Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, insan osteoklastlarının indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler) ayırt edilmesini sunar ve osteoklastların ve osteoklast öncüllerinin karakterizasyonu için yöntemleri açıklar.

Özet

Bu protokol, insan iPSC'lerinin yayılmasını ve geçişini ve bunların osteoklastlara farklılaşmasını detaylandırır. İlk olarak, iPSC'ler, embriyoid vücut indüksiyonunda daha fazla kullanım için tek hücreli bir süspansiyona ayrıştırılır. Mezodermal indüksiyonu takiben, embriyoid cisimler hematopoietik farklılaşmaya uğrar ve yüzen bir hematopoietik hücre popülasyonu üretir. Daha sonra, hasat edilen hematopoietik hücreler bir makrofaj kolonisi uyarıcı faktör olgunlaşma adımına ve son olarak osteoklast farklılaşmasına tabi tutulur. Osteoklast farklılaşmasından sonra, osteoklastlar, metil yeşil nükleer boyama ile birlikte TRAP için boyama ile karakterize edilir. Osteoklastlar çok çekirdekli, TRAP+ polikaryonlar olarak gözlenir. Kimlikleri Katepsin K boyama ile daha da desteklenebilir. Kemik ve mineral rezorpsiyon deneyleri, iyi niyetli osteoklastların kimliğini doğrulayan fonksiyonel karakterizasyona izin verir. Bu protokol, insan osteoklastlarını iPSC'lerden ayırt etmek için sağlam ve çok yönlü bir yöntem gösterir ve büyük miktarlarda fonksiyonel insan osteoklastı gerektiren uygulamalarda kolay benimsenmeye izin verir. Kemik araştırmaları, kanser araştırmaları, doku mühendisliği ve endoprotez araştırmaları alanlarında uygulamalar öngörülebilir.

Giriş

Osteoklastlar (OK'ler) hematopoetik kaynaklı 1,2, kemik hastalığı araştırmaları 3,4, kanser araştırmaları 5,6, doku mühendisliği 7,8 ve endoprotez araştırmaları 9,10 gibi alanlarda araştırmacılar tarafından yaygın olarak kullanılan çok yönlü hücre tipleridir. Bununla birlikte, fonksiyonel OC'ler oluşturmak için mononükleer öncüllerin çok çekirdekli OC'lere füzyonu gerektiğinden, OC farklılaşması zor olabilir11. OK farklılaşması için NF-κB ligandının reseptör aktivatörü (RANKL) ve makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) gibi çeşitli biyolojik faktörler gereklidir. M-CSF'nin hücre proliferasyonu, hücre sağkalımı ve RANK ekspresyonu üzerinde olumlu bir etkisi olduğu bildirilmiştir 12,13,14. Öte yandan, RANKL, osteoklastogenezi indükleyen aşağı akış sinyal kaskadlarını aktive eden RANK'a bağlanır. Aktivasyona, NF-kB dimerlerini16,17 bağlayan bir bağlayıcı protein olan B hücreleri inhibitörü, alfa (IκB-α) kappa hafif polipeptit gen arttırıcının nükleer faktörünün bozulmasına yol açan TNF reseptörü ile ilişkili faktör 6 (TRAF6) aracılık eder. Bu nedenle, IκB-α bozunması, daha sonra çekirdeğe yer değiştiren ve transkripsiyon faktörleri c-Fos ve Aktive T-Hücreleri 1'in (NFATc1) Nükleer Faktörünün ekspresyonunu indükleyen NF-kB dimerlerini serbest bırakır. Bu da, çok sayıda OC farklılaşması ile ilgili proteinintranskripsiyonunu tetikler 15,18. DC-Stamp ve Atp6v0d2 gibi yukarı regüle proteinler, OC öncüllerinin hücre-hücre füzyonuna aracılık ederek sinsityum oluşumuna yol açar 19,20,21.

İnsan primer hücreleri ile ilgili olarak, CD34+ ve CD14+ PBMC'ler şu anda OC'lere farklılaşma için en yaygın kullanılan hücre tipleridir22. Bununla birlikte, bu yaklaşım, donörlerden23 toplanan hücrelerin CD34+ popülasyonundaki heterojenlik ve bunların sınırlı genişletilebilirliği ile sınırlıdır. İnsan iPSC'leri, OC'ler için alternatif bir kaynak sunar. Süresiz olarak 24 yayılabildikleri için, OC üretiminin genişletilebilirliğine ve ölçeklendirilmesine izin verirler. Bu, OC araştırmasını kolaylaştıran çok sayıda OC'nin farklılaşmasına izin verir.

iPSC'lerin OC'lere farklılaşması için çeşitli protokoller yayınlanmıştır 25,26,27. Tüm farklılaşma süreci bir iPSC yayılım bölümüne, bir mezodermal ve hematopoietik farklılaşma bölümüne ve OC farklılaşmasına ayrılabilir. iPSC'lerin farklılaşma sürecinden önce yayılması, farklılaşmadan önce OC üretiminin yükseltilmesine olanak tanır. Mezodermal ve hematopoetik farklılaşma ile ilgili çeşitli yaklaşımlar mevcuttur. Geleneksel olarak, hematopoetik hücreleri ayırt etmek için embriyoid cisim (EB) oluşumu kullanılmıştır, ancak tek tabaka tabanlı yaklaşımlar, EB indüksiyonu gerektirmeyen başka bir hematopoietik farklılaşma stratejisini temsil eder. Bununla birlikte, tek katmanlı tabanlı sistemler daha fazla optimizasyon gerektiriyor gibi görünmektedir, çünkü biz ve diğerleri, EB tabanlı yaklaşımların OC'lerin farklılaşması için daha sağlam olduğunu gördük.

