JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يقدم هذا البروتوكول تقنية تروية كبد كولاجيناز محسنة من خطوتين في نموذج الفئران ويظهر استخدام خلايا الكبد المعزولة للثقافة طويلة الأجل في المختبر من عضويات 3D.

Abstract

خلايا الكبد الأولية هي أداة شائعة الاستخدام للدراسات المتعلقة بالكبد في المختبر . ومع ذلك ، فإن صيانة هذه الخلايا كانت دائما تحديا بسبب الفقدان السريع للمورفولوجيا والجدوى والوظائف في الثقافة. النهج الحديث للثقافة طويلة الأجل هو توليد عضويات ثلاثية الأبعاد (3D) ، وهي أداة في المختبر يمكنها تلخيص الأنسجة في طبق يعتمد على القدرة الرائعة للكبد على تجديد نفسه. تم تصميم البروتوكولات المنشورة للحصول على عضويات 3D وظيفية طويلة الأجل من خلايا الكبد الأولية للبالغين (Hep-Orgs). تتطلب أداة 3D العضوية المتطورة القدرة على عزل الخلايا عن الأنسجة البالغة ، وهذه الخطوة الأولية ضرورية للحصول على نتيجة نهائية عالية الجودة. لا يزال نضح كولاجيناز المكون من خطوتين ، والذي تم تقديمه في سبعينيات القرن العشرين ، إجراء صالحا للحصول على خلايا كبدية مفردة. تهدف هذه المقالة إلى وصف جميع الخطوات الحاسمة للإجراء الجراحي ، وبالتالي تحسين إجراء عزل خلايا الكبد الأولية في نموذج الفئران. علاوة على ذلك ، يتم إيلاء اهتمام خاص لإرشادات PREPARE لزيادة احتمالية نجاح الإجراءات وضمان نتائج عالية الجودة. يسمح بروتوكول مفصل للباحثين بتسريع وتحسين العمل النهائي لإنشاء عضويات 3D من خلايا الكبد الأولية للفئران البالغة. بالمقارنة مع خلايا الكبد 2D ، كانت Hep-Orgs لا تزال قابلة للحياة وفي انتشار نشط في اليوم 15 ، مما يدل على إمكانات طويلة الأجل.

Introduction

خلايا الكبد الأولية هي أداة مهمة ومستخدمة على نطاق واسع للدراسات المتعلقة بالكبد في المختبر . ومع ذلك ، كان توسعها وصيانتها يمثل تحديا تاريخيا ، حيث تفقد التشكل والوظائف بعد بضعة أيام في الثقافة1. ثقافة 2D هي حالة مقيدة ، على وجه الخصوص ، لخلايا الكبد التي لها شكل متعدد الأضلاع وبنية مستقطبة مع أغشية قمية وقاعدية متباينة. في الواقع ، يتداخل التصاق خلايا الكبد بالصفيحة مع نشاطها الطبيعي لأنه يؤدي إلى هيكل خلوي مسطح مع تفاعل محدود بين الخلايا وبين الخلايا والمصفوفة خارج الخلية (ECM) ، مما يقلل من الاستقطاب ومسارات الإشارات المعنية2.

لتجاوز قيود هذه الطريقة ، استخدم دن وزملاؤه3 أولا طبقة الكولاجين المزدوجة. تعتمد طريقة الاستزراع هذه ، المعروفة باسم "طريقة زراعة الساندويتش" ، على بذر خلايا الكبد الأولية بين طبقتي المصفوفة. هذه الطريقة لها العديد من المزايا ، بما في ذلك الثقافة طويلة الأجل ، والحفاظ على التشكل متعدد الأضلاع ، وأنشطة النسخ المماثلة لتلك الموجودة في خلايا الكبد المعزولة حديثا4. أثبتت طريقة مماثلة ، تستند إلى نفس المبدأ ، حيث تتكون الطبقة السفلية من Matrigel بينما يكون تراكب الكولاجين ، وجود شبكة قناة راسخة5.

