josien, R., Choi, Y. A novel member of the leukocyte receptor complex regulates osteoclast differentiation. The Journal of Experimental Medicine. 195 (2), 201 (2002).
  45. Nedeva, I. R., Vitale, M., Elson, A., Hoyland, J. A., Bella, J. Role of OSCAR signaling in psteoclastogenesis and bone disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 641162 (2021).
  46. Bernhardt, A., Schamel, M., Gbureck, U., Gelinsky, M. Osteoclastic differentiation and resorption is modulated by bioactive metal ions Co2+, Cu2+ and Cr3+ incorporated into calcium phosphate bone cements. PLoS One. 12 (8), e0182109 (2017).
  47. Akasaka, T., et al. Different micro/nano-scale patterns of surface materials influence osteoclastogenesis and actin structure. Nano Research. 15 (5), 4201-4211 (2022).
  48. Hobolt-Pedersen, A. S., Delaissé, J. M., Søe, K. Osteoclast fusion is based on heterogeneity between fusion partners. Calcified Tissue International. 95 (1), 73 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

205

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved