Perfusion hépatique de rat et isolement des hépatocytes primaires : une procédure ancienne cruciale pour la culture d’organoïdes 3D de pointe

Résumé

Ce protocole présente une technique optimisée de perfusion hépatique de collagénase en deux étapes dans un modèle de rat et montre l’utilisation d’hépatocytes isolés pour la culture in vitro à long terme d’organoïdes 3D.

Résumé

Les hépatocytes primaires sont un outil couramment utilisé pour les études in vitro liées au foie. Cependant, l’entretien de ces cellules a toujours été un défi en raison de la perte rapide de morphologie, de viabilité et de fonctionnalité en culture. Une approche récente de la culture à long terme est la génération d’organoïdes tridimensionnels (3D), un outil in vitro qui permet de récapituler les tissus d’une boîte en fonction de la merveilleuse capacité du foie à se régénérer. Des protocoles publiés ont été conçus pour obtenir des organoïdes 3D fonctionnels à long terme à partir d’hépatocytes adultes primaires (Hep-Orgs). L’outil de pointe des organoïdes 3D nécessite la capacité d’isoler des cellules de tissus adultes, et cette étape initiale est cruciale pour un résultat final de haute qualité. La perfusion de collagénase en deux étapes, introduite dans les années 1970, est toujours une procédure valable pour obtenir des hépatocytes uniques. Le présent article vise à décrire toutes les étapes cruciales de l’intervention chirurgicale, optimisant ainsi la procédure d’isolement des hépatocytes primaires dans le modèle de rat. En outre, une attention particulière est accordée aux directives PREPARE afin d’augmenter les chances de réussite des procédures et de garantir des résultats de haute qualité. Un protocole détaillé permet aux chercheurs d’accélérer et d’optimiser le travail en aval pour établir des organoïdes 3D à partir d’hépatocytes primaires de rats adultes. Comparativement aux hépatocytes 2D, les Hep-Org étaient encore viables et en prolifération active au 15e jour, démontrant un potentiel à long terme.

Introduction

Les hépatocytes primaires sont un outil important et largement utilisé pour les études in vitro liées au foie. Cependant, leur expansion et leur entretien ont toujours été difficiles, car ils perdent leur morphologie et leur fonctionnalité après quelques jours dans la culture¹. La culture 2D est une condition limitante, en particulier, pour les hépatocytes de forme polygonale et de structure polarisée avec des membranes apicales et basolatérales différenciées. En fait, l’adhésion des hépatocytes à la plaque interfère avec leur activité normale car elle conduit à un cytosquelette plat avec une interaction limitée entre les cellules et entre les cellules et la matrice extracellulaire (ECM), réduisant la polarisation et les voies de signalisation impliquées².

Pour contourner les limites de cette méthode, Dunn et ses collègues^ont d’abord utilisé la double couche de collagène. Cette méthode de culture, connue sous le nom de « méthode de culture sandwich », est basée sur l’ensemencement d’hépatocytes primaires entre les deux couches de la matrice. Cette méthode présente de nombreux avantages, notamment la culture à long terme, le maintien de la morphologie polygonale et des activités transcriptionnelles comparables à celles des hépatocytes⁴ fraîchement isolés. Une méthode similaire, basée sur le même principe, où la sous-couche est composée de Matrigel tandis que la superposition de collagène, a mis en évidence la présence d’un réseau canaliculaire bien établi⁵.