على الرغم من موثوقية طريقة زراعة الساندويتش لنمو خلايا الكبد ، فإن العمل الحالي يتطلع إلى إنشاء ثقافة 3D-organoid ، وهي أداة في المختبر تستخدم لتلخيص الأنسجة في طبق وتشكيل جسر محتمل نحو الطب الشخصي ، مما يسمح بتوليد رؤى بيولوجية خاصة بالمرض ، وتحديد الأهداف الجزيئية ، واختبار الأدوية ، وإنشاء البنوك الحيوية ، وفتح آفاق جديدة للتقنيات المبتكرة مثل العضو على الرقاقة6. تم تضمين خلايا الكبد الأولية في قطرات مصفوفة نصف كروية تعرف باسم "القباب" للسماح بنمو قوي للعضويات داخل القباب ولضمان تدفق العوامل القابلة للذوبان ، بما في ذلك عامل نمو خلايا الكبد (HGF) وعامل نمو البشرة (EGF) ، من وسط الاستزراع. تعمل عوامل النمو هذه على تنشيط مسارات الإشارات بشكل مباشر لضمان بقاء خلايا الكبد7. عادة ما يتم الحصول على عضويات الكبد من الخلايا الجذعية / السلفية المعزولة من المراحل الجنينية أو الجرذان البالغة والفئران والكبد البشري (وكذلك والقطط)8. حتى لو كان التشكل 3D يحسن تمايز الخلايا الجذعية إلى خلايا الكبد البالغة ، فإن هذه الأداة لا تزال تفتقر إلى نضج الأنسجة الأوليةالأصلية 9. للتغلب على هذه المشكلة ، في عام 2018 ، نشرت مجموعتان مختلفتان 9,10 في وقت واحد بروتوكولا للحصول على ثقافة طويلة الأجل من عضويات الكبد ثلاثية الأبعاد بدءا من خلايا الكبد الأولية للفأر البالغة (يشار إليها باسم Hep-Orgs). تلخص بروتوكولاتهم استجابة الضرر التكاثري لتجديد الكبد ، وتنمو خلايا الكبد بمستوى عال من السيتوكينات الالتهابية كما يحدث بعد استئصال الكبد الجزئي. في الواقع ، تظهر الدراسات المذكورة أعلاه أن خلايا الكبد يمكن أن تتحول إلى حالة الأقنية بعد الإصابة12 أو عندما يتم قمع تكاثر الخلايا الصفراوية13. تسمح قدرتها ثنائية القدرة باللدونة الخلوية ، وهو أمر مهم للهياكل المعقدة مثل المواد العضوية. لذلك ، تتغلب هذه البروتوكولات على مشكلة عدم القدرة على توسيع خلايا الكبد الأولية في المختبر.

تتطلب أداة 3D العضوية المتطورة القدرة على عزل الخلايا عن الأنسجة البالغة ، وهذه الخطوة الأولية ضرورية للحصول على نتيجة نهائية عالية الجودة. في حين أن إعداد 3D organoid يمكن اعتباره تقنية حديثة ومتطورة (لأن تعريف organoid صاغه Lancaster14 و Huch15 قبل عشر سنوات فقط) ، فإن نضح كولاجيناز المكون من خطوتين هو إجراء قديم قدمه Seglen في سبعينيات القرن العشرين16. مع التركيز على أحدث المنشورات في هذا المجال ، يمكن اعتبار بروتوكولات Ng17 و Shen18 المعيار الذهبي لأداء الإجراء في الفئران ، في حين أن بروتوكولات Cabral19 و Charni-Natan20 للفئران. ليس من غير المعتاد أن يركز الباحثون على اختيار أفضل مصفوفة خارج الخلية (ECM) وعوامل النمو لتطوير عضويات 3D حتى الآن تصطدم بالفشل مثل الإجراء الجراحي غير السليم ، أو انخفاض صلاحية خلايا الكبد والمحصول ، أو مستويات عالية من التلوث البكتيري. هذه المشاكل تطيل التجارب النهائية وتزيد من عدد اللازمة للتجارب التالية. على العكس من ذلك ، إذا تم إعداد الإجراءات الجراحية والعزلة بشكل جيد ، فإن العدد الكبير من خلايا الكبد القابلة للحياة التي تم الحصول عليها يسمح بإعداد عدد كبير من المواد العضوية ، مما يحد من استخدام. يعالج البروتوكول الحالي هذه القضايا بشكل أساسي باستخدام الحلول التجارية ومن خلال تحسين قنية الوريد البابي الدقيقة التي تضمن خطوات التروية والهضم المثلى مع الكبد في الموقع.