Burada, EB tabanlı bir protokol kullanarak OC'lerin insan iPSC'lerinden farkını açıklıyoruz. Bu protokol Rössler ve ark.26'dan uyarlanmış ve farklılaşma işlemi sırasında sağlamlığı artırmak ve kriyoprezervasyona izin vermek için modifiye edilmiştir. İlk olarak, hematopoietik hücreleri 10 günlük farklılaşmadan sonra sadece bir kez topladık. Hematopoetik hücreler daha sonra farklılaşma işlemi sırasında daha fazla esneklik sağlamak için dondurularak saklandı. Ek olarak, OK farklılaşması için hematopoetik hücre tohumlama yoğunluğunu 1 x 105'ten 2 x 105 hücre/cm2'ye çıkardık. Daha yeni bir insan iPSC serumsuz ortam (hiPSC-SFM, Malzeme Tablosuna bakınız) kullanıldı ve kuyucukların kaplanması% 0.1 jelatin yerine 200-300 μg / mL bazal membran ekstraktı (Malzeme Tablosuna bakınız) ile gerçekleştirildi. Penisilin / streptomisin medyaya eklenmedi.

Rössler ve ark.26 tarafından yapılan protokol orijinal olarak bir iPSC'den hematopoietik farklılaşma için EB oluşumunu kullanan bir makrofaj farklılaşma protokolü28'e uyarlanmıştır. EB oluşumu araştırmacılar tarafından hematopoetik farklılaşma için uzun süredir kullanılmaktadır29,30, literatürde spontan agregasyon, yuvarlak tabanlı bir kuyu plakasında santrifüjleme, asılı damla kültürü, biyoreaktör kültürü, konik tüp kültürü, yavaş dönen lateral damar ve mikro kalıp jel kültürü gibi çeşitli EB indüksiyon yöntemleri tanımlanmıştır31. Bu protokol, aşağıda açıklandığı gibi, tek iPSC hücrelerini birbirine yaklaştırmak ve küre (EB) oluşumuna izin vermek için ayrışmış iPSC'lerin yuvarlak tabanlı bir kuyu plakasında santrifüjlenmesini kullanır.

Protokol

NOT: Bu protokolde kullanılan tüm reaktifler Malzeme Tablosunda bulunabilir. Aksi belirtilmedikçe, tüm ortamlar kullanımdan önce 37 °C'ye önceden dengelenmiştir. Tüm santrifüj adımları 37 °C'de ve en yavaş hızlanma/yavaşlama modu kullanılarak gerçekleştirilir. Aksi belirtilmedikçe, süpernatan her zaman tek kullanımlık Pasteur cam pipetler kullanılarak çıkarılır.

1. İnsan iPSC'lerinin çözülmesi ve yayılması

  1. iPSC'lerin çözülmesinden bir gün önce, 200-300 μg/mL konsantrasyonda 1 mL bazal membran ekstresi ile 6 oyuklu bir plakanın kuyusunu kaplayın. Kuyu plakasını gece boyunca 4 °C'ye yerleştirin.
  2. Ertesi gün, hücreleri çözün ve bir P1000 pipeti kullanarak 15 mL'lik bir tüpe aktarın. Damla damla, 15 mM HEPES ile 5-7 mL DMEM / F-12 ekleyin.
  3. Hücreleri 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Hücreleri santrifüjden nazikçe çıkarın ve hücre peletini rahatsız etmediğinizden emin olun.
  4. Süpernatanı bir Pasteur cam pipetle dikkatlice çıkarın ve hücreleri geniş delikli P1000 kullanarak 1 mL hiPSC-serum içermeyen ortamda (10 μM Rho kinaz (ROCK) inhibitörü Y-27632 içeren hiPSC-SFM) yeniden süspanse edin.
  5. Bazal membran ekstraktını önceki gün kaplanmış kuyudan aspire edin (adım 1.1) ve 10 μM Y-27632 ile 1 mL hiPSC-SFM'yi kuyuya aktarın. Kuyucuk başına 2 mL'lik bir nihai hacme ulaşmak için kuyuya yeniden askıya alınmış iPSC'ler ekleyin.
  6. 37 °C ve %5CO2'de bir inkübatöre yerleştirmeden önce iPSC agregalarını eşit olarak dağıtmak için plakayı döndürün.
  7. hiPSC-SFM kullanarak (ROCK inhibitörü Y-27632 eklemeden) her gün tam ortam değişiklikleri gerçekleştirin. iPSC'ler genellikle 3-4 günlük yayılmadan sonra %70-80 birleşmeye ulaşır.

