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Résumé

Ce protocole présente la différenciation des ostéoclastes humains à partir des cellules souches pluripotentes induites (CSPi) et décrit des méthodes de caractérisation des ostéoclastes et des précurseurs d’ostéoclastes.

Résumé

Ce protocole détaille la propagation et le passage des cellules iPS humaines et leur différenciation en ostéoclastes. Tout d’abord, les cellules iPS sont dissociées en une suspension unicellulaire pour une utilisation ultérieure dans l’induction du corps embryoïde. Après induction mésodermique, les corps embryoïdes subissent une différenciation hématopoïétique, produisant une population de cellules hématopoïétiques flottantes. Par la suite, les cellules hématopoïétiques récoltées subissent une étape de maturation du facteur de stimulation des colonies de macrophages et, enfin, une différenciation des ostéoclastes. Après différenciation des ostéoclastes, les ostéoclastes sont caractérisés par une coloration pour TRAP en conjonction avec une coloration nucléaire au vert de méthyle. Les ostéoclastes sont observés sous forme de polycaryons multinucléés TRAP+. Leur identification peut être renforcée par la coloration à la cathepsine K. Les tests de résorption osseuse et minérale permettent une caractérisation fonctionnelle, confirmant l’identité d’ostéoclastes authentiques. Ce protocole démontre une méthode robuste et polyvalente pour différencier les ostéoclastes humains des cellules iPS et permet une adoption facile dans les applications nécessitant de grandes quantités d’ostéoclastes humains fonctionnels. Des applications dans les domaines de la recherche sur les os, du cancer, de l’ingénierie tissulaire et de la recherche sur les endoprothèses pourraient être envisagées.

Introduction

Les ostéoclastes (OC) sont des types cellulaires polyvalents dérivés de l’hématopoïétique 1,2 qui sont couramment utilisés par les chercheurs dans des domaines tels que la recherche sur les maladies osseuses 3,4, la recherche sur le cancer 5,6, l’ingénierie tissulaire 7,8 et la recherche sur les endoprothèses 9,10. Néanmoins, la différenciation des CO peut être difficile car la fusion des précurseurs mononucléaires en CO multinucléés est nécessaire pour créer des CO fonctionnels11. Plusieurs facteurs biologiques, tels que l’activateur du récepteur du ligand NF-κB (RANKL) et le facteur de stimulation des colonies de macrophages (M-CSF), sont nécessaires à la différenciation du CO. Il a été rapporté que le M-CSF a un effet positif sur la prolifération cellulaire, la survie cellulaire et l’expression de RANK 12,13,14. D’autre part, RANKL se lie à RANK, qui active des cascades de signalisation en aval qui induisent l’ostéoclastogenèse. L’activation est médiée par le facteur 6 associé au récepteur TNF (TRAF6), qui conduit à la dégradation du facteur nucléaire de l’activateur du gène polypeptidique léger kappa dans l’inhibiteur des lymphocytes B, alpha (IκB-α), une protéine de liaison qui se lie aux dimères NF-kB16,17. Par conséquent, la dégradation de l’IκB-α libère des dimères NF-kB, qui se transloquent ensuite dans le noyau et induisent l’expression des facteurs de transcription c-Fos et Nuclear Factor of Activated T-Cells 1 (NFATc1). Ceci, à son tour, déclenche la transcription d’une multitude de protéines liées à la différenciation OC 15,18. Des protéines régulées à la hausse telles que DC-Stamp et Atp6v0d2 interviennent dans la fusion cellule-cellule des précurseurs de CO, conduisant à la formation de syncytium 19,20,21.

En ce qui concerne les cellules primaires humaines, les PBMC CD34+ et CD14+ sont actuellement les types de cellules les plus utilisés pour la différenciation en OC22. Cependant, cette approche est limitée par l’hétérogénéité au sein de la population CD34+ des cellules prélevées sur des donneurs23 et leur capacité d’extensibilité limitée. Les CSPi humaines constituent une source alternative de CO. Comme ils peuvent être propagésindéfiniment 24, ils permettent l’évolutivité et la mise à l’échelle de la production de CO. Cela permet de différencier un grand nombre de CO, ce qui facilite la recherche sur les CO.

