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Resumen

Este protocolo presenta la diferenciación de osteoclastos humanos de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) y describe métodos para la caracterización de osteoclastos y precursores de osteoclastos.

Resumen

Este protocolo detalla la propagación y el paso de las iPSCs humanas y su diferenciación en osteoclastos. En primer lugar, las iPSC se disocian en una suspensión unicelular para su posterior uso en la inducción de cuerpos embrioides. Después de la inducción mesodérmica, los cuerpos embrioides experimentan diferenciación hematopoyética, produciendo una población flotante de células hematopoyéticas. Posteriormente, las células hematopoyéticas recolectadas se someten a una etapa de maduración del factor estimulante de colonias de macrófagos y, finalmente, a la diferenciación de osteoclastos. Después de la diferenciación de los osteoclastos, los osteoclastos se caracterizan por la tinción de TRAP junto con una tinción nuclear de verde de metilo. Los osteoclastos se observan como policariones multinucleados TRAP+. Su identificación puede ser respaldada por la tinción de catepsina K. Los ensayos de reabsorción ósea y mineral permiten la caracterización funcional, confirmando la identidad de los osteoclastos de buena fe. Este protocolo demuestra un método robusto y versátil para diferenciar los osteoclastos humanos de las iPSC y permite una fácil adopción en aplicaciones que requieren grandes cantidades de osteoclastos humanos funcionales. Se podrían prever aplicaciones en las áreas de investigación ósea, investigación del cáncer, ingeniería de tejidos e investigación de endoprótesis.

Introducción

Los osteoclastos (OC) son tipos celulares versátiles derivados de hematopoyéticos 1,2 que son comúnmente utilizados por los investigadores en áreas como la investigación de enfermedades óseas 3,4, la investigación del cáncer 5,6, la ingeniería de tejidos 7,8 y la investigación de endoprótesis 9,10. Sin embargo, la diferenciación de los CO puede ser un reto, ya que la fusión de precursores mononucleares en CO multinucleados es necesaria para crear OC funcionales11. Varios factores biológicos, como el activador del receptor del ligando NF-κB (RANKL) y el factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), son necesarios para la diferenciación del CO. Se ha reportado que M-CSF tiene un efecto positivo sobre la proliferación celular, la supervivencia celular y la expresión de RANK 12,13,14. Por otro lado, RANKL se une a RANK, que activa cascadas de señalización aguas abajo que inducen osteoclastogénesis. La activación está mediada por el factor 6 asociado al receptor de TNF (TRAF6), que conduce a la degradación del factor nuclear del potenciador del gen del polipéptido de luz kappa en el inhibidor de células B, alfa (IκB-α), una proteína de unión que se une a los dímeros NF-kB16,17. Por lo tanto, la degradación de IκB-α libera dímeros NF-kB, que luego se translocan al núcleo e inducen la expresión de los factores de transcripción c-Fos y el factor nuclear de las células T activadas 1 (NFATc1). Esto, a su vez, desencadena la transcripción de una multitud de proteínas relacionadas con la diferenciación de OC15,18. Las proteínas reguladas al alza, como DC-Stamp y Atp6v0d2, median la fusión célula-célula de los precursores de OC, lo que conduce a la formación de sincitio 19,20,21.

Con respecto a las células primarias humanas, las PBMC CD34+ y CD14+ son actualmente los tipos celulares más utilizados para la diferenciación en OC22. Sin embargo, este enfoque está limitado por la heterogeneidad dentro de la población CD34+ de células recolectadas de donantes23 y su limitada capacidad de expansión. Las iPSC humanas presentan una fuente alternativa para los AO. Como pueden propagarse indefinidamente24, permiten la capacidad de expansión y el aumento de la producción de CO. Esto permite la diferenciación de un gran número de CO, lo que facilita la investigación de CO.

Se han publicado varios protocolos para la diferenciación de las iPSC en CO 25,26,27. Todo el proceso de diferenciación se puede dividir en una parte de propagación de iPSC, una parte de diferenciación mesodérmica y hematopoyética, y una diferenciación de OC. La propagación de iPSCs antes del proceso de diferenciación permite aumentar la producción de CO antes de la diferenciación. Existen varios enfoques con respecto a la diferenciación mesodérmica y hematopoyética. Tradicionalmente, la formación de cuerpos embrioides (EB) se ha utilizado para diferenciar las células hematopoyéticas, pero los enfoques basados en monocapas representan otra estrategia de diferenciación hematopoyética que no requiere la inducción de EB. Sin embargo, los sistemas basados en monocapa parecen requerir una mayor optimización, ya que nosotros y otros hemos encontrado que los enfoques basados en EB son más robustos para la diferenciación de los CO.