من أجل تحسين جودة أبحاثنا على وقابليتها للتكرار وإمكانية ترجمتها ، نظرنا بعناية في إرشادات PREPARE: تخطيط البحوث والإجراءات التجريبية على: توصيات للتميز21. تحاول إرشادات إعداد التقارير هذه زيادة احتمالية النجاح من خلال التخطيط وتمثل خطوة مهمة في تنفيذ 3Rs of Russel and Burch (الاستبدال والتخفيض والصقل). تغطي إرشادات PREPARE 15 موضوعا رئيسيا يجب معالجتها وفقا لكل مشروع بحثي فردي. سنصف الموضوعات التي ركزنا عليها أثناء التخطيط والإعداد للمشروع.

يهدف العمل الحالي إلى وصف ، في بروتوكول شامل ومفصل وتبعي ، الخطوات الحاسمة للجراحة في نموذج الفئران للسماح للباحثين بتسريع وتحسين العمل النهائي. عندما اقتربنا من هذه البروتوكولات في البداية ، واجهنا مشاكل التلوث البكتيري ، وانخفاض كفاءة هضم الكبد ، وانخفاض إنتاجية خلايا الكبد الأولية ، وانخفاض صلاحية خلايا الكبد التي يمكن أن تؤثر بسهولة على نجاح التقنية. يوضح هذا البروتوكول كيفية معالجة الميزات الهامة وحلها ، وقد حسن إجراء عزل خلايا الكبد الأولية للفئران. يعد نضح كبد الفئران وعزل خلايا الكبد الأولية اللاحقة للبالغين الخطوات الأولية الرئيسية للتطبيقات المختلفة. على وجه الخصوص ، هذا البروتوكول مناسب لجميع الإجراءات التي تتطلب عائدا جيدا من خلايا الكبد البالغة عالية الجودة وعالية البقاء. نتائج البروتوكول مناسبة لإنشاء نماذج في المختبر لدراسة فسيولوجيا الكبد وأمراضه.

Protocol

تم إجراء جميع الإجراءات وإسكان وفقا للمبادئ التوجيهية للقانون الإيطالي وتوجيه الجماعة الأوروبية. تمت الموافقة على البروتوكول التجريبي من قبل لجنة رعاية المحلية ووزارة الصحة الإيطالية (تصريح رقم 321/2022-PR) وفقا للمادة 31 من المرسوم 26/2014.

1. التحضير لإجراء

ملاحظة: يرجى الرجوع إلى الجدول 1 لمعرفة التركيب المتوسط والمخزن المؤقت وجدول المواد للحصول على التفاصيل التجارية.

  1. قم بتسخين الحمام المائي على حرارة 42 درجة مئوية ثم ضع مخزن التروية المؤقت و 1x PBS في حمام مائي لمدة 20 دقيقة تقريبا.
    ملاحظة: بسبب حساسية الإنزيم ، يتم تسخين المخزن المؤقت للهضم فقط عند بدء إجراء التروية بنجاح. أثناء إجراء التروية ، حافظ على الحلول في الحمام المائي.
  2. ضع وسيط ويليام الكامل و PBS + 3٪ P / S على الجليد.
  3. قم بإعداد المضخة التمعجية وتوصيل الأنبوب بالزجاجة الزجاجية ومصيدة الفقاعات ، وكلاهما مملوء بمخزن التروية.
  4. أثناء تحضير المضخة ، املأ الأنبوب بمخزن مؤقت دافئ لإزالة الهواء وغسل الإيثانول المتبقي (سرعة المضخة المنخفضة). هذه الخطوة مهمة أيضا للتحقق من التشغيل الصحيح للمضخة واحتمال تسرب الأنبوب.

2. التحضير لعزل خلايا الكبد

  1. أثناء إجراء ، قم بتعريض الأدوات التالية لضوء الأشعة فوق البنفسجية: طبق بتري 100 مم ، مصفاة خلية 100 ميكرومتر ، حجم مكشطة M ، ملاقط كبيرة ، دورق للثلج ، صينية للثلج.