Plusieurs protocoles pour la différenciation des CSPi en CO ont été publiés 25,26,27. L’ensemble du processus de différenciation peut être divisé en une partie de propagation des CSPi, une partie de différenciation mésodermique et hématopoïétique et une partie de différenciation des CO. La propagation des cellules iPS avant le processus de différenciation permet la mise à l’échelle de la production de CO avant la différenciation. Plusieurs approches existent en ce qui concerne la différenciation mésodermique et hématopoïétique. Traditionnellement, la formation du corps embryoïde (EB) a été utilisée pour différencier les cellules hématopoïétiques, mais les approches basées sur des monocouches représentent une autre stratégie de différenciation hématopoïétique qui ne nécessite pas d’induction EB. Néanmoins, les systèmes monocouches semblent nécessiter une optimisation supplémentaire, car nous et d’autres avons constaté que les approches basées sur l’EB étaient plus robustes pour la différenciation des OC.

Ici, nous décrivons la différenciation des CO des iPSC humains à l’aide d’un protocole basé sur EB. Ce protocole a été adapté de Rössler et al.26 et modifié pour augmenter la robustesse et permettre la cryoconservation pendant le processus de différenciation. Tout d’abord, nous n’avons récolté des cellules hématopoïétiques qu’une seule fois après 10 jours de différenciation. Les cellules hématopoïétiques ont ensuite été cryoconservées pour permettre une plus grande flexibilité pendant le processus de différenciation. De plus, nous avons augmenté la densité d’ensemencement des cellules hématopoïétiques de 1 x 105 à 2 x 105 cellules/cm2 pour la différenciation du CO. Un milieu humain sans sérum iPSC plus récent (hiPSC-SFM, voir le tableau des matériaux) a été utilisé, et le revêtement des puits a été effectué avec 200 à 300 μg/mL d’un extrait de membrane basale (voir le tableau des matériaux) au lieu de 0,1 % de gélatine. La pénicilline/streptomycine n’a pas été ajoutée aux médias.

Le protocole de Rössler et al.26 a été adapté à l’origine d’une CSPi à un protocole de différenciation des macrophages28 qui utilise la formation d’EB pour la différenciation hématopoïétique. Bien que la formation d’EB ait été utilisée pendant une longue période par les chercheurs pour la différenciation hématopoïétique29,30, plusieurs méthodes d’induction d’EB ont été décrites dans la littérature, telles que l’agrégation spontanée, la centrifugation dans une plaque à fond rond, la culture de gouttes suspendues, la culture de bioréacteurs, la culture de tubes coniques, les vaisseaux latéraux à rotation lente et la culture de gel de micromoules31. Ce protocole utilise la centrifugation de cellules iPS dissociées dans une plaque à puits à fond rond pour rapprocher les cellules iPSC individuelles les unes des autres et permettre la formation de sphères (EB), comme décrit ci-dessous.

Protocole

REMARQUE : Tous les réactifs utilisés dans ce protocole se trouvent dans la table des matériaux. Sauf indication contraire, tous les milieux ont été pré-équilibrés à 37 °C avant utilisation. Toutes les étapes de centrifugation sont effectuées à 37 °C et en utilisant le mode d’accélération/décélération le plus lent. Sauf indication contraire, le surnageant est toujours éliminé à l’aide de pipettes jetables en verre Pasteur.