Malgré la fiabilité de la méthode de culture sandwich pour la croissance des hépatocytes, le présent travail vise à mettre en place une culture d’organoïdes 3D, un outil in vitro utilisé pour récapituler les tissus dans une boîte et former un pont potentiel vers la médecine personnalisée, permettant de générer des informations biologiques spécifiques à la maladie, d’identifier des cibles moléculaires, de tester des médicaments, d’établir des biobanques et d’ouvrir de nouveaux horizons pour des technologies innovantes comme l’organe sur puce⁶. Les hépatocytes primaires ont été intégrés dans des gouttelettes de matrice hémisphérique appelées « dômes » pour permettre une croissance robuste des organoïdes à l’intérieur des dômes et pour garantir le flux des facteurs solubles, y compris le facteur de croissance des hépatocytes (HGF) et le facteur de croissance épidermique (EGF), à partir du milieu de culture. Ces facteurs de croissance activent directement les voies de signalisation pour assurer la survie des hépatocytes⁷. Les organoïdes hépatiques sont généralement obtenus à partir de cellules souches/progénitrices isolées à partir de stades embryonnaires ou de rats adultes, de souris, de foie humain (mais aussi de chiens et de chats)⁸. Même si la conformation 3D améliore la différenciation des cellules souches en hépatocytes adultes, cet outil n’a toujours pas la maturité du tissu primaire d’origine⁹. Pour pallier ce problème, en 2018, deux groupes différents ^9,10 ont publié simultanément un protocole permettant d’obtenir une culture à long terme d’organoïdes hépatiques 3D à partir d’hépatocytes primaires de souris adultes (appelés Hep-Orgs). Leurs protocoles récapitulent la réponse proliférative des dommages de la régénération hépatique, la croissance d’hépatocytes avec un niveau élevé de cytokines inflammatoires comme cela se produit après une hépatectomie partielle. En effet, les études ci-dessus démontrent que les hépatocytes peuvent passer à un état canalaire après une lésion¹² ou lorsque la prolifération des cholangiocytes est supprimée¹³. Leur capacité bipotente permet la plasticité cellulaire, ce qui est important pour les structures complexes telles que les organoïdes. Par conséquent, ces protocoles surmontent le problème de l’incapacité à développer les hépatocytes primaires in vitro.

L’outil de pointe des organoïdes 3D nécessite la capacité d’isoler des cellules de tissus adultes, et cette étape initiale est cruciale pour un résultat final de haute qualité. Alors que la préparation d’organoïdes en 3D pourrait être considérée comme une technique récente et en développement (car la définition des organoïdes a été inventée par Lancaster¹⁴ et Huch¹⁵ il y a seulement dix ans), la perfusion de collagénase en deux étapes est une ancienne procédure introduite par Seglen dans les années 1970¹⁶. En se concentrant sur les publications les plus récentes dans le domaine, les protocoles de Ng¹⁷ et Shen¹⁸ pourraient être considérés comme l’étalon-or pour effectuer la procédure chez le rat, tandis que ceux de Cabral¹⁹ et Charni-Natan²⁰ pour la souris. Il n’est pas rare que les chercheurs se concentrent sur le choix de la meilleure matrice extracellulaire (MEC) et des meilleurs facteurs de croissance pour développer des organoïdes 3D, mais se heurtent à des échecs tels qu’une intervention chirurgicale inappropriée, une faible viabilité et un faible rendement des hépatocytes ou des niveaux élevés de contamination bactérienne. Ces problèmes allongent les expériences en aval et augmentent le nombre d’animaux nécessaires pour les expériences suivantes. À l’inverse, si les procédures chirurgicales et d’isolement sont bien mises en place, le nombre élevé d’hépatocytes viables obtenus permet de préparer un grand nombre d’organoïdes, limitant ainsi l’utilisation d’animaux. Le présent protocole aborde principalement ces problématiques à l’aide de solutions commerciales et en optimisant une canulation précise de la veine porte qui assure des étapes de perfusion et de digestion optimales avec le foie in situ.

Afin d’améliorer la qualité, la reproductibilité et la traduisibilité de nos recherches sur les animaux, nous avons soigneusement examiné les directives PREPARE : Planning Research and Experimental Procedures on Animals : Recommendations for Excellence²¹. Ces lignes directrices visent à augmenter les chances de succès grâce à la planification et représentent une étape importante dans la mise en œuvre des 3R de Russel et Burch (remplacement, réduction et raffinement). Les lignes directrices PREPARE couvrent 15 thèmes principaux qui doivent être abordés en fonction de chaque projet de recherche individuel. Nous décrirons les sujets sur lesquels nous nous sommes concentrés lors de la planification et de la préparation du projet.

