JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

إن تحديد الحمض النووي الريبي والمؤشرات الحيوية للبروتين من الدموع في نماذج الفئران يحمل وعدا كبيرا للتشخيص المبكر في الأمراض المختلفة. توفر هذه المخطوطة بروتوكولا شاملا لتحسين فعالية وكفاءة mRNA وعزل البروتين من دموع الفئران.

Abstract

الفيلم المسيل للدموع هو سائل حيوي ديناميكي للغاية قادر على عكس التغيرات الجزيئية المرتبطة بالأمراض ، ليس فقط في سطح العين ولكن أيضا في الأنسجة والأعضاء الأخرى. يوفر التحليل الجزيئي لهذا السائل الحيوي طريقة غير جراحية لتشخيص الأمراض أو مراقبتها ، وتقييم فعالية العلاج الطبي ، وتحديد المؤشرات الحيوية المحتملة. نظرا لحجم العينة المحدود ، يتطلب جمع عينات المسيل للدموع مهارات محددة وأدوات مناسبة لضمان الجودة العالية والكفاءة القصوى. تم وصف منهجيات مختلفة لأخذ عينات الدموع في الدراسات البشرية. في هذه المقالة ، يتم تقديم وصف شامل لبروتوكول محسن ، مصمم خصيصا لاستخراج معلومات البروتين المرتبطة بالدموع من النماذج الحيوانية التجريبية ، وخاصة الفئران. تتضمن هذه الطريقة التحفيز الدوائي لإنتاج الدموع في الفئران البالغة من العمر شهرين ، تليها جمع العينات باستخدام شرائط شيرمر وتقييم فعالية وكفاءة البروتوكول من خلال الإجراءات القياسية ، SDS-PAGE ، qPCR ، و PCR الرقمي (dPCR). يمكن تكييف هذا البروتوكول بسهولة للتحقيق في توقيع البروتين المسيل للدموع في مجموعة متنوعة من النماذج التجريبية. من خلال إنشاء بروتوكول لأخذ عينات الدموع بأسعار معقولة وموحدة ومحسنة للنماذج الحيوانية ، كان الهدف هو سد الفجوة بين البحوث البشرية والحيوانية ، وتسهيل الدراسات الانتقالية وتسريع التقدم في مجال أبحاث أمراض العين والجهازية.

Introduction

تعتبر الدموع ترشيحا فائقا للبلازما وقد وصفت أيضا بأنها سائل وسيط بين مصل البلازما والسائل النخاعي بسبب التداخل الكبير في الجزيئات الحيوية التي تشترك فيها1. تم الإبلاغ عن أن الدموع البشرية تحتوي على البروتينات والدهون المسيلة للدموع والمستقلبات والكهارل2. في الآونة الأخيرة ، تم تحديد جزيئات حيوية أخرى مثل mRNAs و miRNAs والحويصلات خارج الخلية3،4،5،6،7.

في البشر ، توجد الدموع القاعدية في الفيلم المسيل للدموع ، والذي يتكون من ثلاث طبقات: طبقة الدهون الخارجية ، التي تحافظ على سطح المسيل للدموع على نحو سلس للسماح لنا بالرؤية من خلاله ومنع تبخر الدموع. الطبقة المائية الوسطى ، التي تحافظ على رطوبة العين ، تصد البكتيريا ، وتحمي القرنية ، وتشكل 90 ٪ من الفيلم المسيل للدموع ؛ وأخيرا ، طبقة الميوسين ، وهي عائلة من البروتينات عالية الوزن الجزيئي التي تتلامس مع القرنية وتسمح للدموع بالالتصاق بالعين8. يبدأ توزيع الدموع عبر سطح العين بإفراز من الغدة الدمعية. ثم يتم توجيه هذا السائل عبر القنوات الدمعية ليمر فوق سطح العين ويتدفق إلى قنوات الصرف. تسمح كل طرفة للدموع بالانتشار بالتساوي على العين بأكملها ، مما يحافظ على رطوبتها9.

الفيلم المسيل للدموع هو سائل حيوي ديناميكي للغاية قادر على عكس التغيرات الجزيئية التي تحدث ليس فقط على سطح العين ولكن أيضا في الأنسجة والأعضاء الأخرى. يمثل تحليل التعبير التفاضلي في هذا السائل الحيوي نهجا واعدا لاكتشاف المؤشرات الحيوية في الأمراض البشرية10,11. تم تسهيل استخدام الفيلم المسيل للدموع كمصدر للمؤشرات الحيوية للتشخيص المبكر في مختلف الأمراض إلى حد كبير من خلال وجود طرق جمع غير جراحية. تتضمن الطريقة الأكثر شيوعا لجمع الدموع في العيادات البشرية والبيطرية الدعم القائم على الغشاء (شريط شيرمر) ، والذي يعمل على مبدأ العمل الشعري ، مما يسمح للماء في الدموع بالانتقال على طول شريط اختبار الورق أو الأنابيب الشعرية الموضوعة في كيس الملتحمة السفلي للموضوع12،13،14. على الرغم من القيود المتأصلة في الحصول على حجم عينة صغير من خلال هذه الطريقة ، فإن التحليل الكيميائي الحيوي لتكوين المسيل للدموع باستخدام تقنيات حساسة مختلفة قد سهل تحديد جزيئات العلامات الحيوية المحتملة11,15. تم توثيق بروتوكولات تحسين وتقييم شطف البروتينات المسيلة للدموع من شرائط شيرمر والشعيرات الدموية في المرضى من البشربشكل جيد 16,17. ومع ذلك ، تتوفر أوصاف كاملة للبروتوكولات المحسنة المصممة خصيصا لاستخراج المعلومات الجزيئية المتعلقة بالدموع من النماذج الحيوانية التجريبية ولكنها نادرة. الطرق الحالية ، مثل تحريض المسيل للدموع من خلال التحفيز المباشر للغدة الدمعية18 ، مع السماح بجمع كميات أكبر ، هي طرق غازية ويمكن أن تسبب إزعاجا للحيوانات. تم وصف الطرق غير الغازية ، مثل جمع الدموع من سطح العين ، كطريقة لعزل الحمض النووي و miRNAs19,21.

يهدف هذا البروتوكول إلى إنشاء طريقة فعالة من حيث التكلفة ومحسنة لجمع ومعالجة الدموع في الفئران. تعطي الطريقة الأولوية لعدم التدخل الجراحي مع الحصول على كميات كافية من الدموع مناسبة للتحليل الجزيئي من خلال تقنيات مثل SDS-PAGE و qPCR و dPCR. يمكن بعد ذلك استخدام معلومات محتوى البروتين المستخرج والحمض النووي الريبوزي المرسال لتحديد المؤشرات الحيوية المحتملة في النماذج التجريبية الحالية للمرض.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الموضحة هنا من قبل لجنة أخلاقيات في Cinvestav (CICUAL، # 0354/23). تمت معالجة المختبر والتعامل معها بما يتفق بدقة مع إرشادات استخدام الخاصة بالمجلة ووفقا لبيان جمعية أبحاث الرؤية وطب العيون (ARVO) لاستخدام في أبحاث العيون والرؤية. تم تقييم صحة العين قبل وبعد الإجراءات من خلال تقييم إفرازات العين وتورم الجفون وتشوهات العين والتغيرات السلوكية.

1. وإعداد الكاشف

  1. استخدم ثلاثة فئران ذكور C57BL / 6 تبلغ من العمر شهرين لكل نسخة مكررة لإجراء العملية ، بوزن يبدأ من ~ 25 جم (الشكل 1). قم بمعالجة كل ماوس على حدة وضعه على وسادة تدفئة للحفاظ على الدفء.
  2. للحث على إفراز الدموع ، قم بإعداد محلول مرق من بيلوكاربين عند 20 ملغ / مل باستخدام الماء المعقم.
  3. اقطع شرائط اختبار شيرمر بطول 5 مم وثني كل شريط عند الشق بزاوية 90 درجة.
  4. تحضير 250 ميكرولتر من الماء المعقم مع مثبط الأنزيم البروتيني (1 قرص لمدة 50 مل ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة).

2. تحفيز إنتاج المسيل للدموع وجمعها

  1. وزن كل فأر على حدة لحساب الجرعة المناسبة من العلاجات.
  2. لتحفيز إنتاج الدموع، يتم تطبيق 30 ملغ/كغ من بيلوكاربين داخل الصفاق بواسطة حقنة أنسولين 6 مم (الشكل 1ب). انتظر لمدة 2 دقيقة بعد حقن المخدرات حتى تظهر آثاره.
    ملاحظة: تعذر الحصول على بيانات من غير المحفزة بسبب محدودية توافر السائل المسيل للدموع.
  3. اجمع الدموع عن طريق وضع نهاية كل جزء من شريط شيرمر فوق مركز الجفن السفلي بزوج من الملقط واحتفظ به في مكانه حتى يصل المسيل للدموع إلى حد الشريط (الشكل 1 ج). ثم استبدل الشريط. ضع 2 شريط شيرمر بالتتابع في كل عين ، مع فاصل زمني مدته 2 دقيقة بين الشرائط للتجميع. تتطلب عملية جمع المسيل للدموع حوالي أربع شظايا شريطية تزيد عن 10 دقائق لكل فأر.
  4. ضع شظايا شريط شيرمر في أنابيب معقمة على الثلج لتجنب تدهور المكونات. بمجرد انتهاء المجموعة ، ابدأ معالجة المسيل للدموع.

