Perfusion der Rattenleber und Isolierung primärer Hepatozyten: ein altes Verfahren, das für die hochmoderne 3D-Organoidkultur entscheidend ist

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt eine optimierte zweistufige Kollagenase-Leberperfusionstechnik in einem Rattenmodell vor und zeigt die Verwendung von isolierten Hepatozyten für die in vitro Langzeitkultur von 3D-Organoiden.

Zusammenfassung

Primäre Hepatozyten sind ein häufig verwendetes Werkzeug für In-vitro-Studien im Zusammenhang mit der Leber. Die Erhaltung dieser Zellen war jedoch schon immer eine Herausforderung, da sie in Kultur schnell an Morphologie, Lebensfähigkeit und Funktionalität verloren haben. Ein neuerer Ansatz zur Langzeitkultur ist die Erzeugung von dreidimensionalen (3D) Organoiden, einem In-vitro-Werkzeug , das Gewebe in einer Schale rekapitulieren kann, basierend auf der wunderbaren Fähigkeit der Leber, sich selbst zu regenerieren. Veröffentlichte Protokolle wurden entwickelt, um langfristig funktionsfähige 3D-Organoide aus primären adulten Hepatozyten (Hep-Orgs) zu gewinnen. Das hochmoderne 3D-Organoid-Werkzeug erfordert die Fähigkeit, Zellen aus adultem Gewebe zu isolieren, und dieser erste Schritt ist entscheidend für ein qualitativ hochwertiges Endergebnis. Die in den 1970er Jahren eingeführte zweistufige Kollagenase-Perfusion ist nach wie vor ein gültiges Verfahren, um einzelne Hepatozyten zu gewinnen. Ziel des vorliegenden Artikels ist es, alle entscheidenden Schritte des chirurgischen Eingriffs zu beschreiben und dadurch das Verfahren zur Isolierung primärer Hepatozyten im Rattenmodell zu optimieren. Darüber hinaus wird ein besonderes Augenmerk auf die PREPARE-Leitlinien gelegt, um die Wahrscheinlichkeit erfolgreicher Verfahren zu erhöhen und qualitativ hochwertige Ergebnisse zu gewährleisten. Ein detailliertes Protokoll ermöglicht es den Forschern, die nachgelagerte Arbeit zur Etablierung von 3D-Organoiden aus primären adulten Rattenhepatozyten zu beschleunigen und zu optimieren. Im Vergleich zu 2D-Hepatozyten waren Hep-Orgs an Tag 15 noch lebensfähig und in aktiver Proliferation, was ein langfristiges Potenzial zeigt.

Einleitung

Primäre Hepatozyten sind ein wichtiges und weit verbreitetes Werkzeug für in vitro Leberstudien. Ihre Erweiterung und Pflege war jedoch in der Vergangenheit eine Herausforderung, da sie nach einigen Tagen in der Kultur an Morphologie und Funktionalität verlieren¹. Die 2D-Kultur ist insbesondere für Hepatozyten eine limitierende Bedingung, die eine polygonale Form und polarisierte Struktur mit differenzierten apikalen und basolateralen Membranen aufweisen. Tatsächlich beeinträchtigt die Adhäsion der Hepatozyten an der Platte ihre normale Aktivität, da sie zu einem flachen Zytoskelett mit begrenzter Interaktion zwischen den Zellen und zwischen den Zellen und der extrazellulären Matrix (EZM) führt, wodurch die Polarisation und die beteiligten Signalwege reduziert^{werden 2}.

Um die Einschränkungen dieser Methode zu umgehen, verwendeten Dunn und Kollegen³ zunächst die Kollagen-Doppelschicht. Diese Kulturmethode, die als "Sandwichkultur-Methode" bekannt ist, basiert auf der Aussaat von primären Hepatozyten zwischen den beiden Schichten der Matrix. Diese Methode hat viele Vorteile, darunter die Langzeitkultur, die Beibehaltung der polygonalen Morphologie und transkriptionelle Aktivitäten, die mit denen frisch isolierter Hepatozyten vergleichbar sind⁴. Ein ähnliches, auf dem gleichen Prinzip beruhendes Verfahren, bei dem die Unterlage aus Matrigel und die Überlagerung aus Kollagen besteht, hat das Vorhandensein eines gut etablierten Kanalikularnetzwerks nachgewiesen⁵.