Le présent travail vise à décrire, dans un protocole exhaustif, détaillé et conséquent, les étapes cruciales de la chirurgie dans le modèle rat pour permettre aux chercheurs d’accélérer et d’optimiser le travail en aval. Lorsque nous avons abordé ces protocoles au début, nous avons rencontré des problèmes de contamination bactérienne, de faible efficacité de digestion hépatique, de faible rendement en hépatocytes primaires et de faible viabilité des hépatocytes qui peuvent facilement affecter le succès de la technique. Montrant comment aborder et résoudre les caractéristiques critiques, ce protocole a optimisé la procédure d’isolement des hépatocytes primaires de rat. La perfusion hépatique de rat et l’isolement primaire ultérieur des hépatocytes adultes sont les principales étapes préliminaires pour différentes applications. En particulier, ce protocole est adapté à toutes les procédures nécessitant un bon rendement en hépatocytes adultes de haute qualité et de haute viabilité. Les résultats du protocole sont appropriés pour établir des modèles in vitro pour étudier la physiologie et la pathologie du foie.

Protocole

Toutes les procédures et l’hébergement des animaux ont été effectués conformément aux directives de la loi italienne et de la directive de la Communauté européenne. Le protocole expérimental a été approuvé par le Comité local de protection des animaux et par le ministère italien de la Santé (permis n° 321/2022-PR) conformément à l’article 31 du décret 26/2014.

1. Préparation à la procédure animale

REMARQUE : Veuillez vous référer au tableau 1 pour la composition du support et du tampon et au tableau des matériaux pour les détails commerciaux.

1. Réchauffez le bain-marie à 42 °C, puis placez le tampon de perfusion et 1x PBS dans le bain-marie pendant environ 20 min.
   REMARQUE : En raison de la sensibilité aux enzymes, le tampon de digestion n’est réchauffé que lorsque la procédure de perfusion a été lancée avec succès. Pendant la procédure de perfusion, maintenez les solutions dans le bain-marie.
2. Placez le support complet de William et PBS + 3% P/S sur la glace.
3. Préparez la pompe péristaltique et connectez le tube à la bouteille en verre et au piège à bulles, tous deux remplis d’un tampon de perfusion.
4. Lors de l’amorçage de la pompe, remplissez le tube avec un tampon de perfusion chaud afin d’évacuer l’air et de laver l’éthanol résiduel (faible vitesse de la pompe). Cette étape est également importante pour vérifier le bon fonctionnement de la pompe et une éventuelle fuite du tube.

2. Préparation à l’isolement des hépatocytes

1. Pendant la procédure sur l’animal, exposez les instruments suivants à la lumière UV : boîte de Pétri 100 mm, passoire cellulaire 100 μm, grattoir taille M, grande pince à épiler, bécher pour la glace, plateau pour la glace.

3. Procédure initiale sur l’animal et anesthésie

1. Anesthésier le rat adulte (250-350 g de poids corporel ; 10-12 semaines) par injection intrapéritonéale d’un mélange d’anesthésiques (concentration finale pour la xylazine : 22,5 mg/kg ; pour la kétamine : 112,5 mg/kg ; volume final approximatif : 0,8-1,0 mL).
2. Surveillez la profondeur de l’anesthésie en pinçant les orteils jusqu’à ce que le rat ne réponde plus aux stimuli nocifs. Cela prend généralement 5 min. La dose d’anesthésique assure une anesthésie chirurgicale profonde qui minimise le risque de souffrance ou de détresse pendant la procédure
   REMARQUE : L’exsanguination est la méthode secondaire d’euthanasie chez le rat utilisée dans cette expérience, et elle permet de s’assurer que l’animal a été euthanasié efficacement.
3. Rasez l’abdomen et nettoyez-le avec de l’éthanol à 70 % pour réduire la contamination bactérienne pendant la chirurgie.
   REMARQUE : Il s’agit d’une chirurgie de non-survie, donc l’asepsie complète n’est pas maintenue.
4. Placez le rat au milieu du plateau de dissection et fixez les membres à l’aide d’aiguilles.
5. Faites une incision en forme de U à travers la peau et le muscle du centre du bas-ventre à la cage thoracique, clampez la peau et pliez-la vers la tête, exposant les intestins.
6. Déplacez délicatement l’intestin vers le côté gauche de l’animal, hors de la cavité abdominale, et exposez la veine porte hépatique et la veine cave.
7. À l’aide d’une pince, passez un fil de coton sous la veine porte et préparez 2 nœuds, à 1 cm l’un de l’autre, qui entourent la veine elle-même.
   REMARQUE : Un fil noir est plus facile à visualiser.
8. Injecter 100 à 150 UI d’héparine dissoute dans 1x PBS (volume total 300 μL) dans la veine cave pour prévenir la coagulation sanguine.