2. iPSC'leri geçirme

  1. iPSC'leri geçirmeden bir gün önce, 6 oyuklu bir plakanın kuyularını 200-300 μg / mL konsantrasyonda bir bazal membran özü ile kaplayın. Kuyu plakasını gece boyunca 4 °C'ye yerleştirin.
    NOT: Hücrelerin yaklaşık% 70-80 birleşmeye ulaştığını onaylayın. iPSC'lerin aşırı birleşmediğinden (%80'den fazla birleşme) emin olun, çünkü bu kendiliğinden farklılaşmayı teşvik edecektir.
  2. 10 μL veya 20 μL pipet uçları veya bir hücre kazıyıcı kullanarak stereomikroskop altında birçok ölü iPSC agregasına sahip farklılaşmış bölgeleri veya bölgeleri çıkararak iPSC'leri geçirmeye başlayın. Farklılaşmış bölgeler daha yoğun veya daha beyaz renkli görünecektir.
    NOT: Kazınmış hücre agregaları hala kısmen kuyu tabanına yapışabilir.
  3. Kuyu tabanına kısmen yapışmış olabilecek agregaları çıkarmak için kuyu tabanını geniş çaplı bir P1000 pipetle birkaç kez yıkayın.
  4. Ayrılmış iPSC agregalarını içeren iPSC'lerin işlendiği harcanan ortamı atın. Fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkama adımını iki kez daha tekrarlayın.
  5. Daha sonra, oyuk başına 1 mL 5 U / mL Dispase ekleyin. iPSC kolonilerinin kenarları, oda sıcaklığında 3-5 dakikalık inkübasyondan sonra stereomikroskop altında gözlemlenebilen kuyu plakasından kalkacaktır.
  6. Hafifçe ayrılmış agregaların yerinden çıkmasını önlemek için Dispase'i dikkatlice çıkarın ve 15 mM HEPES ile 1 mL DMEM/F-12 ekleyin. Agregaları küçük boyutlarda dilimlemek için tek kullanımlık bir hücre kaldırıcı kullanın. iPSC agrega boyutlarının tutarlılığı, bir kök hücre paslama aracı ile geliştirilebilir.
  7. Dilimlenmiş iPSC agregalarını kuyudaki besiyeri ile yıkayın ve agregalı besiyerini 5 mL'lik bir serolojik pipet veya geniş delikli uçlu P1000 kullanarak 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın.
  8. İyiliği DMEM / F-12 ile durulayın ve ortamı iPSC agregaları ile 15 mL'lik tüpe aktarın.
  9. Dilimlenmiş iPSC agregalarını 200 x g'da 3 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı bir Pasteur cam pipetle çıkarın ve 5 mL'lik bir serolojik pipet veya geniş delikli uçlara sahip P1000 kullanarak iPSC'leri yerinden çıkarmak ve yeniden süspanse etmek için 2 mL hiPSC-SFM ekleyin.
  10. Önceden kaplanmış kuyucuk plakasından/plakalarından kalan bazal membran ekstraktını aspire edin ve 6 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 1 mL hiPSC-SFM ekleyin.
  11. iPSC'leri, geniş delikli uçlara sahip bir P1000 kullanarak nihai hacim kuyu başına 2 mL hiPSC-SFM olacak şekilde 6 oyuklu bir plakanın yeni kuyucuklarına aktarın. iPSC hattına bağlı olarak, bölme oranlarının optimize edilmesi gerekir. Burada 1:6 bölme oranı kullanılmıştır.
  12. Stereomikroskop altında yüzen agregalar ve agrega boyutu için kuyuyu kontrol edin. İdeal olarak, agrega boyutu 50-200 μm arasında olmalıdır.
  13. Agregalar aktarıldıktan sonra hücreleri plaka boyunca eşit olarak dağıtmak için kuyu plakasını döndürün ve 37 ° C'de% 5 CO2'de % 70-80 birleşmeye kadar inkübe edin.

3. iPSC'lerin dondurulması

  1. iPSC hücrelerini dondurmak için, hücreleri yukarıda açıklandığı gibi pasaj yapın (bkz. protokol adımı "2. iPSC'lerin geçişi"). Hücreler koloniler halinde dilimlendikten ve kuyu dibinden yıkandıktan sonra (adım 2.10), dilimlenmiş agregaları 3 dakika boyunca 200 x g'da döndürün. Süpernatanı aspire edin.
  2. 15 mL'lik tüpe 6 oyuklu bir plakanın oyuğu başına 1 mL serumsuz kriyoprezervasyon ortamı ekleyin ve geniş delikli uçlu bir P1000 kullanarak dilimlenmiş agregaları yeniden süspanse edin.
  3. Hücreleri önceden etiketlenmiş kriyotüplere aktarın. Tüpleri kapatın ve tüpleri 4 °C'de önceden soğutulmuş bir kriyoprezervasyon kabına aktarın. Hücreleri -80 °C'de 24-48 saat saklayın.
  4. Cryovials'ı uzun süreli depolama için sıvı nitrojene aktarın.
    NOT: OC farklılaşma sürecinin şematik bir özeti Şekil 1'de gösterilmektedir.