3. الإجراء الحيواني الأولي والتخدير

  1. تخدير الفئران البالغة (250-350 جم من وزن الجسم ؛ 10-12 أسبوعا) عن طريق الحقن داخل الصفاق لمزيج التخدير (التركيز النهائي للزيلازين: 22.5 مجم / كجم ؛ للكيتامين: 112.5 مجم / كجم ؛ الحجم النهائي تقريبا: 0.8-1.0 مل).
  2. راقب عمق التخدير عن طريق قرص إصبع القدم حتى لا يستجيب الجرذ للمنبهات الضارة. عادة ما يستغرق 5 دقائق. تضمن جرعة التخدير تخديرا جراحيا عميقا يقلل من خطر المعاناة أو الضيق أثناء العملية
    ملاحظة: الاستنزاف هو الطريقة الثانوية للقتل الرحيم للفئران المستخدمة في هذه التجربة ، ويضمن أن قد تم قتله رحيما بشكل فعال.
  3. حلق البطن ونظفه بنسبة 70٪ من الإيثانول لتقليل التلوث البكتيري أثناء الجراحة.
    ملاحظة: هذه جراحة غير قابلة للبقاء على قيد الحياة ، لذلك لا يتم الحفاظ على التعقيم الكامل.
  4. ضع الجرذ في منتصف صينية التشريح وقم بتأمين الأطراف باستخدام الإبر.
  5. قم بعمل شق على شكل حرف U عبر الجلد والعضلات من وسط أسفل البطن إلى القفص الصدري ، وقم بتثبيت الجلد ، وقم بطيه حتى الرأس ، وفضح الأمعاء.
  6. حرك الأمعاء بعناية إلى الجانب الأيسر من ، من تجويف البطن ، وفضح الوريد البابي الكبدي والوريد الأجوف.
  7. باستخدام كماشة تشغيل خيط القطن تحت الوريد البابي وإعداد 2 عقدة ، 1 سم واحدة من الأخرى ، التي تحيط الوريد نفسه.
    ملاحظة: من السهل تصور الخيط الأسود.
  8. حقن 100-150 وحدة دولية من الهيبارين المذاب في 1x PBS (الحجم الكلي 300 ميكرولتر) في الوريد الأجوف لمنع تخثر الدم.

4. القنية والتروية الكبدية

  1. قم بتشغيل المضخة بمعدل سرعة منخفض (أقل من 1 مل / دقيقة تدفق).
  2. أدخل الأوعية الدموية 18 G في الوريد البابي على مستوى الخيط بزاوية مسطحة بالنسبة للوريد.
  3. قم بإزالة الإبرة الداخلية يدويا لترك القنية في الوريد. سوف يتدفق الدم بداخله ، ويملأ القابس ويتجنب فقاعات الهواء المحاصرة في الخطوة التالية.
  4. بينما يتدفق المخزن المؤقت للتروية في الأنبوب ، قم بتوصيل القنية بالضغط على الزر C بنهاية المخرج باستخدام موصل قفل Luer.
  5. في هذه المرحلة ، اربط العقد ، واحدة حول القسطرة داخل الوريد والأخرى حول القسطرة ، قبل دخول الوريد لتثبيت الأنبوب في الموضع الصحيح.
  6. قطع الوريد الأجوف للسماح للدم بالخروج. تأكد من أن الكبد يبدأ في التورم والتبييض بسرعة (ثوان) في 2-3 ثوان. هذا يؤكد أن المخزن المؤقت للتروية يتدفق بشكل صحيح عبر الكبد.
    ملاحظة: إذا بقيت بعض الفصوص حمراء ، يتم وضع قسطرة وعائية عميقة جدا. إذا كانت هناك بقع حمراء فقط ، فإن النقر برفق على الكبد يمكن أن يساعد في التروية في النقاط المحددة. صب حوالي 1x PBS على البطن المفتوح للمساعدة في تحريك الدم والتحقق من وجود تسرب.
  7. قم بزيادة تدفق المضخة ببطء إلى 10 مل / دقيقة واحتفظ بها لمدة 10 دقائق على الأقل للسماح بتنظيف الكبد من الدم.
  8. أثناء التروية ، اضغط على الوريد الأجوف باستخدام برعم قطني لمدة 10 ثوان: تأكد من أن الكبد يتضخم عند التثبيت ويسترخي عند إطلاقه. كرر الضغط بشكل دوري (5-10 مرات) وتحقق من تورم الكبد وانسياجه.
    ملاحظة: تعمل هذه الخطوة كنقطة تفتيش حاسمة للتحقق من صحة التروية بشكل واضح. لقد كان ضروريا في ضمان حيوية عالية لخلايا الكبد وتعظيم العائد النهائي. من خلال التحقق النشط من هذه العملية ، يمكن أن يصل المخزن المؤقت بشكل فعال إلى جميع أجزاء الأوعية الدموية في الكبد ، وهو ما لن يحققه تطهير الدم السلبي وحده.