Aquí, describimos la diferenciación de los OC de las iPSC humanas utilizando un protocolo basado en EB. Este protocolo fue adaptado de Rössler et al.26 y modificado para aumentar la robustez y permitir la criopreservación durante el proceso de diferenciación. En primer lugar, recolectamos células hematopoyéticas solo una vez después de 10 días de diferenciación. A continuación, las células hematopoyéticas se criopreservaron para permitir una mayor flexibilidad durante el proceso de diferenciación. Además, aumentamos la densidad de siembra de células hematopoyéticas de 1 x 105 a 2 x 105 células/cm2 para la diferenciación de OC. Se utilizó un medio humano más reciente libre de suero iPSC (hiPSC-SFM, ver Tabla de Materiales), y el recubrimiento de los pocillos se realizó con 200-300 μg/mL de un extracto de membrana basal (ver Tabla de Materiales) en lugar de gelatina al 0,1%. La penicilina/estreptomicina no se añadió a los medios de comunicación.

El protocolo de Rössler et al.26 fue adaptado originalmente de una iPSC a un protocolo de diferenciación de macrófagos28 que utiliza la formación de EB para la diferenciación hematopoyética. Si bien la formación de EB ha sido utilizada durante un tiempo prolongado por los investigadores para la diferenciación hematopoyética29,30, se han descrito varios métodos de inducción de EB en la literatura, como la agregación espontánea, la centrifugación en una placa de pocillo de fondo redondo, el cultivo en gotas colgantes, el cultivo en biorreactor, el cultivo en tubo cónico, el vaso lateral de giro lento y el cultivo en gel de micromoho31. Este protocolo utiliza la centrifugación de iPSC disociadas en una placa de pocillos de fondo redondo para acercar las células iPSC individuales entre sí y permitir la formación de esferas (EB), como se describe a continuación.

Protocolo

NOTA: Todos los reactivos utilizados en este protocolo se pueden encontrar en la Tabla de Materiales. A menos que se especifique lo contrario, todos los medios se preequilibraron a 37 °C antes de su uso. Todos los pasos de centrifugación se realizan a 37 °C y utilizando el modo de aceleración/desaceleración más lento. A menos que se especifique lo contrario, el sobrenadante siempre se elimina con pipetas de vidrio desechables Pasteur.

1. Descongelación y propagación de iPSCs humanas

  1. Un día antes de descongelar las iPSC, cubra un pocillo de una placa de 6 pocillos con 1 ml de un extracto de membrana basal a una concentración de 200-300 μg/ml. Coloque la placa del pocillo a 4 °C durante la noche.
  2. Al día siguiente, descongele y transfiera las células a un tubo de 15 ml con una pipeta P1000. Gota a gota, agregue 5-7 mL de DMEM/F-12 con 15 mM de HEPES.
  3. Centrifugar las células a 300 x g durante 5 min. Retire suavemente las células de la centrífuga y asegúrese de no alterar el gránulo de la celda.
  4. Retire cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta de vidrio Pasteur y vuelva a suspender las células en 1 ml de medio libre de suero hiPSC (hiPSC-SFM que contiene 10 μM de inhibidor de la Rho quinasa (ROCK) Y-27632) utilizando P1000 con puntas de diámetro ancho.
  5. Aspirar el extracto de membrana basal del pocillo recubierto el día anterior (paso 1.1) y transferir 1 mL de hiPSC-SFM con 10 μM Y-27632 al pocillo. Agregue iPSC resuspendidas al pocillo para alcanzar un volumen final de 2 ml por pocillo.
  6. Agite la placa para distribuir uniformemente los agregados de iPSC antes de colocarlos en una incubadora a 37 °C y 5% de CO2.
  7. Realice cambios completos del medio cada dos días utilizando hiPSC-SFM (sin la adición del inhibidor de ROCK Y-27632). Las iPSC suelen alcanzar el 70-80% de confluencia después de 3-4 días de propagación.