1. Décongélation et propagation des cellules iPS humaines

  1. Un jour avant la décongélation des CSPi, enduire un puits d’une plaque à 6 puits de 1 mL d’un extrait de membrane basale à une concentration de 200 à 300 μg/mL. Placez la plaque de puits à 4 °C pendant la nuit.
  2. Le lendemain, décongelez et transférez les cellules dans un tube de 15 ml à l’aide d’une pipette P1000. Goutte à goutte, ajouter 5 à 7 mL de DMEM/F-12 avec 15 mM HEPES.
  3. Centrifuger les cellules à 300 x g pendant 5 min. Retirez délicatement les cellules de la centrifugeuse et assurez-vous de ne pas déranger la pastille de cellule.
  4. Retirer délicatement le surnageant à l’aide d’une pipette en verre Pasteur et remettre les cellules en suspension dans 1 mL de milieu libre de sérum hiPSC (hiPSC-SFM contenant 10 μM d’inhibiteur de la Rho kinase (ROCK) Y-27632) à l’aide de P1000 avec des pointes à large alésage.
  5. Aspirer l’extrait de membrane basale du puits revêtu la veille (étape 1.1) et transférer 1 mL de hiPSC-SFM avec 10 μM Y-27632 dans le puits. Ajouter des cellules iPS remises en suspension dans le puits pour atteindre un volume final de 2 mL par puits.
  6. Agitez la plaque pour répartir uniformément les agrégats de CSPi avant de les placer dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO2.
  7. Effectuer des changements complets de milieu tous les deux jours à l’aide de hiPSC-SFM (sans ajout d’inhibiteur de ROCK Y-27632). Les cellules iPS atteignent généralement une confluence de 70 à 80 % après 3 à 4 jours de propagation.

2. Transmission des cellules iPS

  1. Un jour avant le passage des cellules iPS, enduire les puits d’une plaque à 6 puits d’un extrait de membrane basale à une concentration de 200 à 300 μg/mL. Placez la plaque de puits à 4 °C pendant la nuit.
    REMARQUE : Confirmez que les cellules ont atteint une confluence d’environ 70 à 80 %. Assurez-vous que les cellules iPS ne deviennent pas trop confluentes (plus de 80 % de confluence), car cela favorisera la différenciation spontanée.
  2. Commencer à faire passer les cellules iPS en enlevant les régions différenciées ou les régions avec de nombreux agrégats de cellules iPS mortes sous le stéréomicroscope à l’aide de pointes de pipette de 10 μL ou de 20 μL ou d’un racleur de cellules. Les régions différenciées apparaîtront de couleur plus dense ou plus blanche.
    REMARQUE : Les agrégats cellulaires grattés peuvent encore se fixer partiellement au fond du puits.
  3. Lavez le fond du puits plusieurs fois avec une pipette P1000 à large alésage pour éliminer les agrégats qui pourraient encore être partiellement attachés au fond du puits.
  4. Jeter le milieu usé dans lequel les CSPi ont été cultivées et qui contient les agrégats de CSPi détachés. Répétez l’étape de lavage deux fois de plus avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
  5. Ensuite, ajoutez 1 mL de 5 U/mL Dispase par puits. Les bords des colonies de CSPi se décollent de la plaque du puits, ce qui peut être observé au stéréomicroscope après 3 à 5 minutes d’incubation à température ambiante.
  6. Retirer délicatement Dispase pour éviter de déloger les agrégats légèrement détachés et ajouter 1 mL de DMEM/F-12 avec 15 mM de HEPES. Utilisez un élévateur de cellules jetable pour découper les agrégats en petites tailles. La cohérence de la taille des agrégats de CSPi peut être améliorée à l’aide d’un outil de transmission de cellules souches.
  7. Laver les agrégats de CSPi tranchés avec le milieu dans le puits et transférer le milieu avec les agrégats dans un tube conique de 15 mL à l’aide d’une pipette sérologique de 5 mL ou de P1000 avec un embout à large alésage.
  8. Rincez le puits avec du DMEM/F-12 et transférez le milieu dans le tube de 15 mL avec les agrégats iPSC.
  9. Centrifuger les agrégats de cellules iPSC tranchées à 200 x g pendant 3 min. Retirer le surnageant à l’aide d’une pipette en verre Pasteur et ajouter 2 mL de hiPSC-SFM pour déloger et remettre en suspension les cellules iPS à l’aide d’une pipette sérologique de 5 mL ou d’une P1000 à pointes à large alésage.
  10. Aspirer l’extrait de membrane basale restante de la ou des plaques de puits pré-enrobées et ajouter 1 mL de hiPSC-SFM dans chaque puits de la plaque à 6 puits.
  11. Transvaser les cellules iPS dans de nouveaux puits d’une plaque à 6 puits de manière à ce que le volume final soit de 2 mL de hiPSC-SFM par puits à l’aide d’un P1000 avec des pointes à large alésage. En fonction de la ligne iPSC, les rapports de fractionnement doivent être optimisés. Ici, un rapport de division de 1 :6 a été utilisé.
  12. Vérifier la présence d’agrégats flottants dans le puits et la taille des agrégats sous le stéréomicroscope. Idéalement, la taille de l’agrégat devrait être comprise entre 50 et 200 μm.
  13. Agiter la plaque de puits pour répartir uniformément les cellules sur la plaque après le transfert des agrégats et incuber à 37 °C à 5 % de CO2 jusqu’à 70-80 % de confluence.