4. Canulation et perfusion hépatique

1. Allumez la pompe à basse vitesse (débit inférieur à 1 ml/min).
2. Insérez l’angiocath 18 G dans la veine porte au niveau du fil à un angle plat par rapport à la veine.
3. Retirez manuellement l’aiguille interne pour laisser la canule dans la veine. Le sang coulera à l’intérieur, remplissant le bouchon et évitant les bulles d’air piégées à l’étape suivante.
4. Pendant que le tampon de perfusion s’écoule dans la tubulure, connectez la canule en appuyant sur le bouton C à l’extrémité de sortie à l’aide d’un connecteur Luer lock.
5. À ce stade, faites les nœuds, un autour du cathéter à l’intérieur de la veine et un autour du cathéter, avant d’entrer dans la veine pour stabiliser le tube dans la bonne position.
6. Coupez la veine cave pour laisser sortir le sang. Assurez-vous que le foie commence à gonfler et à blanchir rapidement (secondes) en 2-3 s. Cela confirme que le tampon de perfusion circule correctement dans le foie.
   REMARQUE : Si certains lobes restent rouges, l’angiocathéter est placé trop profondément. S’il n’y a que des taches rouges, tapoter légèrement sur le foie peut aider à la perfusion dans les points spécifiques. Versez un peu de PBS sur l’abdomen ouvert pour aider à déplacer le sang et vérifier les fuites.
7. Augmentez lentement le débit de la pompe à 10 mL/min et maintenez-le pendant au moins 10 minutes pour permettre le nettoyage du foie du sang.
8. Pendant la perfusion, appliquez une pression sur la veine cave avec un coton-tige pendant 10 secondes d’intervalle : Assurez-vous que le foie gonfle lors du clampage et se détend lors de la relâchement. Répétez la pression périodiquement (5 à 10 fois) et vérifiez l’enflure et la relaxation du foie.
   REMARQUE : Cette étape sert de point de contrôle crucial pour valider visiblement la perfusion. Il a été essentiel pour assurer une vitalité hépatocytaire élevée et maximiser le rendement final. En vérifiant activement ce processus, le tampon peut atteindre efficacement toutes les parties du système vasculaire hépatique, ce que le nettoyage passif du sang seul ne permettrait pas de réaliser.

5. Digestion du foie

1. Après la perfusion, passez au tampon de digestion préchauffé sans interrompre le débit et en évitant les bulles d’air dans la tubulure.
   REMARQUE : Réduire temporairement le débit peut aider à effectuer ce passage. Le tampon de digestion comprend du rouge de phénol, ce qui facilite la visualisation du passage du tampon de perfusion au tampon de digestion.
2. Augmentez la vitesse de la pompe à 20 ml/min et appuyez périodiquement avec l’écouvillon pour détecter l’enflure et la relaxation du foie.
3. Après cette étape (d’une durée d’environ 15 minutes), assurez-vous que le foie devient de plus en plus pâteux. À ce stade, l’aiguille peut être retirée et la pompe s’arrête.
4. Comme la capsule hépatique est fragile après la digestion, disséquez doucement et soigneusement le foie : saisissez le tissu conjonctif central entre les lobes à l’aide d’une pince. Coupez toutes les connexions avec les autres organes et soulevez le foie.
5. Lavez le foie en l’immergeant dans la solution pré-réfrigérée PBS + 3% P/S pendant quelques secondes. Ensuite, placez-le dans le tube complet contenant du milieu William’s pré-refroidi.
   REMARQUE : L’exsanguination et la mort assurent la perfusion via la veine cave. La confirmation de la mort de l’animal provient du pneumothorax induit au moment où le foie est explanté, et le diaphragme est entièrement disséqué, et après inspection, la respiration et le rythme cardiaque ne sont plus fonctionnels.