Trotz der Zuverlässigkeit der Sandwich-Kulturmethode für das Hepatozytenwachstum wird in der vorliegenden Arbeit eine 3D-Organoidkultur aufgebaut, ein In-vitro-Werkzeug zur Rekapitulation von Geweben in einer Schale und eine potenzielle Brücke zur personalisierten Medizin gebildet, die die Generierung krankheitsspezifischer biologischer Erkenntnisse, die Identifizierung molekularer Ziele, die Etablierung von Medikamenten, die Einrichtung von Biobanken und die Eröffnung neuer Horizonte für innovative Technologien wie Organ-on-Chip^{ermöglicht 6}. Primäre Hepatozyten wurden in hemisphärische Matrixtröpfchen eingebettet, die als "Domes" bekannt sind, um ein robustes Wachstum von Organoiden in den Domes zu ermöglichen und den Fluss der löslichen Faktoren, einschließlich des Hepatozyten-Wachstumsfaktors (HGF) und des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF), aus dem Kulturmedium zu gewährleisten. Diese Wachstumsfaktoren aktivieren direkt Signalwege, um das Überleben der Hepatozyten zu sichern⁷. Leber-Organoide werden in der Regel aus Stamm-/Vorläuferzellen gewonnen, die aus embryonalen Stadien oder adulten Ratten, Mäusen, menschlicher (und auch Hunde- und Katzen-) Leber isoliert wurden⁸. Auch wenn die 3D-Konformation die Differenzierung von Stammzellen zu adulten Hepatozyten verbessert, fehlt diesem Werkzeug immer noch die Reife des ursprünglichen Primärgewebes⁹. Um dieses Problem zu überwinden, veröffentlichten 2018 zwei verschiedene Gruppen ^9,10 gleichzeitig ein Protokoll zur Gewinnung einer Langzeitkultur von 3D-Leberorganoiden aus adulten primären Maus-Hepatozyten (als Hep-Orgs bezeichnet). Ihre Protokolle rekapitulieren die proliferative Schadensreaktion der Leberregeneration, indem Hepatozyten mit einem hohen Gehalt an entzündlichen Zytokinen wachsen, wie sie nach einer partiellen Hepatektomie auftreten. In der Tat zeigen die oben genannten Studien, dass Hepatozyten nach einer Verletzung¹² oder wenn die Cholangiozytenproliferation unterdrückt wird¹³, in einen duktalen Zustand wechseln können. Ihre bipotente Kapazität ermöglicht die zelluläre Plastizität, was für komplexe Strukturen wie Organoide wichtig ist. Daher überwinden diese Protokolle das Problem der Unfähigkeit, primäre Hepatozyten in vitro zu expandieren.

Das hochmoderne 3D-Organoid-Werkzeug erfordert die Fähigkeit, Zellen aus adultem Gewebe zu isolieren, und dieser erste Schritt ist entscheidend für ein qualitativ hochwertiges Endergebnis. Während die 3D-Organoid-Präparation als eine neue und sich entwickelnde Technik angesehen werden kann (da die Organoid-Definition erst vor zehn Jahren von Lancaster¹⁴ und Huch¹⁵ geprägt wurde), ist die zweistufige Kollagenase-Perfusion ein altes Verfahren, das von Seglen in den 1970er Jahren eingeführt wurde¹⁶. Konzentriert man sich auf die neuesten Veröffentlichungen auf diesem Gebiet, so können die Protokolle von Ng¹⁷ und Shen¹⁸ als Goldstandard für die Durchführung des Verfahrens bei Ratten angesehen werden, während die Protokolle von Cabral¹⁹ und Charni-Natan²⁰ für Mäuse angesehen werden. Es ist nicht ungewöhnlich, dass sich Forscher auf die Auswahl der besten extrazellulären Matrix (EZM) und Wachstumsfaktoren für die Entwicklung von 3D-Organoiden konzentrieren, aber auf Fehler stoßen, wie z. B. unsachgemäße chirurgische Eingriffe, geringe Lebensfähigkeit und Ausbeute der Hepatozyten oder ein hohes Maß an bakterieller Kontamination. Diese Probleme verlängern die nachgelagerten Versuche und erhöhen die Anzahl der Tiere, die für die folgenden Versuche benötigt werden. Umgekehrt ermöglicht die hohe Anzahl der gewonnenen lebensfähigen Hepatozyten, wenn die Operations- und Isolierungsverfahren gut abgestimmt sind, die Herstellung einer großen Anzahl von Organoiden, wodurch der Einsatz von Tieren eingeschränkt wird. Das vorliegende Protokoll befasst sich hauptsächlich mit diesen Fragen unter Verwendung kommerzieller Lösungen und durch die Optimierung einer präzisen Pfortaderkanülierung, die optimale Perfusions- und Verdauungsschritte mit der Leber in situ gewährleistet.

