Differenzierung und Charakterisierung von Osteoklasten aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt die Differenzierung humaner Osteoklasten aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) dar und beschreibt Methoden zur Charakterisierung von Osteoklasten und Osteoklastenvorläufern.

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Vermehrung und Passage von humanen iPS-Zellen und ihre Differenzierung in Osteoklasten. Zunächst werden iPS-Zellen in eine einzellige Suspension dissoziiert, um sie in der Induktion des Embryoidkörpers weiter zu verwenden. Nach der mesodermalen Induktion durchlaufen die Embryoidkörper eine hämatopoetische Differenzierung, wodurch eine schwimmende hämatopoetische Zellpopulation entsteht. Anschließend durchlaufen die geernteten hämatopoetischen Zellen einen Makrophagenkolonie-stimulierenden Faktorreifungsschritt und schließlich eine Osteoklastendifferenzierung. Nach der Osteoklastendifferenzierung werden die Osteoklasten durch eine Färbung für TRAP in Verbindung mit einer methylgrünen Kernfärbung charakterisiert. Osteoklasten werden als mehrkernige, TRAP+-Polykaryonen beobachtet. Ihre Identifizierung kann durch die Cathepsin-K-Färbung weiter unterstützt werden. Knochen- und Mineralresorptionsassays ermöglichen eine funktionelle Charakterisierung und bestätigen die Identität von echten Osteoklasten. Dieses Protokoll stellt eine robuste und vielseitige Methode zur Unterscheidung menschlicher Osteoklasten von iPS-Zellen dar und ermöglicht eine einfache Anwendung in Anwendungen, die große Mengen an funktionellen menschlichen Osteoklasten erfordern. Denkbar wären Anwendungen in den Bereichen Knochenforschung, Krebsforschung, Tissue Engineering und Endoprothesenforschung.

Einleitung

Osteoklasten (OCs) sind hämatopoetische ^1,2, vielseitige Zelltypen, die häufig von Forschern in Bereichen wie der Erforschung von Knochenkrankheiten ^3,4, der^{Krebsforschung 5,6}, dem Tissue Engineering ^7,8 und^{der Endoprothesenforschung 9,10} verwendet werden. Nichtsdestotrotz kann die OC-Differenzierung eine Herausforderung darstellen, da die Fusion von mononukleären Vorläufern zu ....

Protokoll

HINWEIS: Alle in diesem Protokoll verwendeten Reagenzien finden Sie in der Materialtabelle. Sofern nicht anders angegeben, wurden alle Medien vor der Verwendung auf 37 °C voräquilibriert. Alle Zentrifugationsschritte werden bei 37 °C und im langsamsten Beschleunigungs-/Verzögerungsmodus durchgeführt. Sofern nicht anders angegeben, wird der Überstand immer mit Einweg-Pasteur-Glaspipetten entfernt.

1. Auftauen und Vermehrung humaner iPS-Zellen

1. Einen Tag vor dem Auftauen der iPS-Zellen wird eine Vertiefung einer 6-Well-Platte mit 1 ml eines Basalmembranextrakts in einer Konzentration von 200-300 μg/m....

Ergebnisse

Überwachung der Zellmorphologie während des gesamten Differenzierungsprozesses
Alle unten beschriebenen Ergebnisse wurden mit der MCND-TENS2 iPSC-Linie zur OC-Differenzierung generiert. Diese iPSC-Linie wurde bereits in mehreren Studien eingesetzt ^32,33. Nichtsdestotrotz wurden auch andere iPSC-Linien mit diesem Differenzierungsprotokoll erfolgreich eingesetzt.

Regelmäßige visuelle Untersuchungen zeigen untersch.......