6. Purification des hépatocytes

1. Sous le capot biologique, transvaser le foie dans la boîte de Pétri à 100 mm avec les 15 mL de milieu complet William froid sur un plateau rempli de glace.
2. Appuyez vigoureusement sur l’organe avec le grattoir pour libérer les cellules dans le milieu.
   REMARQUE : Si la phase de digestion est correctement exécutée, la libération des cellules devrait être facile et ne pas nécessiter beaucoup de pression sur le foie. Ne coupez pas le foie en morceaux ; Laissez-le intact. Garder le foie immergé dans le milieu améliore la libération cellulaire.
3. Prélevez les cellules contenant du milieu et filtrez-les avec le filtre de 100 μm tout en les transférant dans un tube conique stérile. La filtration permet l’élimination des tissus conjonctifs et des fragments de tissus non digérés.
4. Versez environ 15 ml de milieu complet William froid sur le foie écrasé dans la boîte de Pétri pour aider à libérer plus de cellules. Répétez les étapes 6.2 et 6.3.
5. Répétez le point 6.4 au moins une fois, jusqu’à ce que toutes les cellules soient libérées. Si nécessaire, divisez le fluide en tubes plus coniques et utilisez plusieurs filtres de 100 μm.
   REMARQUE : Une fois les hépatocytes libérés et avant le filtrage, le milieu doit sembler opaque en raison de la présence des hépatocytes. Le foie restant doit avoir l’air fibreux et sera jeté.
6. Centrifuger le milieu filtré contenant des cellules hépatiques à 50 x g pendant 3 min à 4 °C avec un frein à basse vitesse.
   REMARQUE : Les hépatocytes sont plus denses que les autres cellules du foie. En raison de la faible force de centrifugation, seuls les hépatocytes seront dans la pastille, tandis que les autres cellules resteront dans le surnageant.
7. Jetez le surnageant sans déranger la pastille cellulaire. Ajoutez délicatement environ 40 ml de milieu complet William’s glacé dans le tube et pipetez lentement de haut en bas 2 à 3 fois pour remettre la pastille en suspension.
   REMARQUE : La pastille de cellule doit être remise en suspension avec précaution afin d’éviter d’endommager les cellules.
8. Centrifuger à 50 x g pendant 3 min à 4 °C.
   REMARQUE : Pour les premiers essais, comptez les cellules viables avec un dosage au bleu de trypan de 1:10 après la deuxième centrifugation avant de passer aux étapes suivantes. Cela peut éviter de perdre du temps et du temps si toutes les cellules sont mortes.
9. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille de cellule dans 25 mL de milieu complet glacé de William.
10. Ajouter 25 ml de solution à gradient de densité à 90 % dans le tube et mélanger délicatement.
    REMARQUE : Une solution à gradient de densité sépare les hépatocytes viables des hépatocytes morts et des débris cellulaires en fonction de leur densité.
11. Centrifugeuse à 200 x g pendant 10 min à 4 °C. Une pastille visible doit être obtenue au fond du tube, correspondant aux hépatocytes viables, et une couche claire au sommet du gradient composée d’hépatocytes morts.
    REMARQUE : S’il n’y a pas de pastille du tout, essayez de mélanger à nouveau la solution en tourbillonnant et répétez la centrifugation.
12. Aspirez la couche de cellules mortes par le haut du gradient et laissez 1 à 2 ml du milieu avec la pastille.
13. Remettre la pastille en suspension dans 30 à 40 mL de milieu complet de William.
    REMARQUE : Pour toute la procédure, utilisez uniquement des pipettes sérologiques de 25 ml. Des pipettes de plus petit calibre peuvent réduire la viabilité des hépatocytes. Toutes les étapes doivent être effectuées sur de la glace pour maintenir +4°C.
14. Centrifuger à 200 x g pendant 10 min à 4°C, puis aspirer le surnageant.

7. Culture d’hépatocytes et collecte d’ARN

1. Ajoutez une quantité appropriée de milieu pour le comptage des cellules. Compter la viabilité cellulaire avec du bleu de trypan 1:10.
2. Culture d’hépatocytes 2D
   1. Cellules en plaque à la concentration de 500 000 cellules/puits d’une boîte à 6 puits sur une plaque cellulaire recouverte de collagène avec un milieu complet de William préchauffé.
   2. Placez la culture cellulaire dans un incubateur humidifié avec 95 % d’air, 5 % de CO₂ à 37 °C.
   3. Après 4 h, remplacez le milieu par le nouveau milieu complet William’s préchauffé.
   4. Conservez les cellules dans l’incubateur. Changez de support tous les jours.
   5. Prélever les hépatocytes primaires dans un réactif pour l’extraction de l’ARN avant le placage (jour 0) et aux jours 1 à 3 de la culture.
   6. Extraire l’ARN selon le protocole du fabricant et le transcrire en ADNc pour l’évaluation des gènes marqueurs hépatiques par RT-qPCR. La liste des abécédaires est présentée dans le tableau 2.
3. Pour la culture d’hépatocytes à long terme en 3D :
   1. Remettre les cellules en suspension dans la matrice pure froide à la concentration de 1 000 à 10 000 cellules dans 20 μL.
      REMARQUE : Essayez d’éviter de faire des bulles matricielles.
   2. À l’aide d’embouts de pipette pré-refroidis, la plaque contient des gouttelettes de cellules contenant la matrice dans une plaque de culture cellulaire préchauffée.
   3. Retournez la plaque et laissez-la dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 20-30 min.
   4. Montez le son et ajoutez le milieu hépatocytaire à long terme 3D préchauffé et le milieu de culture spécifique selon le travail de Peng²². Conservez les cellules dans l’incubateur.
   5. Changez le milieu hépatocytaire 3D à long terme tous les 2-3 jours.
   6. Au moins après 14 jours de culture, les Hep-Org sont séparés de la matrice et les Hep-Org viables sont évalués par le bleu de Trypan et le test de prolifération EdU et passés selon les travaux de Peng.

Résultats

À la fin des procédures de mise en place (étape 6.13), nous avons obtenu un rendement cellulaire allant jusqu’à 1 x 10⁸ cellules par isolement à partir du foie d’environ 300 g d’un rat. La viabilité cellulaire entre 78 % et 97 % a été établie par comptage au bleu de trypan.

Comme déjà décrit dans des études précédentes ^1,18,19, les hép...

Discussion

Les organoïdes 3D sont une frontière pour la médecine personnalisée et permettent une culture hépatocytaire à long terme. La qualité de cette technique innovante nécessite un bon rendement en hépatocytes primaires viables et une perfusion hépatique et une isolation des hépatocytes bien réalisées. Cette ancienne procédure est encore largement utilisée ; Cependant, il comprend différentes étapes qui peuvent être difficiles. En abordant la procédure, nous avons rencontré...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
A83-01- ALK5 Inhibitor IV	Twin Helix	T3031
B27	Thermofisher Scientific	0080085SA
CFX Connect Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad
CHIR99021	Twin Helix	T2310
Click EdU Alexa 488 imaging kit	Thermofisher Scientific	C10499
Collagen, Type I, solution from rat tail	Merck	C3867-1VL
Dexamethasone	Merck	D4902
EGF	Merck	E9644
Fetal bovine serum (FBS)	Euroclone	ECS0180L
GELTREX LDEV FREE RGF BME	Thermofisher Scientific	A1413202
Heparin Sodium 25000 IU/5 ml	B. Braun Melsungen AG	B01AB01
HGF	Peprotech	100-39H
Insulin-Transferrin-Selenium solution 100x	Thermofisher Scientific	41400045
L-Glutamine solution	Euroclone	ECB3000D
Liver Digest Medium	Thermofisher Scientific	17703-034
Liver Perfusion Medium	Thermofisher Scientific	17701038
N2 supplement	Thermofisher Scientific	17502048
N-acetylcysteine	Merck	A9165
Nicotinamide	Merck	N-0636
Non-Essential Amino Acids	Merck	M7145
Normocin	Aurogene	ant-nr-1
PBS buffer 1X	PanReac AppliChem	A0964,9050
Penicillin-streptomycin solution 100x	Euroclone	ECB3001D
Percoll	Santa Cruz	sc-296039A
Peristaltic pump	Ismatec™	MS-4/12 Reglo Digital Pump
TNFa	Peprotech	300-01A
TRI Reagent	Merck	T9424
Tubing	Ismatec™	ID.2,79mm
Williams' E Medium, no glutamine	Thermofisher Scientific	31415029
Y27632	Twin Helix	T1725