4. Embriyoid vücut indüksiyonu

  1. EB indüksiyonu için yukarıda açıklandığı gibi yeterli iPSC'leri geliştirin ve genişletin.
    NOT: OC üretimi, embriyoid cisimlerin sayısı artırılarak yükseltilebilir ve bu da genel olarak daha yüksek hematopoietik hücre verimi üretir. %70-80 birleşik iPSC'lerden oluşan bir kuyu, 6 oyuklu bir plaka kuyusunun kuyusu başına yaklaşık 8,4 x 105 hücre verir. Bir embriyoid gövdesi oluşturmak için 12.500 tek hücreli iPSC'ye ihtiyaç vardır.
  2. Harcanan besiyerini iPSC kültürlerinden aspire edin ve iPSC kolonilerini D-PBS ile durulayın.
  3. 6 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 0,5 mL önceden ısıtılmış oda sıcaklığında tek hücreli ayrışma reaktifi ekleyin ve tüm kuyu yüzeyini kaplamak için kültür kabını döndürün. Kültür kabını 37 °C'de 5-8 dakika inkübe edin.
  4. Damarı inkübatörden çıkarın, tek hücreli ayrışma reaktifini aspire edin ve 50 ng/mL insan kemiği morfogenetik proteini 4 (hBMP4), 50 ng/mL insan vasküler endotelyal büyüme faktörü-165 (hVEGF), 20 ng/mL insan kök hücre faktörü (hSCF) içeren hiPSC-serum serbest besiyerinden oluşan kuyucuklara 1 mL Aşama 1 farklılaşma ortamı ekleyin, ve 10 μM Y-27632.
  5. Kuyuyu Aşama 1 ortamı ile durulayarak hücreleri nazikçe ayırın. Havuz, iPSC'leri 15 mL'lik konik bir tüpe ayrıştırır.
  6. Kuyucuklara 1 mL Aşama 1 farklılaşma ortamı ekleyin ve kalan hücreleri yıkayın veya kolayca yıkanmayan koloniler için bir hücre kazıyıcı kullanın.
  7. Tüm hücreleri tüpe aktardıktan sonra, bir hücre peleti oluşturmak için oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 × g'da santrifüjleyin. 5 mL'lik bir serolojik pipet veya geniş delikli uçlu bir P1000 kullanarak toplam 2 mL önceden dengelenmiş Aşama 1 farklılaşma ortamında hücreleri aspire edin ve yeniden süspanse edin.
  8. Bir hemositometre veya otomatik hücre sayma cihazı kullanarak hücreleri sayın. Ortamı, Aşama 1 farklılaşma ortamının 100 μL'sinde yuvarlak tabanlı ultra düşük ataşmanlı 96 oyuklu plakada oyuk başına 12.500 hücreye tek hücreli süspansiyonu içeren 15 mL tüpe ekleyin.
    NOT: Mikroskop altında, hücreler kuyu boyunca dağılmış hücrelerle tek hücreli bir süspansiyon olarak görünecektir.
  9. 96 oyuklu plakaları 100 x g'da 3 dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, hücreler mikroskop altında bakıldığında sferoidlere benzemeye başlamalıdır. Plakayı 24 saat boyunca 37 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirin.
  10. Aşama 1 farklılaşma ortamı ile Gün 1 ve Gün 2'de ortamın yarısını değiştirin. Verimliliği artırmak için, çok kanallı bir pipet kullanarak 50 μL harcanan Aşama 1 farklılaştırma ortamını bir Petri kabına atın.
  11. Ortamı 96 oyuklu plakadan attıktan sonra, stereomikroskop altında yanlışlıkla çıkarılmış olabilecek EB'leri kontrol edin. Yanlışlıkla çıkarılan EB'leri, geniş delikli uçlara sahip bir P1000 pipet kullanarak 96 oyuklu plakaya aktarın.
  12. Çok kanallı bir pipet kullanarak yuvarlak tabanlı ultra düşük ataşmanlı 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 50 μL taze Aşama 1 farklılaştırma ortamı ekleyin.