2. Pasar las iPSC

  1. Un día antes de pasar las iPSC, cubra los pocillos de una placa de 6 pocillos con un extracto de membrana basal a una concentración de 200-300 μg/mL. Coloque la placa de pocillos a 4 °C durante toda la noche.
    NOTA: Confirme que las células han alcanzado aproximadamente el 70-80% de confluencia. Asegúrese de que las iPSC no tengan una confluencia excesiva (más del 80 % de confluencia), ya que esto promoverá la diferenciación espontánea.
  2. Comience a pasar las iPSC eliminando las regiones diferenciadas o las regiones con muchos agregados de iPSC muertos bajo el microscopio estereoscópico utilizando puntas de pipeta de 10 μL o 20 μL o un raspador de células. Las regiones diferenciadas aparecerán de color más denso o más blanco.
    NOTA: Los agregados celulares raspados aún pueden adherirse parcialmente al fondo del pozo.
  3. Lave el fondo del pozo varias veces con una pipeta P1000 de diámetro ancho para eliminar los agregados que aún puedan estar parcialmente adheridos al fondo del pozo.
  4. Deseche el medio gastado en el que se han cultivado las iPSC que contiene los agregados de iPSC desprendidos. Repita el paso de lavado dos veces más con solución salina tamponada con fosfato (PBS).
  5. A continuación, agregue 1 mL de 5 U/mL de Dispasa por pocillo. Los bordes de las colonias de iPSC se desprenderán de la placa del pocillo, lo que se puede observar bajo el microscopio estereoscópico después de 3-5 minutos de incubación a temperatura ambiente.
  6. Retire con cuidado Dispasa para evitar que los agregados se desprendan ligeramente y agregue 1 mL de DMEM/F-12 con 15 mM de HEPES. Use un elevador de celdas desechable para cortar los agregados en tamaños pequeños. La consistencia de los tamaños agregados de iPSC se puede mejorar con una herramienta de paso de células madre.
  7. Lave los agregados iPSC cortados en rodajas con el medio en el pocillo y transfiera el medio con agregados a un tubo cónico de 15 ml con una pipeta serológica de 5 ml o P1000 con una punta de orificio ancho.
  8. Enjuague el pocillo con DMEM/F-12 y transfiera el medio al tubo de 15 ml con los agregados iPSC.
  9. Centrifugar los agregados de iPSC cortados en rodajas a 200 x g durante 3 min. Retire el sobrenadante con una pipeta de vidrio Pasteur y agregue 2 ml de hiPSC-SFM para desalojar y resuspender las iPSC con una pipeta serológica de 5 ml o P1000 con puntas de ánima ancha.
  10. Aspire el extracto de membrana basal sobrante de la(s) placa(s) de pocillos prerrevestida y agregue 1 mL de hiPSC-SFM a cada pocillo de la placa de 6 pocillos.
  11. Transfiera las iPSC a nuevos pocillos de una placa de 6 pocillos de modo que el volumen final sea de 2 ml de hiPSC-SFM por pocillo utilizando un P1000 con puntas de diámetro ancho. Dependiendo de la línea iPSC, es necesario optimizar las relaciones de división. En este caso, se utilizó una relación de división de 1:6.
  12. Verifique el pozo en busca de agregados flotantes y el tamaño del agregado bajo el microscopio estereoscópico. Idealmente, el tamaño del agregado debe estar entre 50-200 μm.
  13. Agite la placa de pocillos para distribuir las células uniformemente a través de la placa después de que los agregados se hayan transferido e incubar a 37 °C al 5% de CO2 hasta una confluencia del 70-80%.

3. Congelar las iPSC

  1. Para volver a congelar las células iPSC, pase las células como se ha descrito anteriormente (consulte el paso del protocolo "2. Aprobación de iPSC"). Después de que las células se hayan cortado en colonias y se hayan lavado del fondo del pocillo (paso 2.10), gire los agregados cortados a 200 x g durante 3 min. Aspirar el sobrenadante.
  2. Agregue 1 ml de medio de criopreservación sin suero por pocillo de una placa de 6 pocillos al tubo de 15 ml y vuelva a suspender los agregados en rodajas con un P1000 con una punta de orificio ancho.
  3. Transfiera las células a criotubos premarcados. Cierre los tubos y transfiéralos a un recipiente de criopreservación preenfriado a 4 °C. Almacenar las celdas a -80 °C durante 24-48 h.
  4. Transfiera los crioviales a nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.
    NOTA: En la Figura 1 se ilustra un resumen esquemático del proceso de diferenciación de OC.