3. Congélation des cellules iPS

  1. Pour recongeler les cellules iPSC, faites passer les cellules comme décrit ci-dessus (voir l’étape du protocole « 2. Passage des cellules iPS »). Une fois que les cellules ont été découpées en colonies et lavées du fond du puits (étape 2.10), faites tourner les agrégats tranchés à 200 x g pendant 3 minutes. Aspirer le surnageant.
  2. Ajouter 1 mL de milieu de cryoconservation sans sérum par puits d’une plaque à 6 puits dans le tube de 15 mL et remettre en suspension les agrégats tranchés à l’aide d’un P1000 avec une pointe à large alésage.
  3. Transférez les cellules dans des cryotubes prémarqués. Fermez les tubes et les tubes de transfert dans un récipient de cryoconservation pré-refroidi à 4 °C. Conserver les cellules à -80 °C pendant 24 à 48 h.
  4. Transférez les cryoflacons dans de l’azote liquide pour un stockage à long terme.
    NOTA : La figure 1 illustre un résumé schématique du processus de différenciation des CO.

4. Induction du corps embryoïde

  1. Cultivez et développez suffisamment de cellules iPS comme décrit ci-dessus pour l’induction de l’EB.
    REMARQUE : La production de CO peut être augmentée en augmentant le nombre de corps embryoïdes, qui à leur tour produisent un rendement global plus élevé de cellules hématopoïétiques. Un puits de cellules iPS confluentes à 70-80 % donne environ 8,4 x 105 cellules par puits d’un puits à plaques à 6 puits. 12 500 cellules iPS unicellulaires sont nécessaires pour former un corps embryoïde.
  2. Aspirer le milieu usé des cultures d’iPSC et rincer les colonies d’iPSC avec du D-PBS.
  3. Ajouter 0,5 mL de réactif de dissociation unicellulaire préchauffé à température ambiante dans chaque puits d’une plaque à 6 puits et faire tourner le récipient de culture pour recouvrir toute la surface du puits. Incuber le récipient de culture à 37 °C pendant 5 à 8 min.
  4. Retirer le récipient de l’incubateur, aspirer le réactif de dissociation de cellule unique et ajouter 1 mL du milieu de différenciation de stade 1 dans les puits, constitué d’un milieu libre de sérum hiPSC avec 50 ng/mL de protéine morphogénétique osseuse humaine 4 (hBMP4), 50 ng/mL de facteur de croissance de l’endothélium vasculaire humain-165 (hVEGF), 20 ng/mL de facteur de cellules souches humaines (hSCF), et 10 μM Y-27632.
  5. Détachez délicatement les cellules en rinçant le puits avec le médium de l’étape 1. Regrouper les cellules iPS dissociées dans un tube conique de 15 ml.
  6. Ajouter 1 mL de milieu de différenciation de stade 1 dans les puits et laver les cellules restantes ou utiliser un grattoir à cellules pour les colonies qui ne se lavent pas facilement.
  7. Après avoir transféré toutes les cellules dans le tube, centrifuger à 200 × g pendant 5 min à température ambiante pour former une pastille de cellule. Aspirer et remettre en suspension les cellules dans un total de 2 mL de milieu de différenciation de stade 1 prééquilibré à l’aide d’une pipette sérologique de 5 mL ou d’une P1000 avec un embout à large alésage.
  8. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un dispositif automatisé de comptage cellulaire. Ajouter le milieu dans le tube de 15 mL contenant la suspension à cellule unique pour plaquer 12 500 cellules par puits dans une plaque à fond rond à fixation ultra-basse de 96 puits dans 100 μL du milieu de différenciation de l’étape 1.
    REMARQUE : Au microscope, les cellules apparaîtront comme une suspension unicellulaire avec des cellules dispersées dans tout le puits.
  9. Centrifuger les plaques à 96 puits pendant 3 min à 100 x g. Après centrifugation, les cellules devraient commencer à ressembler à des sphéroïdes lorsqu’elles sont observées au microscope. Placez l’assiette dans un incubateur à 37 °C pendant 24 h.
  10. Changez la moitié du milieu le jour 1 et le jour 2 avec le milieu de différenciation de l’étape 1. Pour améliorer l’efficacité, utilisez une pipette multicanal pour éliminer 50 μL du milieu de différenciation de l’étape 1 épuisé dans une boîte de Pétri.
  11. Après avoir éliminé le milieu de la plaque à 96 puits, vérifiez qu’il n’y a pas d’EB sous le stéréomicroscope qui auraient pu être accidentellement retirés. Transférez les EB retirés accidentellement sur la plaque à 96 puits à l’aide d’une pipette P1000 avec des pointes à large alésage.
  12. Ajouter 50 μL de milieu de différenciation frais de l’étape 1 dans chaque puits d’une plaque à fond rond à très faible fixation à 96 puits à l’aide d’une pipette multicanaux.