5. هضم الكبد

  1. بعد التروية ، قم بالتبديل إلى مخزن الهضم قبل التسخين دون مقاطعة التدفق وتجنب فقاعات الهواء في الأنبوب.
    ملاحظة: يمكن أن يساعد تقليل التدفق مؤقتا في تنفيذ هذا المقطع. يحتوي المخزن المؤقت للهضم على الفينول الأحمر ، مما يسهل تصور التحول من المخزن المؤقت للتروية إلى المخزن المؤقت للهضم.
  2. قم بزيادة سرعة المضخة إلى 20 مل / دقيقة واضغط بشكل دوري باستخدام المسحة لتورم الكبد والاسترخاء.
  3. بعد هذه الخطوة (التي تستمر حوالي 15 دقيقة) ، تأكد من أن الكبد يصبح طريا بشكل متزايد. عند هذه النقطة ، يمكن إزالة الإبرة ، وتتوقف المضخة.
  4. نظرا لأن كبسولة الكبد هشة بعد الهضم ، قم بتشريح الكبد بلطف وبعناية: أمسك النسيج الضام المركزي بين الفصوص بالملقط. قطع جميع الاتصالات إلى الأعضاء الأخرى ورفع الكبد.
  5. اغسل الكبد ، واغمره في محلول PBS + 3٪ P / S المبرد مسبقا لبضع ثوان. ثم ضعه في أنبوب ويليام الكامل الذي يحتوي على وسيط مبرد مسبقا.
    ملاحظة: يضمن الاستنزاف والموت التروية عبر الوريد الأجوف. يأتي تأكيد وفاة من استرواح الصدر الناجم عن اللحظة التي يتم فيها زرع الكبد ، ويتم تشريح الحجاب الحاجز بالكامل ، وعند الفحص ، لم يعد التنفس ونبض القلب يعملان.