5. Hematopoetik farklılaşma

  1. Hematopoietik farklılaşmaya başlamadan bir gün önce, 200-300 μg / mL konsantrasyonda 1 mL bazal membran ekstresi ile 6 oyuklu bir plakanın kuyusunu kaplayın. Kuyu plakasını gece boyunca 4 °C'ye yerleştirin.
    NOT: Her kuyu, bu protokolün daha sonraki bir noktasında 8 EB alacaktır. Hazırlanan EB'lerin sayısına bağlı olarak, kuyuları uygun şekilde kaplayın.
  2. Fazla bazal membran ekstraktını aspire edin ve 6 oyuklu plakanın kuyularını, 2 mM Ultraglutamin, 55 μM 2-merkaptoetanol, 25 ng / mL insan interlökin 3 (hIL-3) ve 100 ng / mL insan makrofaj koloni uyarıcı faktörün (hM-CSF) eklendiği bir hematopoietik bazal ortamdan oluşan 3 mL Aşama 2 farklılaşma ortamı ile önceden doldurun.
  3. Geniş delikli uçlara sahip bir P1000 kullanarak, 6 oyuklu plakanın her bir kuyucuğuna 8 EB aktarın. Transferden sonra, gözle veya stereomikroskop altında her kuyucukta 8 EB olduğunu onaylayın.
    NOT: 1 gün sonra, yüzen EB'ler kuyu dibine yapışacaktır. Takip eden 5-7 gün içinde, hematopoetik hücrelerden oluşan yüzen bir hücre popülasyonu görünür hale gelmelidir. Hematopoetik farklılaşma süresi 7 günden başlayarak değişebilir. 10 gün boyunca farklılaşma, büyük CD45+, CD14+ ve CD11b+ alt popülasyonlarından oluşan hematopoietik bir popülasyon gösterdi.
  4. Aşama 2 farklılaşma ortamı ile 5 günlük tedaviden sonra, harcanan ortamı çıkararak ve 50 mL'lik konik bir tüpe dağıtarak bir ortam değişikliği gerçekleştirin. Mümkün olduğunca az yüzen hücreyi çıkarmaya çalışmak ve kayma gerilimini mümkün olduğunca düşük tutmak için yavaşça pipetleyin. Stereomikroskop altında pipetleme, hücrelerin yanlışlıkla çıkarılmasını önlemeye yardımcı olabilir.
  5. Hemen kuyucuklara 1 mL taze Aşama 2 farklılaşma ortamı ekleyin. Farklılaşma sürecinde bu noktada zaten mevcut olabilecek yüzen hematopoietik hücreleri kurtarmak için, dağıtılan ortamı atmayın. Bunun yerine, tüpü harcanan ortam ile 5 dakika boyunca 300 x g'de döndürün ve süpernatanı aspire edin.
  6. Tüpe taze Aşama 2 farklılaşma ortamı ekleyin ve harcanan ortamla aktarılmış olabilecek hücreleri ayırmak için yeniden süspanse edin.
  7. Daha önce 1 mL Aşama 2 farklılaşma ortamı ile doldurulmuş olan her bir oyuğa geri kazanılan hücrelerle birlikte 2 mL taze Aşama 2 farklılaşma ortamı ekleyin.
  8. Hematopoetik farklılaşmanın 10. gününde, çok sayıda yüzen hematopoietik hücrenin varlığını kontrol edin. 50 mL'lik bir tüpte toplayarak hasat edin. % 10 DMSO,% 50 FBS ve% 40 besiyerinde dondurulabilirler veya hücreleri OC'lere ayırmak için hemen kullanılabilirler.

6. M-CSF olgunlaşması ve OC farklılaşması

  1. 200.000 hücre/cm2 konsantrasyonda tohum hücreleri, doku kültürü üzerine iyi muamele edilmiş plakalar ve %10 FBS ve 50 ng/mL hM-CSF ile desteklenmiş alfa-MEM ile muamele edilir.
  2. Fonksiyonel tahliller veya görüntüleme yapmak için, tohumlamadan 3 gün sonra M-CSF olgunlaşmış hücreleri, geniş delikli uçlu bir P1000 kullanarak önceden ısıtılmış PBS ile 37 °C'ye kadar yıkayarak ayırın. Hücreleri tamamen ayırmak için tekrarlanan yıkama adımları gerekebilir.
  3. Ayrılan hücreleri, geniş delikli uçlu bir P1000 kullanarak 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
  4. Hücre peletini, %10 FBS, 50 ng/mL hM-CSF ve 80 ng/mL hRANKL ile desteklenmiş alfa-MEM'den oluşan OC farklılaşma ortamı ile yeniden süspanse edin ve çözün. Bir hemositometre veya otomatik hücre sayma cihazı kullanarak hücreleri sayın ve M-CSF olgunlaşmış hücreleri, fonksiyonel tahliller veya görüntüleme için uygun bir kültür kabında 200,00-250,000 hücre/cm2 yoğunlukta yeniden tohumlayın (yani, kemik rezorpsiyon deneyleri, görüntüleme için lamel slaytları, vb.).
  5. OC farklılaşma ortamı ile 7-9 gün boyunca farklılaştırın. Her 2-3 günde bir taze OC diferansiyasyon ortamı ile tam bir kuyu ortamı değişimi gerçekleştirin.
    NOT: Çok çekirdekli OC'ler tipik olarak 5-7 gün sonra ortaya çıkar.

Sonuçlar

Farklılaşma süreci boyunca hücre morfolojisinin izlenmesi
Aşağıda açıklanan tüm sonuçlar, OC farklılaşması için MCND-TENS2 iPSC hattı kullanılarak oluşturulmuştur. Bu iPSC hattı daha önce çeşitli çalışmalardakullanılmıştır 32,33. Bununla birlikte, diğer iPSC hatları da bu farklılaşma protokolü ile başarıyla kullanılmıştır.

