Перфузия печени крыс и выделение первичных гепатоцитов: старая процедура, имеющая решающее значение для создания передовых 3D-органоидов

Резюме

В этом протоколе представлен оптимизированный двухэтапный метод перфузии печени коллагеназой на модели крысы и показано использование выделенных гепатоцитов для долгосрочного культивирования 3D-органоидов in vitro .

Аннотация

Первичные гепатоциты являются широко используемым инструментом для исследований печени in vitro . Тем не менее, поддержание этих клеток всегда было проблемой из-за быстрой потери морфологии, жизнеспособности и функциональности в культуре. Недавний подход к долгосрочному культивированию заключается в создании трехмерных (3D) органоидов, инструмента in vitro , который может восстанавливать ткани в чашке, основываясь на удивительной способности печени к саморегенерации. Опубликованные протоколы были разработаны для получения долговременных функциональных 3D-органоидов из первичных взрослых гепатоцитов (Hep-Orgs). Передовой инструмент для 3D-органоидов требует возможности выделять клетки из тканей взрослого человека, и этот начальный шаг имеет решающее значение для получения высококачественного конечного результата. Двухступенчатая перфузия коллагеназы, введенная в 1970-х годах, до сих пор является действующей процедурой для получения одиночных гепатоцитов. Цель настоящей статьи – описать все важнейшие этапы хирургической процедуры, тем самым оптимизировав процедуру выделения первичных гепатоцитов на модели крысы. Более того, особое внимание уделяется рекомендациям PREPARE для повышения вероятности успешных процедур и обеспечения высококачественных результатов. Подробный протокол позволяет исследователям ускорить и оптимизировать последующую работу по созданию трехмерных органоидов из первичных гепатоцитов взрослых крыс. По сравнению с двумерными гепатоцитами, геп-орги все еще были жизнеспособны и находились в активной пролиферации на 15-й день, демонстрируя долгосрочный потенциал.

Введение

Первичные гепатоциты являются важным и широко используемым инструментом для исследований печени in vitro . Тем не менее, их расширение и поддержание исторически были сложными, так как они теряют морфологию и функциональность после нескольких дней в культуре¹. 2D культура является лимитирующим условием, в частности, для гепатоцитов, имеющих многоугольную форму и поляризованную структуру с дифференцированными апикальными и базолатеральными мембранами. Фактически, адгезия гепатоцитов к пластине нарушает их нормальную активность, поскольку приводит к образованию плоского цитоскелета с ограниченным взаимодействием между клетками и между клетками и внеклеточным матриксом (ВКМ), снижая поляризацию и вовлеченные сигнальные пути².

Чтобы обойти ограничения этого метода, Данн и его коллеги³ сначала использовали двойной слой коллагена. Этот метод культивирования, известный как «метод сэндвич-культуры», основан на посеве первичных гепатоцитов между двумя слоями матрицы. Этот метод имеет много преимуществ, включая долгосрочное культивирование, поддержание полигональной морфологии и транскрипционную активность, сравнимую с активностью свежевыделенных гепатоцитов4^. Аналогичный метод, основанный на том же принципе, где подложка состоит из матригеля, а покрытие коллагена, свидетельствует о наличии хорошо установленной каналикулярной сети⁵.

Несмотря на надежность метода сэндвич-культуры для роста гепатоцитов, настоящая работа направлена на создание 3D-органоидной культуры, инструмента in vitro, используемого для рекапитуляции тканей в чашке и формирования потенциального моста к персонализированной медицине, позволяющего генерировать биологические идеи, специфичные для конкретного заболевания, идентифицировать молекулярные мишени, тестировать лекарства, создавать биобанки и открывать новые горизонты для инновационных технологий, таких как орган-на-чипе. Первичные гепатоциты были встроены в полусферические матричные капли, известные как «купола», чтобы обеспечить устойчивый рост органоидов внутри куполов и гарантировать поток растворимых факторов, включая фактор роста гепатоцитов (HGF) и эпидермальный фактор роста (EGF), из питательной среды. Эти факторы роста непосредственно активируют сигнальные пути для обеспечения выживания гепатоцитов⁷. Органоиды печени обычно получают из стволовых/прогениторных клеток, выделенных из эмбриональных стадий или взрослых крыс, мышей, печени человека (а также собак и кошек)⁸. Даже если 3D-конформация улучшает дифференцировку стволовых клеток до взрослых гепатоцитов, этому инструменту все еще не хватает зрелости исходной первичной ткани⁹. Чтобы преодолеть эту проблему, в 2018 году две разные группы ^9,10 одновременно опубликовали протокол получения долговременной культуры 3D органоидов печени, начиная с первичных гепатоцитов взрослых мышей (называемых Hep-Orgs). Их протоколы резюмируют реакцию пролиферативного повреждения регенерации печени, выращивание гепатоцитов с высоким уровнем воспалительных цитокинов, как это происходит после частичной гепатэктомии. Действительно, вышеупомянутые исследования показывают, что гепатоциты могут переключаться в протоковое состояние после повреждения¹² или когда пролиферация холангиоцитов^{подавляется13}. Их бипотентная способность обеспечивает клеточную пластичность, что важно для сложных структур, таких как органоиды. Таким образом, эти протоколы преодолевают проблему невозможности расширения первичных гепатоцитов in vitro.

Передовой инструмент для 3D-органоидов требует возможности выделять клетки из тканей взрослого человека, и этот начальный шаг имеет решающее значение для получения высококачественного конечного результата. В то время как 3D-органоидный препарат можно считать недавним и развивающимся методом (потому что определение органоида было придумано Ланкастером-14 и Хуч-15 всего десять лет назад), двухступенчатая коллагеназная перфузия является старой процедурой, введенной Сегленом в 1970-х годах^. Сосредоточившись на самых последних публикациях в этой области, протоколы Ng¹⁷ и Shen¹⁸ можно считать золотым стандартом для выполнения процедуры на крысах, в то время как протоколы Кабрал¹⁹ и Чарни-Натан²⁰ для мышей. Нет ничего необычного в том, что исследователи сосредотачиваются на выборе лучшего внеклеточного матрикса (ВКМ) и факторов роста для разработки трехмерных органоидов, но при этом сталкиваются с такими неудачами, как неправильная хирургическая процедура, низкая жизнеспособность и выход гепатоцитов или высокий уровень бактериального загрязнения. Эти проблемы удлиняют последующие эксперименты и увеличивают количество животных, необходимых для последующих экспериментов. И наоборот, если хирургические и изоляционные процедуры хорошо организованы, большое количество полученных жизнеспособных гепатоцитов позволяет получить огромное количество органоидов, тем самым ограничивая использование животных. Настоящий протокол в основном решает эти проблемы с помощью коммерческих решений и оптимизации точной канюляции воротной вены, которая обеспечивает оптимальные этапы перфузии и пищеварения с печенью in situ.

Чтобы повысить качество, воспроизводимость и переводимость наших исследований на животных, мы тщательно изучили рекомендации PREPARE: Планирование исследований и экспериментальных процедур на животных: Рекомендации по совершенствованию²¹. Эти руководящие принципы отчетности направлены на повышение вероятности успеха за счет планирования и представляют собой важный шаг в реализации 3R Рассела и Берча (замена, сокращение и уточнение). Руководящие принципы PREPARE охватывают 15 основных тем, которые должны быть рассмотрены в соответствии с каждым отдельным исследовательским проектом. Мы опишем темы, на которые мы ориентировались во время планирования и подготовки проекта.

Цель настоящей работы состоит в том, чтобы описать в исчерпывающем, подробном и последовательном протоколе важнейшие этапы операции на модели крысы, чтобы позволить исследователям ускорить и оптимизировать последующую работу. Когда мы впервые обратились к этим протоколам, мы столкнулись с проблемами бактериального загрязнения, низкой эффективности переваривания печени, низкого выхода первичных гепатоцитов и низкой жизнеспособности гепатоцитов, которые могут легко повлиять на успех метода. Демонстрируя, как решать критические проблемы, этот протокол оптимизировал процедуру первичной изоляции гепатоцитов крыс. Перфузия печени крысы и последующая первичная выделение взрослых гепатоцитов являются основными подготовительными этапами для различных применений. В частности, этот протокол подходит для всех процедур, требующих хорошего выхода высококачественных и высокожизнеспособных взрослых гепатоцитов. Результаты протокола пригодны для создания моделей in vitro для изучения физиологии и патологии печени.

протокол

Все процедуры и содержание животных проводились в соответствии с руководящими принципами итальянского законодательства и директивой Европейского Сообщества. Протокол эксперимента был одобрен местным Комитетом по уходу за животными и Министерством здравоохранения Италии (разрешение No 321/2022-PR) в соответствии со ст. 31 постановления 26/2014.

1. Подготовка к процедуре с животными

ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, обратитесь к Таблице 1 для получения информации о составе среды и буфера и к Таблице материалов для получения коммерческих деталей.

1. Нагрейте водяную баню до 42 °C, а затем поместите перфузионный буфер и 1x PBS в водяную баню примерно на 20 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за чувствительности ферментов буфер для пищеварения нагревается только после успешного начала процедуры перфузии. Во время процедуры перфузии выдерживайте растворы на водяной бане.
2. Поместите на лед William's complete medium и PBS + 3% P/S.
3. Подготовьте перистальтический насос и подсоедините трубку к стеклянной бутылке и пузырьковой ловушке, заполненным перфузионным буфером.
4. Во время заливки насоса заполните трубку теплым буфером для перфузии, чтобы удалить воздух и смыть остатки этанола (низкая скорость насоса). На этом этапе также важно проверить правильность работы насоса и возможную утечку трубки.

2. Подготовка к выделению гепатоцитов

1. Во время процедуры на животных подвергайте воздействию ультрафиолетового света следующие инструменты: чашка Петри 100 мм, ячеистое ситечко 100 мкм, скребок размера М, большой пинцет, стакан для льда, поднос для льда.

3. Первичная процедура на животных и анестезия

1. Обезболивание взрослой крысы (250-350 г массы тела; возраст 10-12 недель) путем внутрибрюшинного введения смеси анестетиков (конечная концентрация для ксилазина: 22,5 мг/кг; для кетамина: 112,5 мг/кг; приблизительный конечный объем: 0,8-1,0 мл).
2. Контролируйте глубину анестезии, щипая пальцы ног до тех пор, пока крыса не перестанет реагировать на вредные раздражители. Обычно это занимает 5 минут. Анестетическая доза обеспечивает глубокую хирургическую анестезию, которая сводит к минимуму риск страданий или стресса во время процедуры
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обескровливание является вторичным методом эвтаназии крыс, используемым в этом эксперименте, и он гарантирует, что животное было эффективно усыплено.
3. Побрейте брюшную полость и очистите ее с помощью 70% этанола, чтобы уменьшить бактериальное загрязнение во время операции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это операция, не требующая выживания, поэтому полная асептика не поддерживается.
4. Поместите крысу в середину лотка для вскрытия и закрепите конечности с помощью игл.
5. Сделайте U-образный разрез через кожу и мышцу от центра нижней части живота к грудной клетке, зажмите кожу, и сложите ее до головы, обнажив кишечник.
6. Осторожно переместите кишечник в левую сторону животного, из брюшной полости, и обнажите воротную вену печени и полую вену.
7. С помощью плоскогубцев пропустите хлопчатобумажную нить под воротную жилу и подготовьте 2 узла, на расстоянии 1 см друг от друга, которые окружают саму жилу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Черную нить легче визуализировать.
8. Введите 100-150 МЕ гепарина, растворенного в 1x PBS (общий объем 300 мкл) в полую вену для предотвращения свертывания крови.

4. Канюляция и перфузия печени

1. Включите насос на низких оборотах (расход менее 1 мл/мин).
2. Введите ангиокатет 18 G в воротную вену на уровне нити под плоским углом относительно вены.
3. Вручную удалите внутреннюю иглу, чтобы оставить канюлю в вене. Кровь будет течь внутри него, заполняя пробку и предотвращая попадание пузырьков воздуха на следующем этапе.
4. Пока буфер перфузии течет по трубке, подсоедините канюлю, нажав кнопку C на выходном конце с помощью разъема с замком Люэра.
5. На этом этапе завяжите узлы, один вокруг катетера внутри вены, а другой вокруг катетера, прежде чем войти в вену, чтобы стабилизировать трубку в правильном положении.
6. Разрежьте полую вену, чтобы кровь вышла. Следите за тем, чтобы печень начала быстро (за секунды) набухать и отбеливаться через 2-3 с. Это подтверждает, что перфузионный буфер правильно протекает через печень.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если некоторые доли остаются красными, ангиокатетер устанавливается слишком глубоко. Если есть только красные пятна, легкое постукивание по печени может помочь перфузии в определенных точках. Налейте немного 1x PBS на открытую брюшную полость, чтобы помочь удалить кровь и проверить наличие подтеканий.
7. Медленно увеличьте расход насоса до 10 мл/мин и поддерживайте его не менее 10 минут, чтобы обеспечить очищение печени от крови.
8. Во время перфузии надавливайте на полую вену ватной палочкой с интервалом в 10 с: Убедитесь, что печень набухает при пережатии и расслабляется при освобождении. Периодически повторяйте надавливание (5-10 раз) и проверяйте наличие отека печени и расслабления.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап служит важной контрольной точкой для видимой валидации перфузии. Это сыграло важную роль в обеспечении высокой жизнеспособности гепатоцитов и максимизации конечного выхода. При активной проверке этого процесса буфер может эффективно достигать всех частей сосудистой сети печени, чего не удалось бы достичь только с помощью пассивного очищения крови.

5. Пищеварение печени

1. После перфузии переключитесь на предварительно подогретый буфер для разложения, не прерывая поток и не допуская образования пузырьков воздуха в трубке.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Временное уменьшение потока может помочь выполнению этого отрывка. В состав буфера для разложения входит феноловый красный, что облегчает визуализацию переключения с буфера для перфузии на буфер для разложения.
2. Увеличьте скорость помпы до 20 мл/мин и периодически надавливайте тампоном для отека печени и расслабления.
3. После этого шага (длящийся около 15 минут) следите за тем, чтобы печень становилась все более мягкой. В этот момент иглу можно снять, а насос остановиться.
4. Так как капсула печени после пищеварения хрупкая, аккуратно и осторожно рассеките печень: захватите щипцами центральную соединительную ткань между долями. Перережьте все соединения с другими органами и приподнимите печень.
5. Промойте печень, погрузив ее на несколько секунд в предварительно охлажденный раствор PBS + 3% P/S. Затем поместите его в предварительно охлажденную пробирку William's Complete, содержащую среду.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обескровливание и смерть обеспечивают перфузию через полую вену. Подтверждением смерти животного является пневмоторакс, вызванный в момент эксплантации печени и полного рассечения диафрагмы, и при осмотре дыхание и сердцебиение больше не функционируют.

6. Очищение гепатоцитов

1. Под биологический колпак переложите печень в чашку Петри на 100 мм с 15 мл холодной полной среды Вильямса над лотком, полным льда.
2. Энергично надавите на орган скребком, чтобы освободить клетки в среде.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если фаза пищеварения выполнена правильно, высвобождение клеток должно быть легким и не требовать большого давления на печень. Не режьте печень на кусочки; Оставьте его в целости и сохранности. Погружение печени в среду улучшает высвобождение клеток.
3. Соберите клетки, содержащие среду, и отфильтруйте их с помощью фильтра 100 мкм, переложив в стерильную коническую пробирку. Фильтрация позволяет удалить соединительные ткани и непереваренные фрагменты тканей.
4. Вылейте около 15 мл холодной среды William's Complete на раздавленную печень в чашке Петри, чтобы помочь высвободить больше клеток. Повторите шаги 6.2 и 6.3.
5. Повторите пункт 6.4 по крайней мере один раз, пока не высвободятся все клетки. При необходимости разделите среду на более конические пробирки и используйте несколько фильтров по 100 мкм.
   Примечание: После высвобождения гепатоцитов и до фильтрации среда должна выглядеть непрозрачной из-за присутствия гепатоцитов. Оставшаяся печень должна выглядеть волокнистой и будет отброшена.
6. Отфильтрованную среду, содержащую клетки печени, центрифугируют при давлении 50 x g в течение 3 мин при 4 °C с помощью тормоза на низких оборотах.
   Примечание: Гепатоциты плотнее, чем другие клетки печени. Из-за низкой силы центрифугирования в грануле будут находиться только гепатоциты, в то время как другие клетки останутся в надосадочной жидкости.
7. Выбросьте надосадочную жидкость, не нарушая клеточную гранулу. Осторожно добавьте в пробирку около 40 мл ледяной среды William's Complete и медленно пипетируйте вверх и вниз 2–3 раза, чтобы ресуспендировать клеточную гранулу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Гранулу клетки необходимо осторожно ресуспендировать, чтобы не повредить клетки.
8. Центрифугируйте при 50 x g в течение 3 мин при 4 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для первых попыток подсчитайте жизнеспособные клетки с помощью анализа трипанового синего в соотношении 1:10 после второго центрифугирования, прежде чем переходить к следующим этапам. Это позволяет избежать потери среды и времени, если все клетки мертвы.
9. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 25 мл ледяной полной среды William's.
10. Добавьте в пробирку 25 мл 90% раствора градиента плотности и аккуратно перемешайте.
    Примечание: Раствор градиента плотности отделяет жизнеспособные гепатоциты от мертвых гепатоцитов и клеточного мусора в зависимости от их плотности.
11. Центрифугируйте при 200 x g в течение 10 минут при 4 °C. На дне пробирки должна быть получена видимая гранула, соответствующая жизнеспособным гепатоцитам, и прозрачный слой сверху градиента, состоящий из мертвых гепатоцитов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если гранулы нет вообще, попробуйте снова перемешать раствор, взболтав, и повторите центрифугирование.
12. Отсадите слой мертвых клеток от верхней части градиента и оставьте 1-2 мл среды вместе с гранулой.
13. Суспендируйте гранулу в 30-40 мл полной среды William's.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для всей процедуры используйте только 25 мл серологических пипеток. Пипетки меньшего диаметра могут снизить жизнеспособность гепатоцитов. Все этапы следует проводить на льду для поддержания +4°C.
14. Центрифугируйте при 200 x g в течение 10 минут при 4°C, затем отаскайте надосадочную жидкость.

7. Культура гепатоцитов и сбор РНК

1. Добавьте соответствующее количество среды для подсчета клеток. Подсчитайте жизнеспособность клеток с помощью трипанового синего 1:10.
2. 2D посев гепатоцитов
   1. Пластинчатые клетки в концентрации 500 000 клеток/лунку 6-луночной чашки на клеточной пластине, покрытой коллагеном, с предварительно нагретой полной средой Уильяма.
   2. Поместите клеточную культуру во увлажненный инкубатор с 95% воздуха, 5%_CO2 при 37 °C.
   3. Через 4 ч смените среду на новую предварительно подогретую среду William's complete.
   4. Держите клетки в инкубаторе. Меняйте среду ежедневно.
   5. Соберите первичные гепатоциты в реагент для экстракции РНК перед осаждением (день 0) и на 1-3 день посева.
   6. Извлечь РНК в соответствии с протоколом производителя и провести обратную транскрибацию ее в кДНК для оценки генов-маркеров печени методом ОТ-кПЦР. Праймерный список представлен в таблице 2.
3. Для 3D долгосрочного посева гепатоцитов:
   1. Ресуспендировать клетки в холодной чистой матрице в концентрации 1000-10000 клеток в 20 мкл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Старайтесь избегать создания матричных пузырей.
   2. С помощью предварительно охлажденных наконечников для пипеток капли, содержащие матрикс планшета, помещают их в предварительно нагретый планшет для клеточной культуры.
   3. Переверните тарелку вверх дном и оставьте в инкубаторе для клеточных культур на 20-30 минут.
   4. Включите его и добавьте предварительно нагретую 3D среду для долговременного хранения гепатоцитов и специальную культуральную среду в соответствии с работой^{Пэна 22}. Держите клетки в инкубаторе.
   5. Меняйте среду 3D гепатоцитов длительного действия каждые 2-3 дня.
   6. По крайней мере, после 14 дней культивирования Hep-Orgs отделяют от матрицы, а жизнеспособные Hep-Orgs оценивают с помощью анализа Trypan blue и EdU и пропускают в соответствии с работой Пэна.

Результаты

В конце процедур настройки (шаг 6.13) мы получили выход клеток до 1 x 10⁸ клеток на выделение из печени около 300 г крысы. Жизнеспособность клеток в диапазоне от 78% до 97% была установлена с помощью подсчета трипанового синего цвета.

Как уже было описано в п?...

Обсуждение

3D-органоиды являются рубежом для персонализированной медицины и позволяют проводить долгосрочное культивирование гепатоцитов. Качество этой инновационной методики требует хорошего выхода жизнеспособных первичных гепатоцитов и хорошо выполненной перфузии печени...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
A83-01- ALK5 Inhibitor IV	Twin Helix	T3031
B27	Thermofisher Scientific	0080085SA
CFX Connect Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad
CHIR99021	Twin Helix	T2310
Click EdU Alexa 488 imaging kit	Thermofisher Scientific	C10499
Collagen, Type I, solution from rat tail	Merck	C3867-1VL
Dexamethasone	Merck	D4902
EGF	Merck	E9644
Fetal bovine serum (FBS)	Euroclone	ECS0180L
GELTREX LDEV FREE RGF BME	Thermofisher Scientific	A1413202
Heparin Sodium 25000 IU/5 ml	B. Braun Melsungen AG	B01AB01
HGF	Peprotech	100-39H
Insulin-Transferrin-Selenium solution 100x	Thermofisher Scientific	41400045
L-Glutamine solution	Euroclone	ECB3000D
Liver Digest Medium	Thermofisher Scientific	17703-034
Liver Perfusion Medium	Thermofisher Scientific	17701038
N2 supplement	Thermofisher Scientific	17502048
N-acetylcysteine	Merck	A9165
Nicotinamide	Merck	N-0636
Non-Essential Amino Acids	Merck	M7145
Normocin	Aurogene	ant-nr-1
PBS buffer 1X	PanReac AppliChem	A0964,9050
Penicillin-streptomycin solution 100x	Euroclone	ECB3001D
Percoll	Santa Cruz	sc-296039A
Peristaltic pump	Ismatec™	MS-4/12 Reglo Digital Pump
TNFa	Peprotech	300-01A
TRI Reagent	Merck	T9424
Tubing	Ismatec™	ID.2,79mm
Williams' E Medium, no glutamine	Thermofisher Scientific	31415029
Y27632	Twin Helix	T1725