5. Différenciation hématopoïétique

  1. Un jour avant de commencer la différenciation hématopoïétique, enduire un puits d’une plaque à 6 puits avec 1 mL d’un extrait de membrane basale à une concentration de 200 à 300 μg/mL. Placez la plaque de puits à 4 °C pendant la nuit.
    REMARQUE : Chaque puits recevra 8 EB à un moment ultérieur de ce protocole. En fonction du nombre d’EB préparés, enduire les puits en conséquence.
  2. Aspirer l’extrait de membrane basale en excès et préremplir les puits de la plaque à 6 puits avec 3 mL du milieu de différenciation de stade 2, constitué d’un milieu basal hématopoïétique auquel on ajoute 2 mM d’ultraglutamine, 55 μM de 2-mercaptoéthanol, 25 ng/mL d’interleukine humaine 3 (hIL-3) et 100 ng/mL de facteur de stimulation des colonies de macrophages humains (hM-CSF).
  3. À l’aide d’un P1000 avec des pointes à large alésage, transférez 8 EB dans chaque puits de la plaque à 6 puits. Après le transfert, confirmer à l’œil nu ou au stéréomicroscope qu’il y a 8 EB dans chaque puits.
    REMARQUE : Après 1 jour, les EB flottants adhéreront au fond du puits. Dans les 5 à 7 jours suivants, une population de cellules flottantes comprenant des cellules hématopoïétiques devrait devenir visible. La période de différenciation hématopoïétique peut être variée, à partir de 7 jours. La différenciation sur 10 jours a montré une population hématopoïétique composée de grandes sous-populations de CD45+, CD14+ et CD11b+ .
  4. Après 5 jours de traitement avec le milieu de différenciation de l’étape 2, effectuez un changement de milieu en retirant le milieu épuisé et en le distribuant dans un tube conique de 50 ml. Pipetez lentement pour essayer d’éliminer le moins de cellules flottantes possible et de maintenir la contrainte de cisaillement aussi faible que possible. Le pipetage sous stéréomicroscope peut aider à éviter l’élimination accidentelle de cellules.
  5. Ajouter immédiatement 1 mL de milieu de différenciation frais de l’étape 2 dans les puits. Afin de récupérer les cellules hématopoïétiques flottantes qui peuvent déjà être présentes à ce stade du processus de différenciation, ne jetez pas le milieu distribué. Au lieu de cela, faites tourner le tube avec le milieu épuisé à 300 x g pendant 5 min et aspirez le surnageant.
  6. Ajouter un nouveau milieu de différenciation de stade 2 dans le tube et le remettre en suspension afin de détacher les cellules qui auraient pu être transférées avec le milieu épuisé.
  7. Ajouter 2 mL du milieu de différenciation frais de l’étape 2 avec les cellules récupérées dans chaque puits, qui a été préalablement rempli avec 1 mL du milieu de différenciation de l’étape 2.
  8. Au jour 10 de la différenciation hématopoïétique, vérifiez la présence d’un grand nombre de cellules hématopoïétiques flottantes. Récoltez-les en les recueillant dans un tube de 50 ml. Ils peuvent être soit recongelés dans 10 % de DMSO, 50 % de FBS et 40 % de milieu, soit être utilisés immédiatement pour différencier les cellules en CO.