Düzenli görsel değerlendirme, OC'lere farklılaşm...

Tartışmalar

Bu protokol, iPSC'leri OC'lere ayırmak için güvenilir ve sağlam bir yöntem sunar. Bununla birlikte, farklılaşma süreci boyunca karşılaşılabilecek çeşitli tuzaklar vardır. Farklı doku kökenli hücrelerden üretilen insan iPSC hatları, bu protokol kullanılarak başarılı bir şekilde farklılaştırılmıştır33. iPSC'leri dondururken (bkz. protokol adımı "3. iPSC'lerin dondurulması"), geçiş noktasındaki bir kuyu tekrar bir kriyoviyal olarak donduruldu. Çözdürürken (bk...

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir çıkar çatışması beyan etmezler.

Teşekkürler

Yazarlar, teknik yardım ve destekleri için Giachelli laboratuvarı üyelerine teşekkür eder. W. M. Keck Mikroskopi Merkezi'ne ve Keck Merkezi yöneticisi Dr. Nathanial Peters'a konfokal mikroskopi ve geniş alan mikroskobu görüntülerinin elde edilmesindeki yardımları için teşekkür ederiz. Ayrıca teknik destek ve yardım için UW Akış Çekirdeği Tesisi ve Akış Çekirdeği Tesisi yöneticisi Aurelio Silvestroni'ye teşekkür ederiz. Son olarak, illüstrasyon ve grafik tasarım konusundaki desteği için Hannah Blümke'ye teşekkür ederiz.

Finansman, Ulusal Sağlık Enstitüleri hibesi R35 HL139602-01 aracılığıyla sağlandı. Ayrıca, WM Keck Center'daki enstrüman finansmanı için NIH S10 hibesi S10 OD016240'ı ve UW Flow Core Facility'deki enstrüman finansmanı için NIH hibesi 1S10OD024979-01A1'i de kabul ediyoruz.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
2-MercaptoethanolSigma AldrichM6250-10ML
Antibody - Anti-Cathepsin K Abcamab19027
Antibody - APC-conjugated Anti-Human CD45BD555485
Antibody - APC-conjugated Mouse IgG1, κ Isotype ControlBD555751
Antibody - BV711-conjugated Anti-Human CD14BD563372
Antibody - BV711-conjugates Mouse IgG2b, κ Isotype ControlBD563125
Antibody - Goat Anti-Rabbit IgG H&L Alexa Fluor® 647Abcamab150079
Antibody - PE-conjugated Anti-Human CD14R&D SystemsFAB3832P-025
Antibody - PE-conjugated Anti-Human Integrin alpha M/CD11bR&D SystemsFAB16991P-025
Antibody - PE-Cy7-conjugated Anti-Human CD34BD560710
Antibody - PE-Cy7-conjugated Mouse IgG1 κ Isotype ControlBD557872
Antibody - PE/Cyanine5-conjugated Anti-Human CD11bBiolegend301308
Antibody - PE/Cyanine5-conjugated Mouse IgG1, κ Isotype CtrlBiolegend400118
Antibody - PerCP-Cy5.5-conjugated Mouse IgG1 κ Isotype ControlBD550795
Antibody - PerCpCy5.5-conjugated Anti-Human CD43BD563521
Bone Resorption Assay KitCosmoBioUSACSR-BRA-24KIT
Countess 3 Automated Cell CounterThermoFisher16812556
Cultrex Stem Cell Qualified Reduced Growth Factor Basement Membrane ExtractR&D Sytems3434-010-02Basal membrane extract
DAPIR&D Systems5748/10
Dispase (5 U/mL)STEMCELL Technologies7913
DMEM/F-12 with 15 mM HEPESStem Cell36254
DMSOSigma AldrichD2650
DPBSSigma AldrichD8537-500ML
Human Bone Morphogenetic Protein 4 (hBMP4)STEMCELL Technologies78211
Human IL-3STEMCELL Technologies78146.1
Human Macrophage Colony-stimulating Factor (hM-CSF)STEMCELL Technologies78150.1
Human Soluble Receptor Activator of Nuclear Factor-κB Ligand (hsRANKL)STEMCELL Technologies78214.1
Human Stem Cell Factor (hSCF)STEMCELL Technologies78155.1
Human TruStain FcX (Fc Receptor Blocking Solution)Biolegend422301
Human Vascular Endothelial Growth Factor-165 (hVEGF165)STEMCELL Technologies78073
Invitrogen Rhodamine PhalloidinInvitrogenR415
MEM α, nucleosides, no phenol redThermoFisher41061029
mFreSRSTEMCELL Technologies05855Serum free cryopreservation medium
mTeSR Plus mediumSTEMCELL Technologies100-0276Human iPSC-serum free medium (hiPSC-SFM)
Nunclon Sphera 96-Well, Nunclon Sphera-Treated, U-Shaped-Bottom MicroplateThermo Scientific174925Round bottom ultra-low attachment 96-well plate
P1000 Wide Bore TipsThermoFisher2079GPK
ROCK-Inhibitor Y-27632STEMCELL Technologies72304
StemSpan SFEMStemCell09650Hematopoietic cell culture medium
TrypLE Select Enzyme (1X), no phenol redThermo Fisher12563011Single-cell dissociation reagent
UltraglutamineBioscience LonzaBE17-605E/U1
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell MediumBioscience Lonza04-418QHematopoietic basal medium
µ-Slide 8 Well HighIbidi80806