4. Inducción del cuerpo embrioide

  1. Cultive y expanda suficientes iPSC como se describió anteriormente para la inducción de EB.
    NOTA: La producción de OC se puede aumentar aumentando el número de cuerpos embrioides, lo que a su vez produce un mayor rendimiento general de células hematopoyéticas. Un pocillo de iPSC confluentes al 70-80% produce aproximadamente 8,4 x 105 células por pocillo de un pocillo de placa de 6 pocillos. Se necesitan 12.500 iPSC unicelulares para formar un cuerpo embrioide.
  2. Aspire el medio gastado de los cultivos de iPSC y enjuague las colonias de iPSC con D-PBS.
  3. Agregue 0,5 ml de reactivo de disociación de una sola celda precalentado a temperatura ambiente a cada pocillo de una placa de 6 pocillos y agite el recipiente de cultivo para cubrir toda la superficie del pocillo. Incubar el recipiente de cultivo a 37 °C durante 5-8 min.
  4. Retire el recipiente de la incubadora, aspire el reactivo de disociación de una sola célula y agregue 1 ml del medio de diferenciación de la etapa 1 a los pocillos, que consiste en medio libre de suero hiPSC con 50 ng/ml de proteína morfogenética ósea humana 4 (hBMP4), 50 ng/ml de factor de crecimiento endotelial vascular humano-165 (hVEGF), 20 ng/ml de factor de células madre humanas (hSCF), y 10 μM Y-27632.
  5. Separe suavemente las células enjuagando el pocillo con el medio de la Etapa 1. Pool disoció las iPSC en un tubo cónico de 15 mL.
  6. Agregue 1 ml de medio de diferenciación de la etapa 1 a los pocillos y lave las células restantes o use un raspador de células para las colonias que no se lavan fácilmente.
  7. Después de transferir todas las células al tubo, centrifugue a 200 × g durante 5 minutos a temperatura ambiente para formar un gránulo de celda. Aspirar y resuspender las células en un total de 2 mL de medio de diferenciación preequilibrado de la Etapa 1 utilizando una pipeta serológica de 5 mL o una P1000 con una punta de diámetro ancho.
  8. Cuente las células con un hemocitómetro o un dispositivo automatizado de recuento de células. Agregue el medio al tubo de 15 ml que contiene la suspensión de una sola célula para colocar 12.500 células por pocillo en una placa de 96 pocillos de fijación ultrabaja de fondo redondo en 100 μl del medio de diferenciación de la etapa 1.
    NOTA: Bajo el microscopio, las células aparecerán como una suspensión unicelular con células dispersas por todo el pocillo.
  9. Centrifugar las placas de 96 pocillos durante 3 minutos a 100 x g. Después de la centrifugación, las células deben comenzar a parecerse a los esferoides cuando se observan bajo el microscopio. Coloque la placa en una incubadora a 37 °C durante 24 h.
  10. Cambie la mitad del medio en el día 1 y el día 2 con el medio de diferenciación de la etapa 1. Para mejorar la eficiencia, utilice una pipeta multicanal para desechar 50 μl del medio de diferenciación gastado de la Etapa 1 en una placa de Petri.
  11. Después de desechar el medio de la placa de 96 pocillos, verifique si hay EB bajo el microscopio estereoscópico que puedan haber sido extraídos accidentalmente. Transfiera los EB extraídos accidentalmente a la placa de 96 pocillos utilizando una pipeta P1000 con puntas de diámetro ancho.
  12. Añada 50 μl de medio de diferenciación fresco de la fase 1 a cada pocillo de una placa de 96 pocillos de fijación ultrabajo de fondo redondo con una pipeta multicanal.

5. Diferenciación hematopoyética

  1. Un día antes de comenzar la diferenciación hematopoyética, recubra un pocillo de una placa de 6 pocillos con 1 mL de un extracto de membrana basal a una concentración de 200-300 μg/mL. Coloque la placa del pocillo a 4 °C durante la noche.
    NOTA: Cada pozo recibirá 8 EB en un momento posterior de este protocolo. Dependiendo de la cantidad de EB preparados, cubra los pozos en consecuencia.
  2. Aspirar el exceso de extracto de membrana basal y prellenar los pocillos de la placa de 6 pocillos con 3 mL del medio de diferenciación de la Etapa 2, que consiste en un medio basal hematopoyético al que se agregan 2 mM de ultraglutamina, 55 μM de 2-mercaptoetanol, 25 ng/mL de interleucina humana 3 (hIL-3) y 100 ng/mL de factor estimulante de colonias de macrófagos humanos (hM-CSF).
  3. Usando un P1000 con puntas de diámetro ancho, transfiera 8 EB a cada pocillo de la placa de 6 pocillos. Después de la transferencia, confirme a ojo o bajo el microscopio estereoscópico que hay 8 EB en cada pocillo.
    NOTA: Después de 1 día, los EB flotantes se adherirán al fondo del pozo. En los siguientes 5-7 días, una población de células flotantes que comprende células hematopoyéticas debería hacerse visible. El período de diferenciación hematopoyética puede variar, comenzando con 7 días. La diferenciación durante 10 días mostró una población hematopoyética compuesta por grandes subpoblaciones CD45+, CD14+ y CD11b+ .
  4. Después de 5 días de tratamiento con el medio de diferenciación de la etapa 2, realice un cambio de medio retirando el medio gastado y dispensándolo en un tubo cónico de 50 ml. Pipetear lentamente para tratar de eliminar la menor cantidad posible de células flotantes y mantener el esfuerzo cortante lo más bajo posible. El pipeteo bajo un microscopio estereoscópico puede ayudar a evitar la extracción accidental de células.
  5. Agregue inmediatamente 1 ml de medio de diferenciación fresco de la etapa 2 a los pocillos. Para recuperar las células hematopoyéticas flotantes que ya puedan estar presentes en este punto del proceso de diferenciación, no deseche el medio dispensado. Más bien, gire por el tubo con el medio gastado a 300 x g durante 5 minutos y aspire el sobrenadante.
  6. Agregue medio de diferenciación fresco de la etapa 2 al tubo y vuelva a suspender para separar las células que podrían haber sido transferidas con el medio gastado.
  7. Agregue 2 mL del medio de diferenciación fresco de la Etapa 2 con las células recuperadas en cada pocillo, que previamente se llenó con 1 mL del medio de diferenciación de la Etapa 2.
  8. En el día 10 de la diferenciación hematopoyética, verifique la presencia de un gran número de células hematopoyéticas flotantes. Cosechar recogiéndolos en un tubo de 50 mL. Pueden congelarse de nuevo en 10% de DMSO, 50% de FBS y 40% de medio o usarse inmediatamente para diferenciar las células en OC.

6. Maduración de M-CSF y diferenciación de OC

  1. Las células semilla a una concentración de 200.000 células/cm2 en placas de cultivo de tejidos tratadas y tratadas con alfa-MEM, suplementadas con FBS al 10% y 50 ng/mL de hM-CSF.
  2. Para realizar ensayos funcionales o imágenes, separe las células maduras de M-CSF 3 días después de la siembra lavándolas con PBS precalentado a 37 °C utilizando un P1000 con una punta de diámetro ancho. Es posible que se necesiten pasos de lavado repetidos para separar completamente las células.
  3. Transfiera las células separadas a un tubo de 15 ml con un P1000 con punta de diámetro ancho y centrifugue a 300 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante.
  4. Vuelva a suspender y disuelva el gránulo celular con el medio de diferenciación de OC, que consiste en alfa-MEM suplementado con FBS al 10%, 50 ng/mL hM-CSF y 80 ng/mL hRANKL. Contar las células utilizando un hemocitómetro o un dispositivo automatizado de recuento celular y volver a sembrar las células maduras de M-CSF a una densidad de 200.00-250.000 células/cm2 en un material de cultivo apropiado para ensayos funcionales o de obtención de imágenes (es decir, ensayos de resorción ósea, portaobjetos de cubreobjetos para la obtención de imágenes, etc.).
  5. Diferenciar con el medio de diferenciación OC durante 7-9 días. Realice un cambio completo del medio de pocillo con el medio de diferenciación OC fresco cada 2-3 días.
    NOTA: Los AO multinucleados suelen aparecer después de 5 a 7 días.

Resultados

Monitorización de la morfología celular a lo largo del proceso de diferenciación
Todos los resultados que se describen a continuación se generaron utilizando la línea MCND-TENS2 iPSC para la diferenciación de OC. Esta línea iPSC ha sido utilizada previamente en varios estudios 32,33. Sin embargo, otras líneas de iPSC también se han utilizado con éxito con este protocolo de diferenciación.

La evaluación v...

Discusión

Este protocolo ofrece un método fiable y robusto para diferenciar las iPSC en OC. Sin embargo, hay varios escollos que se pueden encontrar a lo largo del proceso de diferenciación. Las líneas de iPSC humanas generadas a partir de células de diferentes orígenes tisulares se han diferenciado con éxito utilizando este protocolo33. Al volver a congelar las iPSC (consulte el paso de protocolo "3. Congelación de iPSCs"), un pozo en el punto de paso se congeló de nuevo en un criovial. Al desconge...