6. Maturation M-CSF et différenciation OC

  1. Cellules germées à une concentration de 200 000 cellules/cm2 sur des plaques de culture tissulaire bien traitées et traitées avec de l’alpha-MEM, complété par 10 % de FBS et 50 ng/mL de hM-CSF.
  2. Pour effectuer des tests fonctionnels ou de l’imagerie, détacher les cellules matures M-CSF 3 jours après l’ensemencement en les lavant avec du PBS préchauffé à 37 °C à l’aide d’un P1000 avec une pointe à large alésage. Des étapes de lavage répétées peuvent être nécessaires pour détacher complètement les cellules.
  3. Transvaser les cellules détachées dans un tube de 15 mL à l’aide d’un P1000 avec une pointe à alésage large et centrifuger à 300 x g pendant 5 min. Jeter le surnageant.
  4. Remettre en suspension et dissoudre la pastille cellulaire avec le milieu de différenciation OC, composé d’alpha-MEM complété par 10 % de FBS, 50 ng/mL de hM-CSF et 80 ng/mL de hRANKL. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un dispositif automatisé de comptage cellulaire et réensemencer les cellules matures M-CSF à une densité de 200 000 à 250 000 cellules/cm2 dans un matériel de culture approprié pour les tests fonctionnels ou l’imagerie (c’est-à-dire les tests de résorption osseuse, les lames de lamelle pour l’imagerie, etc.).
  5. Différencier avec le milieu de différenciation OC pendant 7 à 9 jours. Effectuer un changement complet de milieu de puits avec le milieu de différenciation OC frais tous les 2-3 jours.
    REMARQUE : Les CO multinucléés apparaissent généralement après 5 à 7 jours.

Résultats

Suivi de la morphologie cellulaire tout au long du processus de différenciation
Tous les résultats décrits ci-dessous ont été générés à l’aide de la lignée MCND-TENS2 iPSC pour la différenciation OC. Cette lignée iPSC a déjà été utilisée dans plusieurs études 32,33. Néanmoins, d’autres lignées iPSC ont également été utilisées avec succès avec ce protocole de différenciation.

L’évalua...

Discussion

Ce protocole offre une méthode fiable et robuste pour différencier les cellules iPS en CO. Néanmoins, il existe plusieurs pièges qui peuvent être rencontrés tout au long du processus de différenciation. Des lignées de CSPi humaines générées à partir de cellules d’origines tissulaires différentes ont été différenciées avec succès à l’aide de ce protocole33. Lors de la congélation des cellules iPS (voir l’étape de protocole « 3. Congélation des cellules iPS »), un puits...

Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent pas d’intérêts concurrents.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier les membres du laboratoire Giachelli pour leur aide technique et leur soutien. Nous remercions le Centre de microscopie W. M. Keck et le directeur du Centre Keck, le Dr Nathanial Peters, pour leur aide dans l’obtention des images de microscopie confocale et de microscopie à grand champ. Nous remercions également l’UW Flow Core Facility et le directeur de Flow Core Facility, Aurelio Silvestroni, pour leur soutien technique et leur assistance. Enfin, nous remercions Hannah Blümke pour son soutien en matière d’illustration et de conception graphique.