Referanslar

  1. Bar-Shavit, Z. The osteoclast: A multinucleated, hematopoietic-origin, bone-resorbing osteoimmune cell. Journal of Cellular Biochemistry. 102 (5), 1130-1139 (2007).
  2. Boyce, B. F. Advances in the regulation of osteoclasts and osteoclast functions. Journal of Dental Research. 92 (10), 860-867 (2013).
  3. Buranaphatthana, W., et al. Engineered osteoclasts resorb necrotic alveolar bone in anti-RANKL antibody-treated mice. Bone. 153, 116144 (2021).
  4. Wang, L., et al. Isolation, purification, and differentiation of osteoclast precursors from rat bone marrow. Journal of Visualized Experiments. 2019 (147), e58895 (2019).
  5. Mercatali, L., et al. Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines. Journal of Visualized Experiments. (127), e56311 (2017).
  6. Marino, S., Bishop, R. T., de Ridder, D., Delgado-Calle, J., Reagan, M. R. 2D and 3D in vitro co-culture for cancer and bone cell interaction studies. Methods in Molecular Biology. 1914, 71-98 (2019).
  7. Rementer, C. W., et al. An inducible, ligand-independent receptor activator of NF-κB gene to control osteoclast differentiation from monocytic precursors. PloS One. 8 (12), e0084465 (2013).
  8. Rementer, C., et al. Engineered myeloid precursors differentiate into osteoclasts and resorb heterotopic ossification in mice. Research Square Priprint. , 2156913 (2022).
  9. Bjelić, D., Finšgar, M. Bioactive coatings with anti-osteoclast therapeutic agents for bone implants: Enhanced compliance and prolonged implant life. Pharmacological Research. 176, 106060 (2022).
  10. Minkin, C., Marinho, V. C. Role of the osteoclast at the bone-implant interface. Advances in dental research. 13, 49-56 (1999).
  11. Kodama, J., Kaito, T. Osteoclast multinucleation: Review of current literature. International Journal of Molecular Sciences. 21 (16), 1-35 (2020).
  12. Mun, S. H., Park, P. S. U., Park-Min, K. H. The M-CSF receptor in osteoclasts and beyond. Experimental & Molecular Medicine. 52 (8), 1239-1254 (2020).
  13. Plotkin, L. I., Bivi, N. Local regulation of bone cell function. Basic and Applied Bone Biology. , 47-73 (2014).
  14. Hodge, J. M., Kirkland, M. A., Nicholson, G. C. Multiple roles of M-CSF in human osteoclastogenesis. Journal of Cellular Biochemistry. 102 (3), 759-768 (2007).
  15. Ono, T., Nakashima, T. Recent advances in osteoclast biology. Histochemistry and Cell Biology. 149 (4), 325-341 (2018).
  16. Boyce, B. F., Xiu, Y., Li, J., Xing, L., Yao, Z. NF-κB-mediated regulation of osteoclastogenesis. Endocrinology and Metabolism. 30 (1), 35 (2015).
  17. Novack, D. V. Role of NF-κB in the skeleton. Cell Research. 21 (1), 169-182 (2010).
  18. Kim, K., Lee, S. H., Jung, H. K., Choi, Y., Kim, N. NFATc1 induces osteoclast fusion via up-regulation of Atp6v0d2 and the dendritic cell-specific transmembrane protein (DC-STAMP). Molecular Endocrinology. 22 (1), 176-185 (2008).
  19. Wu, H., Xu, G., Li, Y. P. Atp6v0d2 is an essential component of the osteoclast-specific proton pump that mediates extracellular acidification in bone resorption. Journal of Bone and Mineral Research. 24 (5), 871 (2009).
  20. Vignery, A. Macrophage fusion: The making of osteoclasts and giant cells. The Journal of Experimental Medicine. 202 (3), 337 (2005).
  21. Chiu, Y. H., Ritchlin, C. T. DC-STAMP: A key regulator in osteoclast differentiation. Journal of Cellular Physiology. 231 (11), 2402 (2016).
  22. Riedlova, P., Sood, S., Goodyear, C. S., Ansalone, C. Differentiation of functional osteoclasts from human peripheral blood CD14+ monocytes. Journal of Visualized Experiments. (191), e64698 (2023).
  23. Gothot, A., Pyatt, R., McMahel, J., Rice, S., Srour, E. F. Functional heterogeneity of human CD34+ cells isolated in subcompartments of the G0 /G1 phase of the cell cycle. Blood. 90 (11), 4384-4393 (1997).
  24. Dinella, J., Koster, M. I., Koch, P. J. Use of induced pluripotent stem cells in dermatological research. The Journal of Investigative Dermatology. 134 (8), e23 (2014).
  25. Grigoriadis, A. E., et al. Directed differentiation of hematopoietic precursors and functional osteoclasts from human ES and iPS cells. Blood. 115 (14), 2769-2776 (2010).
  26. Rössler, U., et al. Efficient generation of osteoclasts from human induced pluripotent stem cells and functional investigations of lethal CLCN7-related osteopetrosis. Journal of Bone and Mineral Research: The Official Journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 36 (8), 1621-1635 (2021).
  27. Chen, I. -. P. Differentiation of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) into osteoclasts. Bio-Protocol. 10 (24), e3854-e3854 (2020).
  28. Buchrieser, J., James, W., Moore, M. D. Human induced pluripotent stem cell-derived macrophages share ontogeny with MYB-independent tissue-resident macrophages. Stem Cell Reports. 8 (2), 334-345 (2017).
  29. Abe, K., et al. Endoderm-specific gene expression in embryonic stem cells differentiated to embryoid bodies. Experimental Cell Research. 229 (1), 27-34 (1996).
  30. Perlingeiro, R. C. R., Kyba, M., Daley, G. Q. Clonal analysis of differentiating embryonic stem cells reveals a hematopoietic progenitor with primitive erythroid and adult lymphoid-myeloid potential. Development. 128 (22), 4597-4604 (2001).
  31. Pettinato, G., Wen, X., Zhang, N. Engineering strategies for the formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 24 (14), 1595 (2015).
  32. Ruiz, J. P., et al. Robust generation of erythroid and multilineage hematopoietic progenitors from human iPSCs using a scalable monolayer culture system. Stem Cell Research. 41, 101600 (2019).
  33. Blümke, A., et al. Comparison of osteoclast differentiation protocols from human induced pluripotent stem cells of different tissue origins. Stem Cell Research & Therapy. 14 (1), 319 (2023).
  34. Klepikova, A., et al. iPSC-Derived Macrophages: The differentiation protocol affects cell immune characteristics and differentiation trajectories. International Journal of Molecular Sciences. 23 (24), 16087 (2022).
  35. Neely, M. D., Tidball, A. M., Aboud, A. A., Ess, K. C., Bowman, A. B. Induced pluripotent stem cells (iPSCs): An emerging model system for the study of human neurotoxicology. Neuromethods. 56, 27-61 (2011).
  36. Doulatov, S., et al. Induction of multipotential hematopoietic progenitors from human pluripotent stem cells via re-specification of lineage-restricted precursors. Cell Stem Cell. 13 (4), 459-470 (2013).
  37. Van Winkle, A. P., Gates, I. D., Kallos, M. S. Mass transfer limitations in embryoid bodies during human embryonic stem cell differentiation. Cells, Tissues, Organs. 196 (1), 34-47 (2012).
  38. Kim, J. M., et al. Assessment of differentiation aspects by the morphological classification of embryoid bodies derived from human embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 20 (11), 1925-1935 (2011).
  39. Mohr, J. C., et al. The microwell control of embryoid body size in order to regulate cardiac differentiation of human embryonic stem cells. Biomaterials. 31 (7), 1885-1893 (2010).
  40. Lopez-Yrigoyen, M., et al. Production and characterization of human macrophages from pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (158), e61038 (2020).
  41. Cao, X., et al. Differentiation and functional comparison of monocytes and macrophages from hiPSCs with peripheral blood derivatives. Stem Cell Reports. 12 (6), 1282 (2019).
  42. Omata, Y., et al. Interspecies single-cell RNA-seq analysis reveals the novel trajectory of osteoclast differentiation and therapeutic targets. JBMR Plus. 6 (7), e10631 (2022).
  43. Hodge, J. M., Kirkland, M. A., Nicholson, G. C. Multiple roles of M-CSF in human osteoclastogenesis. Journal of Cellular Biochemistry. 102 (3), 759-768 (2007).
  44. Kim, N., Takami, M., Rho, J., Josien, R., Choi, Y. A novel member of the leukocyte receptor complex regulates osteoclast differentiation. The Journal of Experimental Medicine. 195 (2), 201 (2002).
  45. Nedeva, I. R., Vitale, M., Elson, A., Hoyland, J. A., Bella, J. Role of OSCAR signaling in psteoclastogenesis and bone disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 641162 (2021).
  46. Bernhardt, A., Schamel, M., Gbureck, U., Gelinsky, M. Osteoclastic differentiation and resorption is modulated by bioactive metal ions Co2+, Cu2+ and Cr3+ incorporated into calcium phosphate bone cements. PLoS One. 12 (8), e0182109 (2017).
  47. Akasaka, T., et al. Different micro/nano-scale patterns of surface materials influence osteoclastogenesis and actin structure. Nano Research. 15 (5), 4201-4211 (2022).
  48. Hobolt-Pedersen, A. S., Delaissé, J. M., Søe, K. Osteoclast fusion is based on heterogeneity between fusion partners. Calcified Tissue International. 95 (1), 73 (2014).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Geli im BiyolojisiSay 205

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır