Perfusão hepática de ratos e isolamento primário de hepatócitos: um procedimento antigo crucial para a cultura de organoides 3D de ponta

Resumo

Este protocolo apresenta uma técnica otimizada de perfusão hepática de colagenase em duas etapas em um modelo de rato e mostra o uso de hepatócitos isolados para cultura in vitro de longo prazo de organoides 3D.

Resumo

Os hepatócitos primários são uma ferramenta comumente usada para estudos in vitro relacionados ao fígado. No entanto, a manutenção dessas células sempre foi um desafio devido à rápida perda de morfologia, viabilidade e funcionalidade em cultura. Uma abordagem recente para a cultura de longo prazo é a geração de organoides tridimensionais (3D), uma ferramenta in vitro que pode recapitular tecidos em um prato com base na maravilhosa capacidade do fígado de se regenerar. Os protocolos publicados foram projetados para obter organoides 3D funcionais de longo prazo de hepatócitos adultos primários (Hep-Orgs). A ferramenta de ponta organoide 3D requer a capacidade de isolar células do tecido adulto, e esta etapa inicial é crucial para um resultado final de alta qualidade. A perfusão de colagenase em duas etapas, introduzida na década de 1970, ainda é um procedimento válido para a obtenção de hepatócitos únicos. O presente artigo tem como objetivo descrever todas as etapas cruciais do procedimento cirúrgico, otimizando assim o procedimento de isolamento de hepatócitos primários no modelo de rato. Além disso, é dada especial atenção às directrizes PREPARE para aumentar a probabilidade de procedimentos bem sucedidos e garantir resultados de elevada qualidade. Um protocolo detalhado permite que os pesquisadores acelerem e otimizem o trabalho a jusante para estabelecer organoides 3D a partir de hepatócitos primários de ratos adultos. Em comparação com os hepatócitos 2D, os Hep-Orgs ainda eram viáveis e em proliferação ativa no Dia 15, demonstrando um potencial de longo prazo.

Introdução

Os hepatócitos primários são uma ferramenta importante e amplamente utilizada para estudos in vitro relacionados ao fígado. No entanto, sua expansão e manutenção têm sido historicamente desafiadoras, pois perdem morfologia e funcionalidade após alguns dias na cultura¹. A cultura 2D é uma condição limitante, em particular, para hepatócitos que possuem formato poligonal e estrutura polarizada com membranas apicais e basolaterais diferenciadas. De fato, a adesão dos hepatócitos à placa interfere em sua atividade normal, pois leva a um citoesqueleto plano com interação limitada entre as células e entre as células e a matriz extracelular (MEC), reduzindo a polarização e as vias de sinalização envolvidas².

Para contornar as limitações desse método, Dunn e colegas³ usaram primeiro a dupla camada de colágeno. Este método de cultura, conhecido como "método de cultura sanduíche", baseia-se na semeadura de hepatócitos primários entre as duas camadas da matriz. Este método tem muitas vantagens, incluindo cultura a longo prazo, manutenção da morfologia poligonal e atividades transcricionais comparáveis às dos hepatócitos recém-isolados⁴. Um método semelhante, baseado no mesmo princípio, onde a base é composta de Matrigel enquanto a sobreposição de colágeno, evidenciou a presença de uma rede canalicular bem estabelecida⁵.

Apesar da confiabilidade do método de cultura sanduíche para o crescimento de hepatócitos, o presente trabalho espera estabelecer uma cultura organoide 3D, uma ferramenta in vitro usada para recapitular tecidos em um prato e formar uma ponte potencial para a medicina personalizada, permitindo a geração de insights biológicos específicos de doenças, identificando alvos moleculares, testando drogas, estabelecendo biobancos e abrindo novos horizontes para tecnologias inovadoras como organ-on-chip⁶. Os hepatócitos primários foram incorporados em gotículas de matriz hemisférica conhecidas como "domos" para permitir um crescimento robusto de organoides no interior das cúpulas e garantir o fluxo dos fatores solúveis, incluindo o fator de crescimento de hepatócitos (HGF) e o fator de crescimento epidérmico (EGF), do meio de cultura. Esses fatores de crescimento ativam diretamente as vias de sinalização para garantir a sobrevivência dos hepatócitos⁷. Os organoides hepáticos são geralmente obtidos a partir de células-tronco/progenitoras isoladas de estágios embrionários ou de ratos adultos, camundongos, fígado humano (e também cães e gatos)⁸. Mesmo que a conformação 3D melhore a diferenciação de células-tronco em hepatócitos adultos, essa ferramenta ainda carece da maturidade do tecido primário original⁹. Para superar esse problema, em 2018, dois grupos diferentes ^9,10 publicaram simultaneamente um protocolo para obter uma cultura de longo prazo de organoides hepáticos 3D a partir de hepatócitos primários de camundongos adultos (referidos como Hep-Orgs). Seus protocolos recapitulam a resposta ao dano proliferativo da regeneração hepática, cultivando hepatócitos com alto nível de citocinas inflamatórias, pois ocorre após a hepatectomia parcial. De fato, os estudos acima demonstram que os hepatócitos podem mudar para um estado ductal após a lesão¹² ou quando a proliferação de colangiócitos é suprimida¹³. Sua capacidade bipotente permite a plasticidade celular, o que é importante para estruturas complexas, como organoides. Portanto, esses protocolos superam o problema da incapacidade de expandir os hepatócitos primários in vitro.

A ferramenta de ponta organoide 3D requer a capacidade de isolar células do tecido adulto, e esta etapa inicial é crucial para um resultado final de alta qualidade. Embora a preparação de organoides 3D possa ser considerada uma técnica recente e em desenvolvimento (porque a definição de organoide foi cunhada por Lancaster¹⁴ e Huch¹⁵ há apenas dez anos), a perfusão de colagenase em duas etapas é um procedimento antigo introduzido por Seglen na década de 1970¹⁶. Com foco nas publicações mais recentes da área, os protocolos de Ng¹⁷ e Shen¹⁸ podem ser considerados o padrão-ouro para a realização do procedimento em ratos, enquanto os de Cabral¹⁹ e Charni-Natan²⁰ para camundongos. Não é incomum que os pesquisadores se concentrem na escolha da melhor matriz extracelular (MEC) e fatores de crescimento para desenvolver organoides 3D, mas se deparem com falhas como procedimento cirúrgico inadequado, baixa viabilidade e rendimento dos hepatócitos ou altos níveis de contaminação bacteriana. Esses problemas prolongam os experimentos a jusante e aumentam o número de animais necessários para os experimentos seguintes. Por outro lado, se os procedimentos cirúrgicos e de isolamento forem bem configurados, o elevado número de hepatócitos viáveis obtidos permite o preparo de um grande número de organoides, limitando assim o uso de animais. O presente protocolo aborda principalmente essas questões usando soluções comerciais e otimizando uma canulação precisa da veia porta que garante etapas ideais de perfusão e digestão com o fígado in situ.

A fim de melhorar a qualidade, reprodutibilidade e traduzibilidade de nossa pesquisa com animais, consideramos cuidadosamente as diretrizes PREPARE: Planejamento de Pesquisa e Procedimentos Experimentais em Animais: Recomendações para Excelência²¹. Essas diretrizes de relatórios tentam aumentar a probabilidade de sucesso por meio do planejamento e representam um passo importante na implementação dos 3Rs de Russel e Burch (substituição, redução e refinamento). As diretrizes do PREPARE cobrem 15 tópicos principais que devem ser abordados de acordo com cada projeto de pesquisa individual. Descreveremos os tópicos em que nos concentramos durante o planejamento e preparação do projeto.

O presente trabalho tem como objetivo descrever, em um protocolo exaustivo, detalhado e conseqüente, as etapas cruciais da cirurgia no modelo de rato para permitir que os pesquisadores acelerem e otimizem o trabalho a jusante. Quando abordamos esses protocolos no início, tivemos problemas de contaminação bacteriana, baixa eficiência da digestão do fígado, baixo rendimento primário de hepatócitos e baixa viabilidade de hepatócitos que podem facilmente afetar o sucesso da técnica. Mostrando como abordar e resolver recursos críticos, este protocolo otimizou o procedimento para isolamento primário de hepatócitos de ratos. A perfusão hepática de ratos e o subsequente isolamento primário de hepatócitos adultos são as principais etapas preliminares para diferentes aplicações. Em particular, este protocolo é adequado para todos os procedimentos que requerem um bom rendimento de hepatócitos adultos de alta qualidade e alta viabilidade. Os resultados do protocolo são apropriados para estabelecer modelos in vitro para estudar a fisiologia e patologia hepática.

Protocolo

Todos os procedimentos e alojamento dos animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes da Lei Italiana e da diretiva da Comunidade Europeia. O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Cuidados com os Animais local e pelo Ministério da Saúde italiano (licença n° 321/2022-PR) de acordo com o art.31 do decreto 26/2014.

1. Preparação para o procedimento animal

NOTA: Consulte a Tabela 1 para obter a composição do meio e do buffer e a Tabela de Materiais para obter detalhes comerciais.

1. Aqueça o banho-maria a 42 °C e, em seguida, coloque o tampão de perfusão e 1x PBS no banho-maria por cerca de 20 min.
   NOTA: Devido à sensibilidade enzimática, o tampão de digestão é aquecido somente quando o procedimento de perfusão for iniciado com sucesso. Durante o procedimento de perfusão, mantenha as soluções em banho-maria.
2. Coloque o médio completo de William e PBS + 3% P/S no gelo.
3. Prepare a bomba peristáltica e conecte a tubulação com a garrafa de vidro e a armadilha de bolhas, ambas preenchidas com tampão de perfusão.
4. Enquanto escorva a bomba, encha a tubulação com tampão de perfusão quente para remover o ar e lavar o etanol residual (baixa velocidade da bomba). Esta etapa também é importante para verificar o funcionamento correto da bomba e possível vazamento do tubo.

2. Preparação para isolamento de hepatócitos

1. Durante o procedimento animal, exponha os seguintes instrumentos à luz UV: placa de Petri 100 mm, filtro de células 100 μm, raspador tamanho M, pinças grandes, copo para gelo, bandeja para gelo.

3. Procedimento inicial com animais e anestesia

1. Anestesiar o rato adulto (250-350 g de peso corporal; 10-12 semanas de idade) por injeção intraperitoneal de mistura de anestésicos (concentração final para xilazina: 22,5 mg / kg; para cetamina: 112,5 mg / kg; aprox. volume final: 0,8-1,0 mL).
2. Monitore a profundidade da anestesia beliscando os dedos dos pés até que o rato não responda mais a estímulos nocivos. Geralmente leva 5 min. A dose de anestésico garante uma anestesia cirúrgica profunda que minimiza o risco de sofrimento ou angústia durante o procedimento
   NOTA: A exsanguinação é o método secundário de eutanásia de ratos usado neste experimento e garante que o animal tenha sido sacrificado de forma eficaz.
3. Raspe o abdômen e limpe-o com etanol 70% para reduzir a contaminação bacteriana durante a cirurgia.
   NOTA: Esta é uma cirurgia de não sobrevivência, portanto, a assepsia completa não é mantida.
4. Coloque o rato no meio da bandeja de dissecção e prenda os membros usando agulhas.
5. Faça uma incisão em forma de U através da pele e do músculo do centro da parte inferior do abdômen até a caixa torácica, prenda a pele e dobre-a até a cabeça, expondo os intestinos.
6. Mova cuidadosamente o intestino para o lado esquerdo do animal, para fora da cavidade abdominal, e exponha a veia porta hepática e a veia cava.
7. Com um alicate, passe um fio de algodão sob a veia porta e prepare 2 nós, 1 cm um do outro, que circundam a própria veia.
   NOTA: Um fio preto é mais fácil de visualizar.
8. Injete 100-150 UI de heparina dissolvida em 1x PBS (volume total de 300 μL) na veia cava para evitar a coagulação do sangue.

4. Canulação e perfusão hepática

1. Ligue a bomba a uma taxa de baixa velocidade (fluxo inferior a 1 mL/min).
2. Insira o angiocath 18 G na veia porta ao nível do fio em um ângulo plano em relação à veia.
3. Remova manualmente a agulha interna para deixar a cânula na veia. O sangue fluirá dentro dele, enchendo o plugue e evitando bolhas de ar presas na etapa seguinte.
4. Enquanto o tampão de perfusão flui na tubulação, conecte a cânula pressionando o botão C na extremidade de saída usando um conector Luer lock.
5. Neste ponto, amarre os nós, um ao redor do cateter dentro da veia e outro ao redor do cateter, antes de entrar na veia para estabilizar o tubo na posição correta.
6. Corte a veia cava para deixar o sangue sair. Certifique-se de que o fígado comece a inchar e clarear rapidamente (segundos) em 2-3 s. Isso confirma que o tampão de perfusão está fluindo corretamente pelo fígado.
   NOTA: Se alguns lobos permanecerem vermelhos, o angiocateter é colocado muito profundamente. Se houver apenas manchas vermelhas, bater levemente no fígado pode ajudar na perfusão nos pontos específicos. Despeje um pouco de 1x PBS sobre o abdômen aberto para ajudar a mover o sangue e verificar se há vazamentos.
7. Aumente lentamente o fluxo da bomba para 10 mL / min e mantenha-o por pelo menos 10 min para permitir a limpeza do fígado do sangue.
8. Durante a perfusão, aplique pressão na veia cava com um cotonete por intervalos de 10 s: Certifique-se de que o fígado incha ao clampear e relaxa ao liberar. Repita a pressão periodicamente (5-10 vezes) e verifique se há inchaço e relaxamento do fígado.
   NOTA: Esta etapa serve como um ponto de verificação crucial para validar visivelmente a perfusão. Tem sido essencial para garantir alta vitalidade dos hepatócitos e maximizar o rendimento final. Ao verificar ativamente esse processo, o tampão pode efetivamente atingir todas as partes da vasculatura hepática, o que a limpeza passiva do sangue por si só não alcançaria.

5. Digestão do fígado

1. Após a perfusão, mude para o tampão de digestão pré-aquecido sem interromper o fluxo e evitando bolhas de ar na tubulação.
   NOTA: Reduzir temporariamente o fluxo pode ajudar a realizar esta passagem. O tampão de digestão inclui vermelho de fenol, o que facilita a visualização da mudança do tampão de perfusão para o tampão de digestão.
2. Aumente a velocidade da bomba para 20 mL / min e pressione periodicamente com o cotonete para inchaço e relaxamento do fígado.
3. Após esta etapa (com duração de cerca de 15 minutos), certifique-se de que o fígado fique cada vez mais mole. Neste ponto, a agulha pode ser removida e a bomba para.
4. Como a cápsula hepática é frágil após a digestão, disseque o fígado com cuidado e cuidado: agarre o tecido conjuntivo central entre os lobos com uma pinça. Corte todas as conexões com outros órgãos e levante o fígado.
5. Lave o fígado, mergulhando-o na solução pré-resfriada de PBS + 3% P/S por alguns segundos. Em seguida, coloque-o no tubo completo contendo meio pré-resfriado de William.
   NOTA: A exsanguinação e a morte garantem a perfusão através da veia cava. A confirmação da morte do animal vem do pneumotórax induzido no momento em que o fígado é explantado, e o diafragma é totalmente dissecado e, após a inspeção, a respiração e os batimentos cardíacos não são mais funcionais.

6. Purificação de hepatócitos

1. Sob a capa biológica, transfira o fígado para a placa de Petri 100 mm com os 15 mL de meio completo de William frio sobre uma bandeja cheia de gelo.
2. Pressione o órgão vigorosamente com o raspador para liberar as células do meio.
   NOTA: Se a fase de digestão for executada corretamente, a liberação celular deve ser fácil e não exigir muita pressão no fígado. Não corte o fígado em pedaços; deixe-o intacto. Manter o fígado submerso no meio melhora a liberação celular.
3. Recolher as células que contêm o meio e filtrá-las com o filtro de 100 μm, transferindo-as para um tubo cónico estéril. A filtração permite a remoção de tecidos conjuntivos e fragmentos de tecido não digeridos.
4. Despeje cerca de 15 mL de meio completo de William frio sobre o fígado esmagado na placa de Petri para ajudar a liberar mais células. Repita as etapas 6.2 e 6.3.
5. Repetir o ponto 6.4 pelo menos uma vez, até que todas as células estejam libertadas. Se necessário, divida o meio em tubos mais cônicos e use vários filtros de 100 μm.
   NOTA: Depois que os hepatócitos são liberados e antes da filtragem, o meio deve parecer opaco devido à presença dos hepatócitos. O fígado restante deve parecer fibroso e será descartado.
6. Centrifugar o meio filtrado contendo células hepáticas a 50 x g durante 3 min a 4 °C com um travão de baixa velocidade.
   NOTA: Os hepatócitos são mais densos do que outras células do fígado. Devido à baixa força de centrifugação, apenas os hepatócitos estarão no pellet, enquanto outras células permanecerão no sobrenadante.
7. Rejeitar o sobrenadante sem perturbar o sedimento celular. Adicione delicadamente cerca de 40 mL de meio completo de William gelado no tubo e pipete lentamente para cima e para baixo 2 a 3 vezes para ressuspender o pellet celular.
   NOTA: O pellet celular deve ser ressuspenso com cuidado para evitar danos às células.
8. Centrifugue a 50 x g por 3 min a 4 °C.
   NOTA: Para as primeiras tentativas, conte as células viáveis com um ensaio de azul de tripano 1:10 após a segunda centrifugação antes de prosseguir para as próximas etapas. Isso pode evitar o desperdício de mídia e tempo se todas as células estiverem mortas.
9. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 25 mL de meio completo de William gelado.
10. Adicione 25 mL de solução de gradiente de densidade a 90% no tubo e misture suavemente.
    NOTA: Uma solução de gradiente de densidade separa os hepatócitos viáveis dos hepatócitos mortos e dos detritos celulares com base em sua densidade.
11. Centrifugue a 200 x g durante 10 min a 4 °C. Um pellet visível deve ser obtido no fundo do tubo, correspondente aos hepatócitos viáveis, e uma camada clara no topo do gradiente composta por hepatócitos mortos.
    NOTA: Se não houver pellet, tente misturar a solução novamente girando e repita a centrifugação.
12. Aspire a camada de células mortas do topo do gradiente e deixe 1-2 mL do meio com o pellet.
13. Ressuspenda o pellet em 30-40 mL do meio completo de William.
    NOTA: Para todo o procedimento, use apenas pipetas sorológicas de 25 mL. Pipetas de diâmetro menor podem reduzir a viabilidade dos hepatócitos. Todas as etapas devem ser realizadas no gelo para manter +4°C.
14. Centrifugar a 200 x g durante 10 min a 4°C e, em seguida, aspirar o sobrenadante.

7. Cultura de hepatócitos e coleta de RNA

1. Adicione uma quantidade apropriada de meio para contagem de células. Conte a viabilidade celular com azul de tripano 1:10.
2. Cultura de hepatócitos 2D
   1. Células da placa na concentração de 500.000 células/poço de prato de 6 poços em uma placa celular revestida de colágeno com meio completo de William pré-aquecido.
   2. Coloque a cultura de células em uma incubadora umidificada com 95% de ar, 5% de CO₂ a 37 °C.
   3. Após 4 h, troque o meio para o novo meio completo de William pré-aquecido.
   4. Mantenha as células na incubadora. Mude o meio diariamente.
   5. Colete hepatócitos primários em um reagente para extração de RNA antes do plaqueamento (dia 0) e nos dias 1 a 3 da cultura.
   6. Extrair o RNA de acordo com o protocolo do fabricante e transcrevê-lo inversamente para cDNA para avaliação de genes marcadores hepáticos por RT-qPCR. A lista de primers é apresentada na Tabela 2.
3. Para cultura de hepatócitos 3D de longo prazo:
   1. Ressuspenda as células na matriz pura fria na concentração de 1.000-10.000 células em 20 μL.
      NOTA: Tente evitar fazer bolhas de matriz.
   2. Usando pontas de pipeta pré-resfriadas, plaquete gotículas de células contendo matriz em placa de cultura de células pré-aquecida.
   3. Vire a placa de cabeça para baixo e deixe-a na incubadora de cultura de células por 20-30 min.
   4. Aumente o volume e adicione o meio de hepatócitos de longo prazo 3D pré-aquecido e o meio de cultura específico de acordo com o trabalho de Peng²². Mantenha as células na incubadora.
   5. Troque o meio de hepatócitos 3D de longo prazo a cada 2-3 dias.
   6. Pelo menos após 14 dias de cultivo, as Hep-Orgs são separadas da matriz e as Hep-Orgs viáveis são avaliadas pelo ensaio de proliferação de azul de Trypan e EdU e aprovadas de acordo com o trabalho de Peng.

Resultados

Ao final dos procedimentos de montagem (etapa 6.13), obtivemos um rendimento celular de até 1 x 10⁸ células por isolamento do fígado de cerca de 300 g de um rato. A viabilidade celular entre 78% e 97% foi estabelecida pela contagem de azul de tripano.

Como já descrito em estudos anteriores ^1,18,19, os hepatócitos primários em cultura perdem sua morfol...

Discussão

Os organoides 3D são uma fronteira para a medicina personalizada e permitem uma cultura de hepatócitos a longo prazo. A qualidade desta técnica inovadora requer um bom rendimento de hepatócitos primários viáveis e perfusão hepática e isolamento de hepatócitos bem executados. Este procedimento antigo ainda é amplamente utilizado; no entanto, compreende diferentes etapas que podem ser desafiadoras. Ao abordar o procedimento, experimentamos problemas críticos, como contaminação...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
A83-01- ALK5 Inhibitor IV	Twin Helix	T3031
B27	Thermofisher Scientific	0080085SA
CFX Connect Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad
CHIR99021	Twin Helix	T2310
Click EdU Alexa 488 imaging kit	Thermofisher Scientific	C10499
Collagen, Type I, solution from rat tail	Merck	C3867-1VL
Dexamethasone	Merck	D4902
EGF	Merck	E9644
Fetal bovine serum (FBS)	Euroclone	ECS0180L
GELTREX LDEV FREE RGF BME	Thermofisher Scientific	A1413202
Heparin Sodium 25000 IU/5 ml	B. Braun Melsungen AG	B01AB01
HGF	Peprotech	100-39H
Insulin-Transferrin-Selenium solution 100x	Thermofisher Scientific	41400045
L-Glutamine solution	Euroclone	ECB3000D
Liver Digest Medium	Thermofisher Scientific	17703-034
Liver Perfusion Medium	Thermofisher Scientific	17701038
N2 supplement	Thermofisher Scientific	17502048
N-acetylcysteine	Merck	A9165
Nicotinamide	Merck	N-0636
Non-Essential Amino Acids	Merck	M7145
Normocin	Aurogene	ant-nr-1
PBS buffer 1X	PanReac AppliChem	A0964,9050
Penicillin-streptomycin solution 100x	Euroclone	ECB3001D
Percoll	Santa Cruz	sc-296039A
Peristaltic pump	Ismatec™	MS-4/12 Reglo Digital Pump
TNFa	Peprotech	300-01A
TRI Reagent	Merck	T9424
Tubing	Ismatec™	ID.2,79mm
Williams' E Medium, no glutamine	Thermofisher Scientific	31415029
Y27632	Twin Helix	T1725