Um die Qualität, Reproduzierbarkeit und Übersetzbarkeit unserer Tierversuche zu verbessern, haben wir die PREPARE-Richtlinien sorgfältig berücksichtigt: Planning Research and Experimental Procedures on Animals: Recommendations for Excellence²¹. Diese Reporting-Richtlinien versuchen, die Erfolgswahrscheinlichkeit durch Planung zu erhöhen und stellen einen wichtigen Schritt bei der Umsetzung der 3R von Russel und Burch (Replacement, Reduction, and Refinement) dar. Der PREPARE-Leitfaden deckt 15 Hauptthemen ab, die je nach Forschungsprojekt bearbeitet werden sollten. Wir beschreiben die Themen, auf die wir uns bei der Planung und Vorbereitung des Projekts konzentriert haben.

Die vorliegende Arbeit zielt darauf ab, in einem umfassenden, detaillierten und konsequenten Protokoll die entscheidenden Schritte der Operation im Rattenmodell zu beschreiben, um den Forschern eine Beschleunigung und Optimierung der nachgelagerten Arbeit zu ermöglichen. Als wir uns diesen Protokollen zum ersten Mal näherten, stießen wir auf Probleme mit bakterieller Kontamination, geringer Leberverdauungseffizienz, geringer primärer Hepatozytenausbeute und geringer Lebensfähigkeit der Hepatozyten, die den Erfolg der Technik leicht beeinträchtigen können. Dieses Protokoll zeigte, wie kritische Merkmale angesprochen und gelöst werden können, und optimierte das Verfahren für die Isolierung primärer Hepatozyten von Ratten. Die Perfusion der Rattenleber und die anschließende Isolierung von primären adulten Hepatozyten sind die wichtigsten vorbereitenden Schritte für verschiedene Anwendungen. Insbesondere eignet sich dieses Protokoll für alle Verfahren, die eine gute Ausbeute an hochwertigen und lebensfähigen adulten Hepatozyten erfordern. Die Ergebnisse des Protokolls sind geeignet, um In-vitro-Modelle zur Untersuchung der Leberphysiologie und -pathologie zu etablieren.

Protokoll

Alle Verfahren und die Unterbringung der Tiere wurden gemäß den Richtlinien des italienischen Rechts und der Richtlinie der Europäischen Gemeinschaft durchgeführt. Das Versuchsprotokoll wurde vom lokalen Tierschutzausschuss und vom italienischen Gesundheitsministerium (Genehmigung Nr. 321/2022-PR) gemäß Art. 31 des Dekrets 26/2014 genehmigt.

1. Vorbereitung auf den Tiereingriff

HINWEIS: Bitte beziehen Sie sich auf Tabelle 1 für die Zusammensetzung des Mediums und des Puffers und auf die Materialtabelle für kommerzielle Details.

1. Erwärmen Sie das Wasserbad auf 42 °C und legen Sie dann den Perfusionspuffer und 1x PBS für ca. 20 min in das Wasserbad.
   HINWEIS: Aufgrund der Enzymempfindlichkeit wird der Verdauungspuffer erst erwärmt, wenn das Perfusionsverfahren erfolgreich gestartet wurde. Halten Sie die Lösungen während des Perfusionsvorgangs im Wasserbad.
2. Lege Williams komplettes Medium und PBS + 3% KGV auf Eis.
3. Bereiten Sie die Peristaltikpumpe vor und verbinden Sie den Schlauch mit der Glasflasche und der Blasenfalle, die beide mit Perfusionspuffer gefüllt sind.
4. Füllen Sie den Schlauch beim Ansaugen der Pumpe mit warmem Perfusionspuffer, um Luft zu entfernen und Ethanolreste zu waschen (niedrige Pumpendrehzahl). Dieser Schritt ist auch wichtig, um den korrekten Betrieb der Pumpe und mögliche Schlauchleckagen zu überprüfen.

2. Vorbereitung für die Isolierung von Hepatozyten

1. Während des tierischen Eingriffs sind folgende Instrumente dem UV-Licht auszusetzen: Petrischale 100 mm, Zellsieb 100 μm, Schaber Größe M, große Pinzette, Becherglas für Eis, Schale für Eis.

3. Erstes Verfahren an den Tieren und Anästhesie

1. Betäuben Sie die erwachsene Ratte (250-350 g Körpergewicht; 10-12 Wochen alt) durch intraperitoneale Injektion einer Anästhesiemischung (Endkonzentration für Xylazin: 22,5 mg/kg; für Ketamin: 112,5 mg/kg; ca. Endvolumen: 0,8-1,0 ml).
2. Überwachen Sie die Narkosetiefe, indem Sie die Zehen zusammenkneifen, bis die Ratte nicht mehr auf schädliche Reize reagiert. In der Regel dauert es 5 Minuten. Die Anästhesiedosis sorgt für eine tiefe, chirurgische Anästhesie, die das Risiko von Leiden oder Belastungen während des Eingriffs minimiert
   HINWEIS: Die Ausblutung ist die sekundäre Methode der Ratten-Euthanasie, die in diesem Versuch verwendet wird, und stellt sicher, dass das Tier effektiv eingeschläfert wurde.
3. Rasieren Sie den Bauch und reinigen Sie ihn mit 70% Ethanol, um die bakterielle Kontamination während der Operation zu reduzieren.
   HINWEIS: Da es sich um eine Operation handelt, bei der nicht überlebt wird, wird keine vollständige Asepsis aufrechterhalten.
4. Legen Sie die Ratte in die Mitte des Seziertabletts und befestigen Sie die Gliedmaßen mit Nadeln.
5. Machen Sie einen U-förmigen Schnitt durch die Haut und den Muskel von der Mitte des Unterbauchs bis zum Brustkorb, klemmen Sie die Haut ein und falten Sie sie zum Kopf hoch, wodurch der Darm freigelegt wird.
6. Bewegen Sie den Darm vorsichtig auf die linke Seite des Tieres, aus der Bauchhöhle, und legen Sie die Leberpfortader und die Hohlvene frei.
7. Führen Sie mit einer Zange einen Baumwollfaden unter die Pfortader und bereiten Sie 2 Knoten vor, die 1 cm voneinander entfernt sind und die Vene selbst umgeben.
   HINWEIS: Ein schwarzer Faden ist leichter zu visualisieren.
8. Injizieren Sie 100-150 IE Heparin gelöst in 1x PBS (Gesamtvolumen 300 μL) in die Hohlvene, um eine Blutgerinnung zu verhindern.

4. Kanülierung und Leberperfusion

1. Schalten Sie die Pumpe mit einer niedrigen Drehzahl ein (weniger als 1 ml/min Durchfluss).
2. Führen Sie den 18 G Angiokath in die Pfortader auf Höhe des Fadens in einem flachen Winkel relativ zur Vene ein.
3. Entfernen Sie die innere Nadel manuell, um die Kanüle in der Vene zu belassen. Im nächsten Schritt fließt Blut, das den Pfropfen füllt und eingeschlossene Luftblasen vermeidet.
4. Während der Perfusionspuffer in den Schlauch fließt, verbinden Sie die Kanüle durch Drücken der C-Taste mit einem Luer-Lock-Anschluss mit dem Auslassende.
5. Binden Sie an dieser Stelle die Knoten, einen um den Katheter in der Vene und einen um den Katheter, bevor Sie in die Vene eintreten, um den Schlauch in der richtigen Position zu stabilisieren.
6. Schneide die Hohlvene auf, damit das Blut austreten kann. Stellen Sie sicher, dass die Leber in 2-3 s schnell (Sekunden) anschwillt und bleicht. Dies bestätigt, dass der Perfusionspuffer korrekt durch die Leber fließt.
   HINWEIS: Wenn einige Lappen rot bleiben, wird der Angiokatheter zu tief platziert. Wenn nur rote Flecken vorhanden sind, kann ein leichtes Klopfen auf die Leber die Durchblutung an den spezifischen Stellen unterstützen. Gießen Sie etwas 1x PBS über den offenen Bauch, um das Blut zu bewegen und auf Undichtigkeiten zu prüfen.
7. Erhöhen Sie den Pumpenfluss langsam auf 10 ml/min und halten Sie ihn mindestens 10 Minuten lang, um die Reinigung der Leber vom Blut zu ermöglichen.
8. Während der Perfusion üben Sie mit einem Wattestäbchen für 10 s Intervalle Druck auf die Hohlvene aus: Achten Sie darauf, dass die Leber beim Einklemmen anschwillt und sich beim Lösen entspannt. Wiederholen Sie den Druck regelmäßig (5-10 Mal) und prüfen Sie, ob die Leber anschwillt und sich entspannt.
   HINWEIS: Dieser Schritt dient als wichtiger Prüfpunkt für die sichtbare Validierung der Perfusion. Es war unerlässlich, um eine hohe Vitalität der Hepatozyten zu gewährleisten und die Endausbeute zu maximieren. Durch die aktive Überprüfung dieses Prozesses kann der Puffer effektiv alle Teile des Lebergefäßsystems erreichen, was eine passive Blutreinigung allein nicht erreichen würde.

5. Verdauung der Leber

1. Wechseln Sie nach der Perfusion zum vorgewärmten Aufschlusspuffer, ohne den Durchfluss zu unterbrechen und Luftblasen im Schlauch zu vermeiden.
   HINWEIS: Eine vorübergehende Reduzierung des Durchflusses kann helfen, diesen Durchgang durchzuführen. Der Aufschlusspuffer enthält Phenolrot, was die Visualisierung des Wechsels vom Perfusionspuffer zum Aufschlusspuffer erleichtert.
2. Erhöhen Sie die Pumpendrehzahl auf 20 mL/min und drücken Sie regelmäßig mit dem Tupfer, um die Leber zu anschwellen und zu entspannen.
3. Nach diesem Schritt (der etwa 15 Minuten dauert) sorgen Sie dafür, dass die Leber zunehmend matschig wird. An diesem Punkt kann die Nadel entfernt werden und die Pumpe stoppt.
4. Da die Leberkapsel nach der Verdauung brüchig ist, präparieren Sie die Leber vorsichtig und vorsichtig: Fassen Sie das zentrale Bindegewebe zwischen den Lappen mit einer Pinzette. Schneiden Sie alle Verbindungen zu anderen Organen ab und heben Sie die Leber an.
5. Waschen Sie die Leber und tauchen Sie sie einige Sekunden lang in die vorgekühlte PBS + 3%ige P/S-Lösung. Geben Sie es dann in die vorgekühlte Tube von William's Complete Medium.
   HINWEIS: Blutung und Tod sorgen für die Durchblutung über die Hohlvene. Die Bestätigung für den Tod des Tieres kommt durch den Pneumothorax, der in dem Moment induziert wird, in dem die Leber explantiert und das Zwerchfell vollständig präpariert wird und bei der Untersuchung Atmung und Herzschlag nicht mehr funktionsfähig sind.

6. Reinigung der Hepatozyten

1. Unter der biologischen Haube die Leber in die Petrischale 100 mm mit den 15 mL kaltem Williams vollständigem Medium über eine Schale voller Eis geben.
2. Drücken Sie mit dem Schaber kräftig auf das Organ, um die Zellen im Medium freizusetzen.
   HINWEIS: Wenn die Verdauungsphase korrekt durchgeführt wird, sollte die Zellfreisetzung leicht sein und nicht viel Druck auf die Leber erfordern. Schneiden Sie die Leber nicht in Stücke; Lassen Sie es intakt. Wenn die Leber in das Medium eingetaucht wird, wird die Zellfreisetzung verbessert.
3. Sammeln Sie die mediumhaltigen Zellen und filtern Sie sie mit dem 100 μm Filter, während Sie sie in ein steriles konisches Röhrchen überführen. Die Filtration ermöglicht die Entfernung von Bindegewebe und unverdauten Gewebefragmenten.
4. Gießen Sie etwa 15 ml kaltes William's Complete Medium über die zerdrückte Leber in der Petrischale, um mehr Zellen freizusetzen. Wiederholen Sie die Schritte 6.2 und 6.3.
5. Nummer 6.4 mindestens einmal wiederholen, bis alle Zellen freigesetzt sind. Teilen Sie das Medium bei Bedarf in konische Röhrchen auf und verwenden Sie mehrere 100 μm Filter.
   HINWEIS: Nach der Freisetzung der Hepatozyten und vor dem Filtern sollte das Medium aufgrund des Vorhandenseins der Hepatozyten undurchsichtig aussehen. Die verbleibende Leber sollte faserig aussehen und wird verworfen.
6. Das filtrierte Medium, das Leberzellen enthält, wird 3 min lang bei 4 °C bei 4 °C mit einer Bremse mit niedriger Drehzahl zentrifugiert.
   HINWEIS: Hepatozyten sind dichter als andere Leberzellen. Aufgrund der geringen Zentrifugationskraft befinden sich nur Hepatozyten im Pellet, während andere Zellen im Überstand verbleiben.
7. Entsorgen Sie den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören. Geben Sie vorsichtig etwa 40 mL eiskaltes Williams vollständiges Medium in das Röhrchen und pipettieren Sie langsam 2 bis 3 Mal auf und ab, um das Zellpellet wieder zu suspendieren.
   HINWEIS: Das Zellpellet muss vorsichtig resuspendiert werden, um eine Beschädigung der Zellen zu vermeiden.
8. Bei 50 x g für 3 min bei 4 °C zentrifugieren.
   HINWEIS: Zählen Sie bei den ersten Versuchen die lebensfähigen Zellen nach der zweiten Zentrifugation mit einem 1:10-Trypanblau-Assay, bevor Sie mit den nächsten Schritten fortfahren. Auf diese Weise kann vermieden werden, dass Medien und Zeit verschwendet werden, wenn alle Zellen tot sind.
9. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 25 ml eiskaltem Williams vollständigem Medium.
10. Geben Sie 25 ml 90%ige Dichtegradientenlösung in das Röhrchen und mischen Sie es vorsichtig.
    HINWEIS: Eine Dichtegradientenlösung trennt lebensfähige Hepatozyten von toten Hepatozyten und Zelltrümmern basierend auf ihrer Dichte.
11. Zentrifugieren Sie bei 200 x g für 10 min bei 4 °C. Auf dem Boden des Röhrchens muss ein sichtbares Pellet erhalten werden, das den lebensfähigen Hepatozyten entspricht, und auf der Oberseite des Gradienten muss eine klare Schicht aus abgestorbenen Hepatozyten erhalten werden.
    HINWEIS: Wenn überhaupt kein Pellet vorhanden ist, versuchen Sie, die Lösung durch Schwenken erneut zu mischen und die Zentrifugation zu wiederholen.
12. Aspirieren Sie die abgestorbene Zellschicht von der Oberseite des Gradienten und belassen Sie 1-2 mL des Mediums mit dem Pellet.
13. Resuspendieren Sie das Pellet in 30-40 ml Williams vollständigem Medium.
    HINWEIS: Verwenden Sie für den gesamten Eingriff nur serologische 25-ml-Pipetten. Pipetten mit kleinerem Durchgang können die Lebensfähigkeit der Hepatozyten verringern. Alle Schritte sollten auf Eis durchgeführt werden, um +4 °C zu halten.
14. Bei 200 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren, dann den Überstand aspirieren.

7. Hepatozytenkultur und RNA-Entnahme

1. Fügen Sie eine angemessene Menge Medium für die Zellzählung hinzu. Zählen Sie die Zellviabilität mit 1:10 Trypanblau.
2. 2D-Hepatozytenkultur
   1. Plattenzellen in einer Konzentration von 500.000 Zellen/Vertiefung einer 6-Well-Schale auf einer kollagenbeschichteten Zellplatte mit vorgewärmtem Williams vollständigem Medium.
   2. Stellen Sie die Zellkultur in einen befeuchteten Inkubator mit 95 % Luft, 5 % CO₂ bei 37 °C.
   3. Wechseln Sie nach 4 h das Medium auf das neue vorgewärmte William's Complete Medium.
   4. Bewahren Sie die Zellen im Inkubator auf. Wechseln Sie das Medium täglich.
   5. Sammeln Sie primäre Hepatozyten in einem Reagenz für die RNA-Extraktion vor der Plattierung (Tag 0) und an den Tagen 1 bis 3 der Kultur.
   6. Extrahieren Sie die RNA gemäß dem Protokoll des Herstellers und transkribieren Sie sie in cDNA für die Bewertung von Lebermarkergenen mittels RT-qPCR. Die Liste der Grundierungen ist in Tabelle 2 dargestellt.
3. Für die 3D-Langzeit-Hepatozytenkultur:
   1. Resuspendieren Sie die Zellen in der kalten, reinen Matrix in einer Konzentration von 1.000-10.000 Zellen in 20 μL.
      HINWEIS: Versuchen Sie, die Bildung von Matrixblasen zu vermeiden.
   2. Mit vorgekühlten Pipettenspitzen werden die mit der Matrix enthaltenen Zelltröpfchen in eine vorgewärmte Zellkulturplatte gefüllt.
   3. Drehen Sie die Platte auf den Kopf und lassen Sie sie 20-30 min im Zellkultur-Inkubator.
   4. Drehen Sie es auf und fügen Sie das vorgewärmte 3D-Langzeit-Hepatozytenmedium und das spezifische Kulturmedium gemäß Pengs Arbeit^{hinzu 22}. Bewahren Sie die Zellen im Inkubator auf.
   5. Wechseln Sie das 3D-Langzeit-Hepatozytenmedium alle 2-3 Tage.
   6. Spätestens nach 14 Tagen Kultur werden die Hep-Orgs von der Matrix getrennt und lebensfähige Hep-Orgs werden mittels Trypanblau und EdU-Proliferationsassay bewertet und gemäß Pengs Arbeit passageiert.

Ergebnisse

Am Ende der Setup-Verfahren (Schritt 6.13) erhielten wir eine Zellausbeute von bis zu 1 x 10⁸ Zellen pro Isolation aus der Leber von etwa 300 g einer Ratte. Eine Zellviabilität zwischen 78 % und 97 % wurde durch Trypanblau-Zählung festgestellt.

Wie bereits in früheren Studien^{beschrieben 1,18,19}, verlieren primäre Hepatozyten in Kultur ihre Morphologie, ...

Diskussion

3D-Organoide sind eine Grenze für die personalisierte Medizin und ermöglichen eine langfristige Hepatozytenkultur. Die Qualität dieser innovativen Technik erfordert eine gute Ausbeute an lebensfähigen primären Hepatozyten und eine gut durchgeführte Leberperfusion und Hepatozytenisolierung. Dieses alte Verfahren ist immer noch weit verbreitet; Es umfasst jedoch verschiedene Schritte, die eine Herausforderung darstellen können. Als wir uns dem Verfahren näherten, stießen wir auf k...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
A83-01- ALK5 Inhibitor IV	Twin Helix	T3031
B27	Thermofisher Scientific	0080085SA
CFX Connect Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad
CHIR99021	Twin Helix	T2310
Click EdU Alexa 488 imaging kit	Thermofisher Scientific	C10499
Collagen, Type I, solution from rat tail	Merck	C3867-1VL
Dexamethasone	Merck	D4902
EGF	Merck	E9644
Fetal bovine serum (FBS)	Euroclone	ECS0180L
GELTREX LDEV FREE RGF BME	Thermofisher Scientific	A1413202
Heparin Sodium 25000 IU/5 ml	B. Braun Melsungen AG	B01AB01
HGF	Peprotech	100-39H
Insulin-Transferrin-Selenium solution 100x	Thermofisher Scientific	41400045
L-Glutamine solution	Euroclone	ECB3000D
Liver Digest Medium	Thermofisher Scientific	17703-034
Liver Perfusion Medium	Thermofisher Scientific	17701038
N2 supplement	Thermofisher Scientific	17502048
N-acetylcysteine	Merck	A9165
Nicotinamide	Merck	N-0636
Non-Essential Amino Acids	Merck	M7145
Normocin	Aurogene	ant-nr-1
PBS buffer 1X	PanReac AppliChem	A0964,9050
Penicillin-streptomycin solution 100x	Euroclone	ECB3001D
Percoll	Santa Cruz	sc-296039A
Peristaltic pump	Ismatec™	MS-4/12 Reglo Digital Pump
TNFa	Peprotech	300-01A
TRI Reagent	Merck	T9424
Tubing	Ismatec™	ID.2,79mm
Williams' E Medium, no glutamine	Thermofisher Scientific	31415029
Y27632	Twin Helix	T1725