Perfusion hépatique de rat et isolement des hépatocytes primaires : une procédure ancienne cruciale pour la culture d’organoïdes 3D de pointe

Résumé

Ce protocole présente une technique optimisée de perfusion hépatique de collagénase en deux étapes dans un modèle de rat et montre l’utilisation d’hépatocytes isolés pour la culture in vitro à long terme d’organoïdes 3D.

Résumé

Les hépatocytes primaires sont un outil couramment utilisé pour les études in vitro liées au foie. Cependant, l’entretien de ces cellules a toujours été un défi en raison de la perte rapide de morphologie, de viabilité et de fonctionnalité en culture. Une approche récente de la culture à long terme est la génération d’organoïdes tridimensionnels (3D), un outil in vitro qui permet de récapituler les tissus d’une boîte en fonction de la merveilleuse capacité du foie à se régénérer. Des protocoles publiés ont été conçus pour obtenir des organoïdes 3D fonctionnels à long terme à partir d’hépatocytes adultes primaires (Hep-Orgs). L’outil de pointe des organoïdes 3D nécessite la capacité d’isoler des cellules de tissus adultes, et cette étape initiale est cruciale pour un résultat final de haute qualité. La perfusion de collagénase en deux étapes, introduite dans les années 1970, est toujours une procédure valable pour obtenir des hépatocytes uniques. Le présent article vise à décrire toutes les étapes cruciales de l’intervention chirurgicale, optimisant ainsi la procédure d’isolement des hépatocytes primaires dans le modèle de rat. En outre, une attention particulière est accordée aux directives PREPARE afin d’augmenter les chances de réussite des procédures et de garantir des résultats de haute qualité. Un protocole détaillé permet aux chercheurs d’accélérer et d’optimiser le travail en aval pour établir des organoïdes 3D à partir d’hépatocytes primaires de rats adultes. Comparativement aux hépatocytes 2D, les Hep-Org étaient encore viables et en prolifération active au 15e jour, démontrant un potentiel à long terme.

Introduction

Les hépatocytes primaires sont un outil important et largement utilisé pour les études in vitro liées au foie. Cependant, leur expansion et leur entretien ont toujours été difficiles, car ils perdent leur morphologie et leur fonctionnalité après quelques jours dans la culture¹. La culture 2D est une condition limitante, en particulier, pour les hépatocytes de forme polygonale et de structure polarisée avec des membranes apicales et basolatérales différenciées. En fait, l’adhésion des hépatocytes à la plaque interfère avec leur activité normale car elle conduit à un cytosquelette plat avec une interacti....

Protocole

Toutes les procédures et l’hébergement des animaux ont été effectués conformément aux directives de la loi italienne et de la directive de la Communauté européenne. Le protocole expérimental a été approuvé par le Comité local de protection des animaux et par le ministère italien de la Santé (permis n° 321/2022-PR) conformément à l’article 31 du décret 26/2014.

1. Préparation à la procédure animale

REMARQUE : Veuillez vous référer au tableau 1 pour la composition du support et du tampon et au tableau des matériaux pour les détails c....

Résultats

À la fin des procédures de mise en place (étape 6.13), nous avons obtenu un rendement cellulaire allant jusqu’à 1 x 10⁸ cellules par isolement à partir du foie d’environ 300 g d’un rat. La viabilité cellulaire entre 78 % et 97 % a été établie par comptage au bleu de trypan.

Comme déjà décrit dans des études précédentes ^1,18,19, les hép.......

Discussion

Les organoïdes 3D sont une frontière pour la médecine personnalisée et permettent une culture hépatocytaire à long terme. La qualité de cette technique innovante nécessite un bon rendement en hépatocytes primaires viables et une perfusion hépatique et une isolation des hépatocytes bien réalisées. Cette ancienne procédure est encore largement utilisée ; Cependant, il comprend différentes étapes qui peuvent être difficiles. En abordant la procédure, nous avons rencontré.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
A83-01- ALK5 Inhibitor IV	Twin Helix	T3031
B27	Thermofisher Scientific	0080085SA
CFX Connect Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad
CHIR99021	Twin Helix	T2310
Click EdU Alexa 488 imaging kit	Thermofisher Scientific	C10499
Collagen, Type I, solution from rat tail	Merck	C3867-1VL
Dexamethasone	Merck	D4902
EGF	Merck	E9644
Fetal bovine serum (FBS)	Euroclone	ECS0180L
GELTREX LDEV FREE RGF BME	Thermofisher Scientific	A1413202
Heparin Sodium 25000 IU/5 ml	B. Braun Melsungen AG	B01AB01
HGF	Peprotech	100-39H
Insulin-Transferrin-Selenium solution 100x	Thermofisher Scientific	41400045
L-Glutamine solution	Euroclone	ECB3000D
Liver Digest Medium	Thermofisher Scientific	17703-034
Liver Perfusion Medium	Thermofisher Scientific	17701038
N2 supplement	Thermofisher Scientific	17502048
N-acetylcysteine	Merck	A9165
Nicotinamide	Merck	N-0636
Non-Essential Amino Acids	Merck	M7145
Normocin	Aurogene	ant-nr-1
PBS buffer 1X	PanReac AppliChem	A0964,9050
Penicillin-streptomycin solution 100x	Euroclone	ECB3001D
Percoll	Santa Cruz	sc-296039A
Peristaltic pump	Ismatec™	MS-4/12 Reglo Digital Pump
TNFa	Peprotech	300-01A
TRI Reagent	Merck	T9424
Tubing	Ismatec™	ID.2,79mm
Williams' E Medium, no glutamine	Thermofisher Scientific	31415029
Y27632	Twin Helix	T1725