Divulgaciones

Los autores declaran no tener intereses contrapuestos.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer a los miembros del laboratorio Giachelli por su ayuda técnica y apoyo. Agradecemos al Centro de Microscopía W. M. Keck y al gerente del Centro Keck, el Dr. Nathanial Peters, por su ayuda en la obtención de las imágenes de microscopía confocal y microscopía de campo amplio. También agradecemos a la UW Flow Core Facility y al gerente de Flow Core Facility, Aurelio Silvestroni, por su apoyo técnico y asistencia. Por último, agradecemos a Hannah Blümke el apoyo con la ilustración y el diseño gráfico.

La financiación se proporcionó a través de la subvención R35 HL139602-01 de los Institutos Nacionales de Salud. También reconocemos la subvención S10 de los NIH S10 OD016240 para la financiación de instrumentos en el Centro W. M. Keck, así como la subvención 1S10OD024979-01A1 de los NIH para la financiación de instrumentos en el Centro Central de Flujo de la UW.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
2-MercaptoethanolSigma AldrichM6250-10ML
Antibody - Anti-Cathepsin K Abcamab19027
Antibody - APC-conjugated Anti-Human CD45BD555485
Antibody - APC-conjugated Mouse IgG1, κ Isotype ControlBD555751
Antibody - BV711-conjugated Anti-Human CD14BD563372
Antibody - BV711-conjugates Mouse IgG2b, κ Isotype ControlBD563125
Antibody - Goat Anti-Rabbit IgG H&L Alexa Fluor® 647Abcamab150079
Antibody - PE-conjugated Anti-Human CD14R&D SystemsFAB3832P-025
Antibody - PE-conjugated Anti-Human Integrin alpha M/CD11bR&D SystemsFAB16991P-025
Antibody - PE-Cy7-conjugated Anti-Human CD34BD560710
Antibody - PE-Cy7-conjugated Mouse IgG1 κ Isotype ControlBD557872
Antibody - PE/Cyanine5-conjugated Anti-Human CD11bBiolegend301308
Antibody - PE/Cyanine5-conjugated Mouse IgG1, κ Isotype CtrlBiolegend400118
Antibody - PerCP-Cy5.5-conjugated Mouse IgG1 κ Isotype ControlBD550795
Antibody - PerCpCy5.5-conjugated Anti-Human CD43BD563521
Bone Resorption Assay KitCosmoBioUSACSR-BRA-24KIT
Countess 3 Automated Cell CounterThermoFisher16812556
Cultrex Stem Cell Qualified Reduced Growth Factor Basement Membrane ExtractR&D Sytems3434-010-02Basal membrane extract
DAPIR&D Systems5748/10
Dispase (5 U/mL)STEMCELL Technologies7913
DMEM/F-12 with 15 mM HEPESStem Cell36254
DMSOSigma AldrichD2650
DPBSSigma AldrichD8537-500ML
Human Bone Morphogenetic Protein 4 (hBMP4)STEMCELL Technologies78211
Human IL-3STEMCELL Technologies78146.1
Human Macrophage Colony-stimulating Factor (hM-CSF)STEMCELL Technologies78150.1
Human Soluble Receptor Activator of Nuclear Factor-κB Ligand (hsRANKL)STEMCELL Technologies78214.1
Human Stem Cell Factor (hSCF)STEMCELL Technologies78155.1
Human TruStain FcX (Fc Receptor Blocking Solution)Biolegend422301
Human Vascular Endothelial Growth Factor-165 (hVEGF165)STEMCELL Technologies78073
Invitrogen Rhodamine PhalloidinInvitrogenR415
MEM α, nucleosides, no phenol redThermoFisher41061029
mFreSRSTEMCELL Technologies05855Serum free cryopreservation medium
mTeSR Plus mediumSTEMCELL Technologies100-0276Human iPSC-serum free medium (hiPSC-SFM)
Nunclon Sphera 96-Well, Nunclon Sphera-Treated, U-Shaped-Bottom MicroplateThermo Scientific174925Round bottom ultra-low attachment 96-well plate
P1000 Wide Bore TipsThermoFisher2079GPK
ROCK-Inhibitor Y-27632STEMCELL Technologies72304
StemSpan SFEMStemCell09650Hematopoietic cell culture medium
TrypLE Select Enzyme (1X), no phenol redThermo Fisher12563011Single-cell dissociation reagent
UltraglutamineBioscience LonzaBE17-605E/U1
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell MediumBioscience Lonza04-418QHematopoietic basal medium
µ-Slide 8 Well HighIbidi80806

Referencias

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