6. تنقية خلايا الكبد

  1. تحت الغطاء البيولوجي ، انقل الكبد إلى طبق بتري 100 مم مع 15 مل من وسط ويليام الكامل البارد فوق صينية مليئة بالثلج.
  2. اضغط على العضو بقوة باستخدام الكاشطة لتحرير الخلايا في الوسط.
    ملاحظة: إذا تم تنفيذ مرحلة الهضم بشكل صحيح ، يجب أن يكون إطلاق الخلية سهلا ولا يتطلب الكثير من الضغط على الكبد. لا تقطع الكبد إلى قطع. اتركه سليما. الحفاظ على الكبد مغمورا في الوسط يحسن إطلاق الخلايا.
  3. اجمع الخلايا التي تحتوي على الوسط وقم بترشيحها باستخدام مرشح 100 ميكرومتر أثناء نقلها إلى أنبوب مخروطي معقم. يسمح الترشيح بإزالة الأنسجة الضامة وشظايا الأنسجة غير المهضومة.
  4. صب حوالي 15 مل من وسط ويليام الكامل البارد على الكبد المهروس في طبق بتري للمساعدة في إطلاق المزيد من الخلايا. كرر الخطوتين 6.2 و6.3.
  5. كرر النقطة 6.4 مرة واحدة على الأقل ، حتى يتم تحرير جميع الخلايا. إذا لزم الأمر ، قسم الوسيط إلى أنابيب مخروطية أكثر واستخدم مرشحات متعددة 100 ميكرومتر.
    ملاحظة: بعد إطلاق خلايا الكبد وقبل التصفية ، يجب أن يبدو الوسط معتما بسبب وجود خلايا الكبد. يجب أن يبدو الكبد المتبقي ليفيا وسيتم التخلص منه.
  6. جهاز طرد مركزي الوسط المصفى الذي يحتوي على خلايا كبدية عند 50 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية مع فرامل منخفضة السرعة.
    ملاحظة: خلايا الكبد أكثر كثافة من خلايا الكبد الأخرى. بسبب انخفاض قوة الطرد المركزي ، ستكون خلايا الكبد فقط في الحبيبات ، بينما ستبقى الخلايا الأخرى في المادة الطافية.
  7. تخلص من المادة الطافية دون إزعاج حبيبات الخلية. أضف برفق حوالي 40 مل من وسط ويليام الكامل المثلج في الأنبوب وماصة ببطء لأعلى ولأسفل من 2 إلى 3 مرات لإعادة تعليق حبيبات الخلية.
    ملاحظة: يجب إعادة تعليق حبيبات الخلية بعناية لتجنب إتلاف الخلايا.
  8. أجهزة الطرد المركزي عند 50 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: بالنسبة للمحاولات الأولى ، عد الخلايا القابلة للحياة باستخدام مقايسة 1:10 تريبان الزرقاء بعد الطرد المركزي الثاني قبل المتابعة إلى الخطوات التالية. هذا يمكن أن يتجنب إضاعة الوسائط والوقت إذا كانت جميع الخلايا ميتة.
  9. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 25 مل من وسط ويليام المثلج الكامل.
  10. أضف 25 مل من محلول التدرج الكثيف بنسبة 90٪ في الأنبوب واخلطه برفق.
    ملاحظة: يفصل محلول تدرج الكثافة خلايا الكبد القابلة للحياة عن خلايا الكبد الميتة وحطام الخلايا بناء على كثافتها.
  11. أجهزة الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. يجب الحصول على حبيبات مرئية في الجزء السفلي من الأنبوب ، تتوافق مع خلايا الكبد القابلة للحياة ، وطبقة واضحة في الجزء العلوي من التدرج تتكون من خلايا الكبد الميتة.
    ملاحظة: إذا لم يكن هناك حبيبات على الإطلاق ، فحاول خلط المحلول مرة أخرى عن طريق الدوران وتكرار الطرد المركزي.
  12. نضح طبقة الخلايا الميتة من أعلى التدرج واترك 1-2 مل من الوسط مع الحبيبات.
  13. أعد تعليق الحبيبات في 30-40 مل من وسيط ويليام الكامل.
    ملاحظة: بالنسبة للإجراء بأكمله ، استخدم فقط 25 مل من الماصات المصلية. قد تقلل الماصات ذات التجويف الأصغر من صلاحية خلايا الكبد. يجب إجراء جميع الخطوات على الجليد للحفاظ على +4 درجة مئوية.
  14. جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية ، ثم نضح المادة الطافية.

7. ثقافة خلايا الكبد وجمع الحمض النووي الريبي

  1. أضف كمية مناسبة من الوسيط لحساب عدد الخلايا. عد صلاحية الخلية مع 1:10 تريبان الأزرق.
  2. 2D ثقافة خلايا الكبد
    1. خلايا الصفيحة بتركيز 500000 خلية / بئر من طبق 6 آبار على صفيحة خلوية مغلفة بالكولاجين مع وسط ويليام الكامل الذي تم تسخينه مسبقا.
    2. ضع زراعة الخلايا في حاضنة مرطبة مع 95٪ هواء ، 5٪ CO2 عند 37 درجة مئوية.
    3. بعد 4 ساعات ، قم بتغيير الوسيط إلى وسيط ويليام الكامل الجديد الذي تم تسخينه مسبقا.
    4. الحفاظ على الخلايا في الحاضنة. تغيير الوسيلة يوميا.
    5. جمع خلايا الكبد الأولية في كاشف لاستخراج الحمض النووي الريبي قبل الطلاء (اليوم 0) وفي الأيام من 1 إلى 3 من الثقافة.
    6. استخراج الحمض النووي الريبي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة ونسخه عكسيا إلى cDNA لتقييم جينات الواسمات الكبدية بواسطة RT-qPCR. يتم عرض قائمة التمهيدي في الجدول 2.
  3. لثقافة خلايا الكبد 3D على المدى الطويل:
    1. أعد تعليق الخلايا في المصفوفة النقية الباردة بتركيز 1000-10000 خلية في 20 ميكرولتر.
      ملاحظة: حاول تجنب عمل فقاعات مصفوفة.
    2. باستخدام أطراف ماصة مبردة مسبقا ، قطرات الخلايا المحتوية على مصفوفة اللوحة في لوحة زراعة الخلايا الدافئة مسبقا.
    3. اقلب اللوحة رأسا على عقب واتركها في حاضنة زراعة الخلايا لمدة 20-30 دقيقة.
    4. اقلبه وأضف وسط خلايا الكبد طويل الأجل 3D المسخن مسبقا ووسط الثقافة المحدد وفقا لعمل Peng22. الحفاظ على الخلايا في الحاضنة.
    5. تغيير 3D متوسطة خلايا الكبد على المدى الطويل كل 2-3 أيام.
    6. بعد 14 يوما على الأقل من الثقافة ، يتم فصل Hep-Orgsare عن المصفوفة ويتم تقييم Hep-Orgs القابلة للحياة بواسطة مقايسة انتشار Trypan blue و EdU ويتم تمريرها وفقا لعمل Peng.