Le financement a été fourni par le biais de la subvention R35 HL139602-01 des National Institutes of Health. Nous remercions également la subvention S10 S10 OD016240 du NIH pour le financement des instruments au W. M. Keck Center, ainsi que la subvention 1S10OD024979-01A1 des NIH pour le financement des instruments de l’UW Flow Core Facility.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
2-MercaptoethanolSigma AldrichM6250-10ML
Antibody - Anti-Cathepsin K Abcamab19027
Antibody - APC-conjugated Anti-Human CD45BD555485
Antibody - APC-conjugated Mouse IgG1, κ Isotype ControlBD555751
Antibody - BV711-conjugated Anti-Human CD14BD563372
Antibody - BV711-conjugates Mouse IgG2b, κ Isotype ControlBD563125
Antibody - Goat Anti-Rabbit IgG H&L Alexa Fluor® 647Abcamab150079
Antibody - PE-conjugated Anti-Human CD14R&D SystemsFAB3832P-025
Antibody - PE-conjugated Anti-Human Integrin alpha M/CD11bR&D SystemsFAB16991P-025
Antibody - PE-Cy7-conjugated Anti-Human CD34BD560710
Antibody - PE-Cy7-conjugated Mouse IgG1 κ Isotype ControlBD557872
Antibody - PE/Cyanine5-conjugated Anti-Human CD11bBiolegend301308
Antibody - PE/Cyanine5-conjugated Mouse IgG1, κ Isotype CtrlBiolegend400118
Antibody - PerCP-Cy5.5-conjugated Mouse IgG1 κ Isotype ControlBD550795
Antibody - PerCpCy5.5-conjugated Anti-Human CD43BD563521
Bone Resorption Assay KitCosmoBioUSACSR-BRA-24KIT
Countess 3 Automated Cell CounterThermoFisher16812556
Cultrex Stem Cell Qualified Reduced Growth Factor Basement Membrane ExtractR&D Sytems3434-010-02Basal membrane extract
DAPIR&D Systems5748/10
Dispase (5 U/mL)STEMCELL Technologies7913
DMEM/F-12 with 15 mM HEPESStem Cell36254
DMSOSigma AldrichD2650
DPBSSigma AldrichD8537-500ML
Human Bone Morphogenetic Protein 4 (hBMP4)STEMCELL Technologies78211
Human IL-3STEMCELL Technologies78146.1
Human Macrophage Colony-stimulating Factor (hM-CSF)STEMCELL Technologies78150.1
Human Soluble Receptor Activator of Nuclear Factor-κB Ligand (hsRANKL)STEMCELL Technologies78214.1
Human Stem Cell Factor (hSCF)STEMCELL Technologies78155.1
Human TruStain FcX (Fc Receptor Blocking Solution)Biolegend422301
Human Vascular Endothelial Growth Factor-165 (hVEGF165)STEMCELL Technologies78073
Invitrogen Rhodamine PhalloidinInvitrogenR415
MEM α, nucleosides, no phenol redThermoFisher41061029
mFreSRSTEMCELL Technologies05855Serum free cryopreservation medium
mTeSR Plus mediumSTEMCELL Technologies100-0276Human iPSC-serum free medium (hiPSC-SFM)
Nunclon Sphera 96-Well, Nunclon Sphera-Treated, U-Shaped-Bottom MicroplateThermo Scientific174925Round bottom ultra-low attachment 96-well plate
P1000 Wide Bore TipsThermoFisher2079GPK
ROCK-Inhibitor Y-27632STEMCELL Technologies72304
StemSpan SFEMStemCell09650Hematopoietic cell culture medium
TrypLE Select Enzyme (1X), no phenol redThermo Fisher12563011Single-cell dissociation reagent
UltraglutamineBioscience LonzaBE17-605E/U1
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell MediumBioscience Lonza04-418QHematopoietic basal medium
µ-Slide 8 Well HighIbidi80806

Références

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