Diskussion

Dieses Protokoll bietet eine zuverlässige und robuste Methode zur Unterscheidung von iPS-Zellen in OCs. Dennoch gibt es einige Fallstricke, die während des gesamten Differenzierungsprozesses auftreten können. Humane iPSC-Linien, die aus Zellen unterschiedlicher Gewebeherkunft erzeugt wurden, wurden mit diesem Protokoll erfolgreich differenziert³³. Beim Einfrieren von iPS-Zellen (siehe Protokollschritt "3. Einfrieren von iPS-Geräten") wurde eine Vertiefung zum Zeitpunkt des Durchgangs wieder in.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M6250-10ML
Antibody - Anti-Cathepsin K	Abcam	ab19027
Antibody - APC-conjugated Anti-Human CD45	BD	555485
Antibody - APC-conjugated Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD	555751
Antibody - BV711-conjugated Anti-Human CD14	BD	563372
Antibody - BV711-conjugates Mouse IgG2b, κ Isotype Control	BD	563125
Antibody - Goat Anti-Rabbit IgG H&L Alexa Fluor® 647	Abcam	ab150079
Antibody - PE-conjugated Anti-Human CD14	R&D Systems	FAB3832P-025
Antibody - PE-conjugated Anti-Human Integrin alpha M/CD11b	R&D Systems	FAB16991P-025
Antibody - PE-Cy7-conjugated Anti-Human CD34	BD	560710
Antibody - PE-Cy7-conjugated Mouse IgG1 κ Isotype Control	BD	557872
Antibody - PE/Cyanine5-conjugated Anti-Human CD11b	Biolegend	301308
Antibody - PE/Cyanine5-conjugated Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl	Biolegend	400118
Antibody - PerCP-Cy5.5-conjugated Mouse IgG1 κ Isotype Control	BD	550795
Antibody - PerCpCy5.5-conjugated Anti-Human CD43	BD	563521
Bone Resorption Assay Kit	CosmoBioUSA	CSR-BRA-24KIT
Countess 3 Automated Cell Counter	ThermoFisher	16812556
Cultrex Stem Cell Qualified Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract	R&D Sytems	3434-010-02	Basal membrane extract
DAPI	R&D Systems	5748/10
Dispase (5 U/mL)	STEMCELL Technologies	7913
DMEM/F-12 with 15 mM HEPES	Stem Cell	36254
DMSO	Sigma Aldrich	D2650
DPBS	Sigma Aldrich	D8537-500ML
Human Bone Morphogenetic Protein 4 (hBMP4)	STEMCELL Technologies	78211
Human IL-3	STEMCELL Technologies	78146.1
Human Macrophage Colony-stimulating Factor (hM-CSF)	STEMCELL Technologies	78150.1
Human Soluble Receptor Activator of Nuclear Factor-κB Ligand (hsRANKL)	STEMCELL Technologies	78214.1
Human Stem Cell Factor (hSCF)	STEMCELL Technologies	78155.1
Human TruStain FcX (Fc Receptor Blocking Solution)	Biolegend	422301
Human Vascular Endothelial Growth Factor-165 (hVEGF165)	STEMCELL Technologies	78073
Invitrogen Rhodamine Phalloidin	Invitrogen	R415
MEM α, nucleosides, no phenol red	ThermoFisher	41061029
mFreSR	STEMCELL Technologies	05855	Serum free cryopreservation medium
mTeSR Plus medium	STEMCELL Technologies	100-0276	Human iPSC-serum free medium (hiPSC-SFM)
Nunclon Sphera 96-Well, Nunclon Sphera-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate	Thermo Scientific	174925	Round bottom ultra-low attachment 96-well plate
P1000 Wide Bore Tips	ThermoFisher	2079GPK
ROCK-Inhibitor Y-27632	STEMCELL Technologies	72304
StemSpan SFEM	StemCell	09650	Hematopoietic cell culture medium
TrypLE Select Enzyme (1X), no phenol red	Thermo Fisher	12563011	Single-cell dissociation reagent
Ultraglutamine	Bioscience Lonza	BE17-605E/U1
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium	Bioscience Lonza	04-418Q	Hematopoietic basal medium
µ-Slide 8 Well High	Ibidi	80806