النتائج

في نهاية إجراءات الإعداد (الخطوة 6.13) ، حصلنا على إنتاجية خلية تصل إلى 1 × 108 خلايا لكل عزل من الكبد يبلغ حوالي 300 غرام من الفئران. تم إثبات صلاحية الخلية بين 78٪ و 97٪ من خلال عد تريبان الأزرق.

كما هو موضح بالفعل في الدراسات السابقة1،

Discussion

3D-organoids هي حدود للطب الشخصي وتسمح بثقافة خلايا الكبد على المدى الطويل. تتطلب جودة هذه التقنية المبتكرة عائدا جيدا من خلايا الكبد الأولية القابلة للحياة ونضح الكبد وعزل خلايا الكبد بشكل جيد. لا يزال هذا الإجراء القديم يستخدم على نطاق واسع. ومع ذلك ، فإنه يشتمل على خطوات مخ?...

Disclosures

كشف جميع المؤلفين عن أي وجميع تضارب المصالح.

Acknowledgements

نشكر الدكتور دافيدي سيلفستريل والبروفيسور جيوفاني سورينتينو من SorrentinoLab في جامعة تريست لمساعدتنا في إجراء اختبار انتشار EdU. تم دعم العمل من خلال منحة Banca d'Italia المخصصة ومنح FIF الداخلية.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
A83-01- ALK5 Inhibitor IVTwin Helix T3031
B27Thermofisher Scientific0080085SA
CFX Connect Real-Time PCR Detection System  Bio-Rad
CHIR99021Twin HelixT2310
Click EdU Alexa 488 imaging kitThermofisher ScientificC10499
Collagen, Type I, solution from rat tailMerckC3867-1VL
Dexamethasone MerckD4902
EGFMerck E9644
Fetal bovine serum (FBS)EurocloneECS0180L
GELTREX LDEV FREE RGF BMEThermofisher ScientificA1413202
Heparin Sodium 25000 IU/5 mlB. Braun Melsungen AGB01AB01
HGFPeprotech 100-39H 
Insulin-Transferrin-Selenium solution 100x Thermofisher Scientific41400045
L-Glutamine solutionEurocloneECB3000D
Liver Digest Medium Thermofisher Scientific 17703-034
Liver Perfusion MediumThermofisher Scientific17701038
N2 supplementThermofisher Scientific17502048
N-acetylcysteineMerckA9165
NicotinamideMerck N-0636
Non-Essential Amino AcidsMerckM7145
NormocinAurogeneant-nr-1
PBS buffer 1XPanReac AppliChemA0964,9050
Penicillin-streptomycin solution 100xEurocloneECB3001D
PercollSanta Cruzsc-296039A
Peristaltic pumpIsmatec™ MS-4/12 Reglo Digital Pump
TNFaPeprotech 300-01A
TRI ReagentMerckT9424
Tubing Ismatec™  ID.2,79mm
Williams' E Medium, no glutamineThermofisher Scientific31415029
Y27632Twin HelixT1725

References

  1. Heslop, J. A., et al. Mechanistic evaluation of primary human hepatocyte culture using global proteomic analysis reveals a selective dedifferentiation profile. Arch Toxicol. 91 (1), 439-452 (2017).
  2. Ietto, G., et al. Multicellular liver organoids: Generation and importance of diverse specialized cellular components. Cells. 12 (10), 1429 (2023).
  3. Dunn, J. C., Tompkins, R. G., Yarmush, M. L. Hepatocytes in collagen sandwich: evidence for transcriptional and translational regulation. J Cell Biol. 116 (4), 1043-1053 (1992).
  4. Keemink, J., Oorts, M., Annaert, P. Primary Hepatocytes in sandwich culture. Methods in Mol Biol (Clifton, N.J). 1250, 175-188 (2015).
  5. Kaur, I., et al. Primary hepatocyte isolation and cultures: Technical aspects, challenges and advancements. Bioengineering (Basel, Switzerland). 10 (2), 131 (2023).
  6. Thompson, W. L., Takebe, T. Human liver model systems in a dish. Dev Growth Differ. 63 (1), 47-58 (2021).
  7. Takebe, T., Wells, J. M. Organoids by design. Science (New York, N.Y.). 364 (6444), 956-959 (2019).
  8. Nantasanti, S., de Bruin, A., Rothuizen, J., Penning, L. C., Schotanus, B. A. Concise review: organoids are a powerful tool for the study of liver disease and personalized treatment design in humans and animals. Stem Cells Transl Med. 5 (3), 325-330 (2016).
  9. Raju, R., et al. In vitro pluripotent stem cell differentiation to hepatocyte ceases further maturation at an equivalent stage of e15 in mouse embryonic liver development. Stem Cells Dev. 27 (13), 910-921 (2018).
  10. Peng, W. C., et al. Inflammatory cytokine TNFalpha promotes the long-term expansion of primary hepatocytes in 3D culture. Cell. 175 (6), 1607-1619.e15 (2018).
  11. Hu, H., et al. Long-term expansion of functional mouse and human hepatocytes as 3d organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606.e19 (2018).
  12. Michalopoulos, G. K., Bowen, W. C., Mulè, K., Lopez-Talavera, J. C., Mars, W. Hepatocytes undergo phenotypic transformation to biliary epithelium in organoid cultures. Hepatology (Baltimore, Md). 36 (2), 278-283 (2002).
  13. Schaub, J. R., et al. De novo formation of the biliary system by TGFβ-mediated hepatocyte transdifferentiation. Nature. 557 (7704), 247-251 (2018).
  14. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science (New York, N.Y.). 345 (6194), 1247125 (2014).
  15. Huch, M., Koo, B. -. K. Modeling mouse and human development using organoid cultures. Development (Cambridge, England). 142 (18), 3113-3125 (2015).
  16. Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods in Cell Biol. 13, 29-83 (1976).
  17. Ng, I. C., et al. Isolation of primary rat hepatocytes with multiparameter perfusion control. J Vis Exp. (170), e62289 (2021).
  18. Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q. -. H., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. J Vis Exp. (64), e3917 (2012).
  19. Cabral, F., et al. Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion. J Vis Exp. (132), e56993 (2018).
  20. Charni-Natan, M., Goldstein, I. Protocol for primary mouse hepatocyte isolation. STAR protoc. 1 (2), 100086 (2020).
  21. Smith, A. J., Clutton, R. E., Lilley, E., Hansen, K. E. A., Brattelid, T. PREPARE: Guidelines for planning animal research and testing. Lab Anim. 52 (2), 135-141 (2018).
  22. Kluiver, T. A., Kraaier, L. J., Peng, W. C. Long-term expansion of murine primary hepatocyte organoids. Methods in Molecular Biol (Clifton, N.J). 2544, 1-13 (2022).
  23. Shulman, M., Nahmias, Y. Long-term culture and coculture of primary rat and human hepatocytes. Methods in Molecular Biol (Clifton, N.J). 945, 287-302 (2013).
  24. Knobeloch, D., et al. Human hepatocytes: isolation, culture, and quality procedures. Methods in Molecular Biol (Clifton, N.J). 806, 99-120 (2012).
  25. Queral, A. E., DeAngelo, A. B., Garrett, C. T. Effect of different collagenases on the isolation of viable hepatocytes from rat liver. Anal Biochem. 138 (1), 235-237 (1984).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

213

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved