Perfusione epatica di ratto e isolamento degli epatociti primari: una vecchia procedura cruciale per la coltura di organoidi 3D all'avanguardia

Riepilogo

Questo protocollo presenta una tecnica ottimizzata di perfusione epatica della collagenasi in due fasi in un modello di ratto e mostra l'uso di epatociti isolati per la coltura in vitro a lungo termine di organoidi 3D.

Abstract

Gli epatociti primari sono uno strumento comunemente usato per gli studi in vitro correlati al fegato. Tuttavia, il mantenimento di queste cellule è sempre stato una sfida a causa della rapida perdita di morfologia, vitalità e funzionalità in coltura. Un approccio recente alla coltura a lungo termine è la generazione di organoidi tridimensionali (3D), uno strumento in vitro in grado di ricapitolare i tessuti in un piatto basato sulla meravigliosa capacità del fegato di rigenerarsi. I protocolli pubblicati sono stati progettati per ottenere organoidi 3D funzionali a lungo termine da epatociti adulti primari (Hep-Org). Lo strumento all'avanguardia per organoidi 3D richiede la capacità di isolare le cellule dal tessuto adulto e questo passaggio iniziale è fondamentale per un risultato finale di alta qualità. La perfusione collagenasi a due stadi, introdotta negli anni '70, è ancora una procedura valida per ottenere singoli epatociti. Il presente articolo si propone di descrivere tutte le fasi cruciali della procedura chirurgica, ottimizzando così la procedura di isolamento degli epatociti primari nel modello di ratto. Inoltre, particolare attenzione è rivolta alle linee guida PREPARE per aumentare la probabilità di successo delle procedure e garantire risultati di alta qualità. Un protocollo dettagliato consente ai ricercatori di accelerare e ottimizzare il lavoro a valle per stabilire organoidi 3D da epatociti di ratto adulti primari. Rispetto agli epatociti 2D, gli Hep-Org erano ancora vitali e in proliferazione attiva al giorno 15, dimostrando un potenziale a lungo termine.

Introduzione

Gli epatociti primari sono uno strumento importante e ampiamente utilizzato per gli studi in vitro correlati al fegato. Tuttavia, la loro espansione e manutenzione sono state storicamente impegnative, poiché perdono morfologia e funzionalità dopo pochi giorni nella coltura¹. La coltura 2D è una condizione limitante, in particolare, per gli epatociti che hanno una forma poligonale e una struttura polarizzata con membrane apicali e basolaterali differenziate. Infatti, l'adesione degli epatociti alla piastra interferisce con la loro normale attività perché porta ad un citoscheletro piatto con interazione limitata tra le cellule e tra le cellule e la matrice extracellulare (ECM), riducendo la polarizzazione e le vie di segnalazione coinvolte².

Per aggirare i limiti di questo metodo, Dunn e colleghi³ hanno prima utilizzato il doppio strato di collagene. Questo metodo di coltura, noto come "metodo della coltura a sandwich", si basa sulla semina di epatociti primari tra i due strati della matrice. Questo metodo presenta molti vantaggi, tra cui la coltura a lungo termine, il mantenimento della morfologia poligonale e le attività trascrizionali paragonabili a quelle degli epatociti appena isolati⁴. Un metodo simile, basato sullo stesso principio, dove il sottofondo è composto da Matrigel mentre la sovrapposizione di collagene, ha evidenziato la presenza di una rete canalicolare ben consolidata⁵.

Nonostante l'affidabilità del metodo della coltura a sandwich per la crescita degli epatociti, il presente lavoro non vede l'ora di mettere a punto una coltura di organoidi 3D, uno strumento in vitro utilizzato per ricapitolare i tessuti in un piatto e formare un potenziale ponte verso la medicina personalizzata, consentendo la generazione di intuizioni biologiche specifiche per la malattia, l'identificazione di bersagli molecolari, la sperimentazione di farmaci, la creazione di biobanche e l'apertura di nuovi orizzonti per tecnologie innovative come l'organ-on-chip⁶. Gli epatociti primari sono stati incorporati in goccioline di matrice emisferica note come "cupole" per consentire una robusta crescita di organoidi all'interno delle cupole e per garantire il flusso dei fattori solubili, tra cui il fattore di crescita degli epatociti (HGF) e il fattore di crescita epidermico (EGF), dal terreno di coltura. Questi fattori di crescita attivano direttamente le vie di segnalazione per garantire la sopravvivenza degli epatociti⁷. Gli organoidi epatici sono solitamente ottenuti da cellule staminali/progenitrici isolate da stadi embrionali o da ratti adulti, topi, fegato umano (e anche cani e gatti)⁸. Anche se la conformazione 3D migliora la differenziazione delle cellule staminali in epatociti adulti, questo strumento manca ancora della maturità del tessuto primario originale⁹. Per ovviare a questo problema, nel 2018, due diversi gruppi ^9,10 hanno pubblicato contemporaneamente un protocollo per ottenere una coltura a lungo termine di organoidi epatici 3D a partire da epatociti primari di topo adulti (denominati Hep-Org). I loro protocolli ricapitolano la risposta al danno proliferativo della rigenerazione epatica, sviluppando epatociti con un alto livello di citochine infiammatorie come si verifica dopo l'epatectomia parziale. Infatti, gli studi di cui sopra dimostrano che gli epatociti possono passare a uno stato duttale dopo una lesione¹² o quando la proliferazione dei colangiociti è soppressa¹³. La loro capacità bipotente consente la plasticità cellulare, che è importante per strutture complesse come gli organoidi. Pertanto, questi protocolli superano il problema dell'incapacità di espandere gli epatociti primari in vitro.

Lo strumento all'avanguardia per organoidi 3D richiede la capacità di isolare le cellule dal tessuto adulto e questo passaggio iniziale è fondamentale per un risultato finale di alta qualità. Mentre la preparazione di organoidi 3D potrebbe essere considerata una tecnica recente e in via di sviluppo (perché la definizione di organoide è stata coniata da Lancaster¹⁴ e Huch¹⁵ solo dieci anni fa), la perfusione di collagenasi in due fasi è una vecchia procedura introdotta da Seglen negli anni '70¹⁶. Concentrandosi sulle più recenti pubblicazioni nel campo, i protocolli di Ng¹⁷ e Shen¹⁸ potrebbero essere considerati il gold standard per l'esecuzione della procedura nei ratti, mentre quelli di Cabral¹⁹ e Charni-Natan²⁰ per i topi. Non è insolito che i ricercatori si concentrino sulla scelta della migliore matrice extracellulare (ECM) e dei migliori fattori di crescita per sviluppare organoidi 3D, ma si imbattono in fallimenti come procedure chirurgiche improprie, bassa vitalità e resa degli epatociti o alti livelli di contaminazione batterica. Questi problemi allungano gli esperimenti a valle e aumentano il numero di animali necessari per gli esperimenti successivi. Al contrario, se le procedure chirurgiche e di isolamento sono ben impostate, l'elevato numero di epatociti vitali ottenuti consente di preparare un numero enorme di organoidi, limitando così l'uso di animali. Il presente protocollo affronta principalmente questi problemi utilizzando soluzioni commerciali e ottimizzando una precisa incannulazione della vena porta che garantisce fasi ottimali di perfusione e digestione con il fegato in situ.

Al fine di migliorare la qualità, la riproducibilità e la traducibilità della nostra ricerca sugli animali, abbiamo esaminato attentamente le linee guida PREPARE: Pianificazione della ricerca e delle procedure sperimentali sugli animali: Raccomandazioni per l'eccellenza²¹. Queste linee guida per la rendicontazione cercano di aumentare le probabilità di successo attraverso la pianificazione e rappresentano un passo importante nell'attuazione delle 3R di Russel e Burch (sostituzione, riduzione e perfezionamento). Le linee guida di PREPARE coprono 15 argomenti principali che dovrebbero essere affrontati in base a ogni singolo progetto di ricerca. Descriveremo gli argomenti su cui ci siamo concentrati durante la pianificazione e la preparazione del progetto.

Il presente lavoro si propone di descrivere, in un protocollo esaustivo, dettagliato e consequenziale, le fasi cruciali dell'intervento chirurgico nel modello di ratto per consentire ai ricercatori di velocizzare e ottimizzare il lavoro a valle. Quando ci siamo avvicinati a questi protocolli all'inizio, abbiamo riscontrato problemi di contaminazione batterica, bassa efficienza della digestione epatica, bassa resa di epatociti primari e bassa vitalità degli epatociti che possono facilmente influire sul successo della tecnica. Mostrando come affrontare e risolvere le caratteristiche critiche, questo protocollo ha ottimizzato la procedura per l'isolamento primario degli epatociti di ratto. La perfusione epatica di ratto e il successivo isolamento primario degli epatociti adulti sono i principali passaggi preliminari per diverse applicazioni. In particolare, questo protocollo è adatto a tutte le procedure che richiedono una buona resa di epatociti adulti di alta qualità e alta vitalità. I risultati del protocollo sono appropriati per stabilire modelli in vitro per studiare la fisiologia e la patologia epatica.

Protocollo

Tutte le procedure e la stabulazione degli animali sono state condotte secondo le linee guida della legge italiana e della direttiva della Comunità Europea. Il protocollo sperimentale è stato approvato dal Comitato per la Cura degli Animali e dal Ministero della Salute (autorizzazione n° 321/2022-PR) ai sensi dell'art.31 del decreto 26/2014.

1. Preparazione per la procedura con gli animali

NOTA: Fare riferimento alla Tabella 1 per la composizione del mezzo e del tampone e alla Tabella dei materiali per i dettagli commerciali.

1. Scaldare il bagnomaria a 42 °C e poi mettere il tampone di perfusione e 1x PBS nel bagnomaria per circa 20 minuti.
   NOTA: A causa della sensibilità enzimatica, il tampone di digestione viene riscaldato solo quando la procedura di perfusione è stata avviata con successo. Durante la procedura di perfusione, mantenere le soluzioni nel bagnomaria.
2. Metti il mezzo completo di William e PBS + 3% P/S sul ghiaccio.
3. Preparare la pompa peristaltica e collegare il tubo con il flacone di vetro e la trappola per bolle, entrambi riempiti con tampone di perfusione.
4. Durante l'adescamento della pompa, riempire il tubo con un tampone di perfusione caldo per rimuovere l'aria e lavare l'etanolo residuo (bassa velocità della pompa). Questo passaggio è importante anche per verificare il corretto funzionamento della pompa e l'eventuale perdita del tubo.

2. Preparazione per l'isolamento degli epatociti

1. Durante la procedura su animali, esporre i seguenti strumenti alla luce UV: piastra di Petri 100 mm, filtro cellulare 100 μm, raschietto misura M, pinzette grandi, bicchiere per ghiaccio, vassoio per ghiaccio.

3. Procedura iniziale sull'animale e anestesia

1. Anestetizzare il ratto adulto (250-350 g di peso corporeo; 10-12 settimane di età) mediante iniezione intraperitoneale di una miscela di anestetici (concentrazione finale per xilazina: 22,5 mg/kg; per ketamina: 112,5 mg/kg; volume finale approssimativo: 0,8-1,0 ml).
2. Monitora la profondità dell'anestesia pizzicando le dita dei piedi fino a quando il ratto non risponde più agli stimoli nocivi. Di solito ci vogliono 5 minuti. La dose di anestetico garantisce un'anestesia chirurgica profonda che riduce al minimo il rischio di sofferenza o angoscia durante la procedura
   NOTA: Il dissanguamento è il metodo secondario di eutanasia dei ratti utilizzato in questo esperimento e garantisce che l'animale sia stato soppresso in modo efficace.
3. Radere l'addome e pulirlo con etanolo al 70% per ridurre la contaminazione batterica durante l'intervento.
   NOTA: Questo è un intervento chirurgico non di sopravvivenza, quindi l'asepsi completa non viene mantenuta.
4. Posiziona il ratto al centro del vassoio di dissezione e fissa gli arti con gli aghi.
5. Fai un'incisione a forma di U attraverso la pelle e il muscolo dal centro del basso addome alla gabbia toracica, blocca la pelle e piegala fino alla testa, esponendo l'intestino.
6. Spostare con cautela l'intestino sul lato sinistro dell'animale, fuori dalla cavità addominale, ed esporre la vena porta epatica e la vena cava.
7. Con le pinze passare un filo di cotone sotto la vena porta e preparare 2 nodi, a 1 cm l'uno dall'altro, che circondano la vena stessa.
   NOTA: Un filo nero è più facile da visualizzare.
8. Iniettare 100-150 UI di eparina disciolta in 1x PBS (volume totale 300 μL) nella vena cava per prevenire la coagulazione del sangue.

4. Incannulamento e perfusione epatica

1. Accendere la pompa a bassa velocità (flusso inferiore a 1 ml/min).
2. Inserire l'angiocath da 18 g nella vena porta a livello del filo con un angolo piatto rispetto alla vena.
3. Rimuovere manualmente l'ago interno per lasciare la cannula nella vena. Il sangue scorrerà al suo interno, riempiendo il tappo ed evitando bolle d'aria intrappolate nel passaggio successivo.
4. Mentre il tampone di perfusione scorre nel tubo, collegare la cannula premendo il pulsante C all'estremità di uscita utilizzando un connettore Luer lock.
5. A questo punto, fare i nodi, uno intorno al catetere all'interno della vena e uno intorno al catetere, prima di entrare nella vena per stabilizzare il tubo nella giusta posizione.
6. Tagliare la vena cava per far uscire il sangue. Assicurarsi che il fegato inizi a gonfiarsi e sbiancare rapidamente (secondi) in 2-3 secondi. Ciò conferma che il tampone di perfusione scorre correttamente attraverso il fegato.
   NOTA: Se alcuni lobi rimangono rossi, l'atleta è posizionato troppo in profondità. Se ci sono solo macchie rosse, picchiettare leggermente sul fegato può aiutare la perfusione nei punti specifici. Versare un po' di PBS 1x sull'addome aperto per aiutare a spostare il sangue e verificare la presenza di perdite.
7. Aumentare lentamente il flusso della pompa a 10 ml/min e mantenerlo per almeno 10 minuti per consentire la pulizia del fegato dal sangue.
8. Durante la perfusione, esercitare pressione sulla vena cava con un batuffolo di cotone a intervalli di 10 secondi: assicurarsi che il fegato si gonfi al momento del serraggio e si rilassi al rilascio. Ripetere periodicamente la pressione (5-10 volte) e verificare la presenza di gonfiore e rilassamento del fegato.
   NOTA: Questo passaggio funge da punto di controllo cruciale per convalidare visibilmente la perfusione. È stato essenziale per garantire un'elevata vitalità degli epatociti e massimizzare la resa finale. Verificando attivamente questo processo, il tampone può raggiungere efficacemente tutte le parti del sistema vascolare epatico, cosa che la sola eliminazione passiva del sangue non sarebbe in grado di raggiungere.

5. Digestione del fegato

1. Dopo la perfusione, passare al tampone di digestione preriscaldato senza interrompere il flusso ed evitando bolle d'aria nel tubo.
   NOTA: La riduzione temporanea del flusso può aiutare a eseguire questo passaggio. Il tampone di digestione include il rosso fenolo, che facilita la visualizzazione del passaggio dal tampone di perfusione al tampone di digestione.
2. Aumentare la velocità della pompa a 20 ml/min e premere periodicamente con il tampone per il gonfiore e il rilassamento del fegato.
3. Dopo questo passaggio (della durata di circa 15 minuti), assicurarsi che il fegato diventi sempre più pastoso. A questo punto, l'ago può essere rimosso e la pompa si ferma.
4. Poiché la capsula epatica è fragile dopo la digestione, sezionare delicatamente e con attenzione il fegato: afferrare il tessuto connettivo centrale tra i lobi con una pinza. Taglia tutte le connessioni con altri organi e solleva il fegato.
5. Lavare il fegato, immergendolo nella soluzione pre-raffreddata PBS + 3% P/S per alcuni secondi. Quindi, mettilo nel tubo contenente il terreno completo di William pre-raffreddato.
   NOTA: Il dissanguamento e la morte assicurano la perfusione attraverso la vena cava. La conferma della morte dell'animale arriva dallo pneumotorace indotto nel momento in cui il fegato viene espiantato e il diaframma viene completamente sezionato e, dopo l'ispezione, la respirazione e il battito cardiaco non sono più funzionali.

6. Purificazione degli epatociti

1. Sotto la cappa biologica, trasferire il fegato nella capsula di Petri da 100 mm con i 15 mL di terreno freddo William's complete su una vaschetta piena di ghiaccio.
2. Premere energicamente l'organo con il raschietto per rilasciare le cellule nel terreno.
   NOTA: Se la fase di digestione viene eseguita correttamente, il rilascio delle cellule dovrebbe essere facile e non richiedere molta pressione sul fegato. Non tagliare il fegato a pezzi; Lascialo intatto. Mantenere il fegato immerso nel terreno migliora il rilascio cellulare.
3. Raccogliere le cellule contenenti terreno e filtrarle con il filtro da 100 μm trasferendole in una provetta conica sterile. La filtrazione consente la rimozione dei tessuti connettivi e dei frammenti di tessuto non digeriti.
4. Versare circa 15 ml di terreno freddo di William sul fegato schiacciato nella capsula di Petri per aiutare a rilasciare più cellule. Ripetere i passaggi 6.2 e 6.3.
5. Ripetere il punto 6.4 almeno una volta, fino a quando tutte le celle sono state rilasciate. Se necessario, dividere il fluido in tubi più conici e utilizzare più filtri da 100 μm.
   NOTA: Dopo che gli epatociti sono stati rilasciati e prima del filtraggio, il terreno dovrebbe apparire opaco a causa della presenza degli epatociti. Il fegato rimanente dovrebbe apparire fibroso e verrà scartato.
6. Centrifugare il terreno filtrato contenente cellule epatiche a 50 x g per 3 minuti a 4 °C con un freno a bassa velocità.
   NOTA: Gli epatociti sono più densi di altre cellule epatiche. A causa della bassa forza di centrifugazione, solo gli epatociti saranno nel pellet, mentre le altre cellule rimarranno nel surnatante.
7. Scartare il surnatante senza disturbare il pellet della cella. Aggiungere delicatamente circa 40 mL di terreno completo ghiacciato di William nella provetta e pipettare lentamente su e giù 2 o 3 volte per risospendere il pellet cellulare.
   NOTA: Il pellet della cella deve essere risospeso con cura per evitare di danneggiare le celle.
8. Centrifugare a 50 x g per 3 min a 4 °C.
   NOTA: Per i primi tentativi, contare le cellule vitali con un saggio 1:10 di blu di tripano dopo la seconda centrifugazione prima di procedere con le fasi successive. In questo modo si evitano sprechi di terreno e tempo se tutte le celle sono morte.
9. Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 25 mL di terreno completo di William ghiacciato.
10. Aggiungere 25 mL di soluzione con gradiente di densità al 90% nella provetta e mescolare delicatamente.
    NOTA: Una soluzione a gradiente di densità separa gli epatociti vitali dagli epatociti morti e dai detriti cellulari in base alla loro densità.
11. Centrifugare a 200 x g per 10 min a 4 °C. Sul fondo della provetta deve essere ottenuto un pellet visibile, corrispondente agli epatociti vitali, e uno strato chiaro sulla parte superiore del gradiente composto da epatociti morti.
    NOTA: Se non c'è pellet, provare a mescolare nuovamente la soluzione agitando e ripetere la centrifugazione.
12. Aspirare lo strato di cellule morte dalla parte superiore del gradiente e lasciare 1-2 ml di terreno con il pellet.
13. Risospendere il pellet in 30-40 mL di terreno completo di William.
    NOTA: Per l'intera procedura, utilizzare solo pipette sierologiche da 25 mL. Pipette di diametro più piccolo possono ridurre la vitalità degli epatociti. Tutti i passaggi devono essere eseguiti su ghiaccio per mantenere i +4°C.
14. Centrifugare a 200 x g per 10 min a 4°C, quindi aspirare il surnatante.

7. Coltura di epatociti e raccolta di RNA

1. Aggiungere una quantità appropriata di terreno per il conteggio delle cellule. Conta la vitalità delle cellule con il blu di tripano 1:10.
2. Coltura di epatociti 2D
   1. Piastre di cellule alla concentrazione di 500.000 cellule/pozzetto di piastra a 6 pozzetti su una piastra cellulare rivestita di collagene con terreno completo di William preriscaldato.
   2. Collocare la coltura cellulare in un incubatore umidificato con il 95% di aria e il 5% di CO₂ a 37 °C.
   3. Dopo 4 ore, cambiare il mezzo con il nuovo mezzo completo di William preriscaldato.
   4. Conservare le cellule nell'incubatore. Cambia il mezzo ogni giorno.
   5. Raccogliere gli epatociti primari in un reagente per l'estrazione dell'RNA prima della piastratura (giorno 0) e nei giorni da 1 a 3 della coltura.
   6. Estrarre l'RNA secondo il protocollo del produttore e trascriverlo in cDNA per la valutazione dei geni marcatori epatici mediante RT-qPCR. L'elenco dei primer è presentato nella Tabella 2.
3. Per la coltura 3D a lungo termine degli epatociti:
   1. Risospendere le cellule nella matrice pura fredda alla concentrazione di 1.000-10.000 cellule in 20 μL.
      NOTA: Cerca di evitare di creare bolle di matrice.
   2. Utilizzando puntali per pipette pre-raffreddati, piastra le goccioline cellulari contenenti matrice in una piastra di coltura cellulare pre-riscaldata.
   3. Capovolgere la piastra e lasciarla nell'incubatore per colture cellulari per 20-30 minuti.
   4. Alza il volume e aggiungi il terreno di coltura 3D a lungo termine preriscaldato e il terreno di coltura specifico secondo il lavoro di Peng²². Conservare le cellule nell'incubatore.
   5. Cambiare il terreno epatocitario 3D a lungo termine ogni 2-3 giorni.
   6. Almeno dopo 14 giorni di coltura, gli Hep-Org vengono separati dalla matrice e gli Hep-Org vitali vengono valutati mediante il test di proliferazione del blu di tripano e dell'EdU e fatti passare secondo il lavoro di Peng.

Risultati

Al termine delle procedure di set-up (fase 6.13), abbiamo ottenuto una resa cellulare fino a 1 x 10⁸ cellule per isolamento dal fegato di circa 300 g di un ratto. La vitalità cellulare tra il 78% e il 97% è stata stabilita mediante la conta del blu di tripano.

Come già descritto in studi precedenti ^1,18,19, gli epatociti primari in coltura perdono la lor...

Discussione

Gli organoidi 3D sono una frontiera per la medicina personalizzata e consentono una coltura di epatociti a lungo termine. La qualità di questa tecnica innovativa richiede una buona resa di epatociti primari vitali e una perfusione epatica e un isolamento degli epatociti ben eseguiti. Questa vecchia procedura è ancora ampiamente utilizzata; Tuttavia, comprende diversi passaggi che possono essere impegnativi. Avvicinandoci alla procedura, abbiamo riscontrato problemi critici come la cont...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
A83-01- ALK5 Inhibitor IV	Twin Helix	T3031
B27	Thermofisher Scientific	0080085SA
CFX Connect Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad
CHIR99021	Twin Helix	T2310
Click EdU Alexa 488 imaging kit	Thermofisher Scientific	C10499
Collagen, Type I, solution from rat tail	Merck	C3867-1VL
Dexamethasone	Merck	D4902
EGF	Merck	E9644
Fetal bovine serum (FBS)	Euroclone	ECS0180L
GELTREX LDEV FREE RGF BME	Thermofisher Scientific	A1413202
Heparin Sodium 25000 IU/5 ml	B. Braun Melsungen AG	B01AB01
HGF	Peprotech	100-39H
Insulin-Transferrin-Selenium solution 100x	Thermofisher Scientific	41400045
L-Glutamine solution	Euroclone	ECB3000D
Liver Digest Medium	Thermofisher Scientific	17703-034
Liver Perfusion Medium	Thermofisher Scientific	17701038
N2 supplement	Thermofisher Scientific	17502048
N-acetylcysteine	Merck	A9165
Nicotinamide	Merck	N-0636
Non-Essential Amino Acids	Merck	M7145
Normocin	Aurogene	ant-nr-1
PBS buffer 1X	PanReac AppliChem	A0964,9050
Penicillin-streptomycin solution 100x	Euroclone	ECB3001D
Percoll	Santa Cruz	sc-296039A
Peristaltic pump	Ismatec™	MS-4/12 Reglo Digital Pump
TNFa	Peprotech	300-01A
TRI Reagent	Merck	T9424
Tubing	Ismatec™	ID.2,79mm
Williams' E Medium, no glutamine	Thermofisher Scientific	31415029
Y27632	Twin Helix	T1725