3. عزل البروتين

  1. ضع شظايا الشريط في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 600 ميكرولتر يحتوي على 20 ميكرولتر من الماء المعقم مع مثبط الأنزيم البروتيني وأجهزة طرد مركزي لمدة 1 ساعة عند 600 × جم عند 4 درجات مئوية ، كما هو موضح سابقا17 (الشكل 1 د).
  2. قم بعمل ثقب باستخدام إبرة حاقن من الفولاذ المقاوم للصدأ مقاس 7.5 سم عند طرف الأنبوب سعة 600 ميكرولتر الذي يحتوي على العينة (الشكل 1E). بعد ذلك ، انقل هذا الأنبوب المثقوب إلى أنبوب معقم جديد سعة 1.5 مل وطرد مركزي العينات عند 12000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية ، كما ورد سابقا17 ، لاستعادة حجم الدموع المخففة. سيكون حجم الفيلم المسيل للدموع (طاف) في الجزء السفلي من الأنبوب.
  3. قم بإنشاء تجمع بروتين من خلال الجمع بين المادة الطافية المستردة من جميع العينات. في هذه التجربة ، تم الحصول على حجم إجمالي يبلغ حوالي 200 ميكرولتر.
    ملاحظة: يمكن أن يستمر إنتاج المسيل للدموع لأكثر من 1 ساعة. خلال هذا الوقت ، لا يزال من الممكن جمع الدموع.
  4. حدد محتوى البروتين الكلي للتجمع المسيل للدموع باستخدام طريقة برادفورد القياسية22.

4. تحليل SDS-PAGE

  1. سخني عينات البروتين على حرارة 99 درجة مئوية لمدة 4 دقائق لتشويه البروتينات. دوامة العينات لفترة وجيزة لخلط المكونات.
  2. قم بتحميل 30 ميكروغرام من محتوى البروتين الكمي من كل عينة على هلام SDS-PAGE بنسبة 10٪ (الجدول 1) وقم بتشغيل العينات عند 90 فولت لمدة 2 ساعة باستخدام الطريقة القياسية23.
  3. بعد الرحلان الكهربائي ، قم بتغطية الجل بمحلول تلطيخ (الجدول 1) واحتضانه لمدة 30 دقيقة لتلطيخ البروتينات.
  4. شطف الجل بمحلول إزالة البقع عدة مرات حتى تصبح الخلفية واضحة وتكون أشرطة البروتين مرئية.
  5. الحصول على الصور مع نظام توثيق هلام.

5. عزل mRNA ل qPCR و PCR الرقمي

  1. ضع الشرائط في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 600 ميكرولتر يحتوي على 20 ميكرولتر من الماء المعقم. قم بعمل ثقب في طرف الأنبوب الذي يحتوي على العينة ، وضعها في أنبوب معقم جديد سعة 1.5 مل ، وأجهزة طرد مركزي ، كما ورد سابقا في دموع الإنسان3 ، لمدة 20 دقيقة عند 2000 × جم عند 4 درجات مئوية (الشكل 1E-H).
  2. إنشاء تجمع من جميع العينات. كان الحجم المستعاد لهذه التجربة حوالي 22 ميكرولتر من المادة الطافية لكل فأر ، أي 66 ميكرولتر من الحجم الكلي. ضع الأنابيب على الثلج الجاف لتجنب تدهور الجزيئات الحيوية.
  3. أضف 200 ميكرولتر من محلول أحادي الطور من الفينول وأيزوثيوسيانات الغوانيدينيوم (تم الحصول عليها تجاريا) وقم بالتجانس عن طريق الماصة. اتركه لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. في هذه الخطوة ، يمكن تخزين العينات في -20 درجة مئوية لعدة أسابيع أو -70 درجة مئوية لعدة أشهر.
  4. أضف 40 ميكرولتر من الكلوروفورم واخلطه في دوامة لمدة 15 ثانية. واسمحوا الوقوف لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. جهاز طرد مركزي عند 10000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  5. انقل الطور المائي بعناية (دون أخذ الطور البيني) إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل.
  6. أضف 0.5 ميكرولتر من الجليكوجين (0.05 ميكروغرام / ميكرولتر) إلى 100 ميكرولتر من الأيزوبروبانول واخلطه عن طريق الماصة. يتم ترسيب الجليكوجين مع الحمض النووي الريبي ولا يتداخل مع الخطوات اللاحقة.
  7. اتركه لمدة 10 دقائق عند -20 درجة مئوية. أجهزة الطرد المركزي عند 10000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. صب بسرعة طاف.
  8. أضف 200 ميكرولتر من الإيثانول البارد بنسبة 75٪ وأعد تعليق حبيبات الحمض النووي الريبي عن طريق الدوامة. جهاز طرد مركزي عند 8000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  9. صب الإيثانول. بدون قلب الأنبوب ، اتركه يجف في الهواء لمدة 20-30 دقيقة. أضف 20 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase وأعد التوزيع.
  10. تابع قراءة الكثافة الضوئية في مقياس الطيف الضوئي microvolume عند 260 نانومتر و 280 نانومتر لتقييم نقاء الحمض النووي الريبي. يجب أن تكون العينات على الجليد.
    ملاحظة: لا يمكن ملاحظة النطاقات الريبوسومية 28S و 18S باستخدام هلام الأغاروز بسبب طبيعة العينة. يمكن تحليل وجود الحمض النووي الريبي الآخر ، مثل miRNAs أو mRNAs ، باستخدام محلل حيوي ، كما هو موضح سابقا18.
  11. توليف cDNA من الحمض النووي الريبي الدموع باستخدام مجموعة تجارية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
    1. ابدأ بإدخال الحمض النووي الريبي في نطاق من 10 نانوغرام -5000 نانوغرام ؛ وفقا للمجموعة المستخدمة ، امزجها مع 1 ميكرولتر من Oligo (dT) وما يصل إلى 12 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase. قم بتدويره عند 500 × جم لمدة 30 ثانية واحتضانه عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    2. أضف إلى أنبوب الخلط 4 ميكرولتر من مخزن التفاعل 5x ، و 1 ميكرولتر من مثبط RNase ، و 2 ميكرولتر من مزيج dNTP ، و 1 ميكرولتر من النسخ العكسي.
    3. أدر الأنبوب عند 500 × جم لمدة 30 ثانية لسحب الخليط لأسفل. ثم احتضان الأنبوب على حرارة 42 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. قم بإنهاء التفاعل عن طريق احتضان الأنبوب عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  12. نظرا لانخفاض تركيز mRNA في الدموع ، يوصى باستخدام cDNA غير المخفف ل qPCR24. لهذه التجربة ، تم استخدام 150 نانوغرام من cDNA. قم بإجراء qPCR باستخدام بادئات DNMT3a :
    إلى الأمام: GCCGAATTGTGTCTTGGTGGATGACA ، العكس: CCTGGTGGAATGCACTGCAGAAGGA و GAPDH التمهيدي:
    إلى الأمام: ACTGGCATGGCCTTCCGTGTTCTTA ، عكس: TCAGTGTAGCCCAAGATGCCCTTC باتباع التعليمات من الشركات المصنعة وإجراءات المعدات.
    1. بالنسبة لدورة qPCR ، استخدم البرنامج التالي: تمسخ أولي: 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق تليها 45 دورة من C 95 درجة مئوية - 15 ثانية ، 60 درجة مئوية - 30 ثانية ، و 72 درجة مئوية - 30 ثانية ، تنتهي بتمديد نهائي عند 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    2. قم بإجراء تحليل منحنى الذوبان لتقييم وجود دايمرات أولية أو مضخمات غير محددة في التفاعل. بدأ منحدر درجة الحرارة من 50 درجة مئوية إلى 99 درجة مئوية نهائية ، مع تعليق أولي قدره 90 ثانية للخطوة الأولى وعقد 5 ثوان بين كل خطوة.
    3. بالنسبة إلى dPCR25 ، قم بإجراء التخفيفات التسلسلية لتحسين كمية cDNA المطلوبة للكشف عن mRNA محل الاهتمام. في هذه التجربة، استخدم التخفيفات التالية من الحمض النووي المكمل (cDNA) في الماء الخالي من النيوكلياز: 150 نانوغرام، و75 نانوغرام، و37.5 نانوغرام، و18.75 نانوغرام من الحمض النووي المكمل (cDNA). تم استخدام الاشعال ل DNMT3a المذكورة سابقا. بالنسبة لدورة dPCR ، استخدم البرنامج التالي: تمسخ أولي: 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة تليها 40 دورة من 95 درجة مئوية - 15 ثانية و 60 درجة مئوية - 30 ثانية.

النتائج

يوفر البروتوكول الموصوف في هذه الورقة طريقة سهلة وبأسعار معقولة للحصول على المعلومات الجزيئية من السائل المسيل للدموع باستخدام التقنيات المتاحة بشكل شائع في معظم مختبرات البيولوجيا الجزيئية. علاوة على ذلك ، يمكن توسيع نطاق البروتوكول من خلال استخدام تقنيات حساسة للغاية مثل ELISA للكشف عن ...

Discussion

يمكن الوصول بسهولة إلى السائل المسيل للدموع ، ويمكن استخدام تحديد المؤشرات الحيوية في الدموع كتقنية تكميلية ناجحة للتشخيص المبكر لمختلف الأمراض البشرية27. في حين أن التحليل الكيميائي الحيوي لتكوين الدموع في النماذج الحيوانية التجريبية يكمل هذا النهج ويعد بتقدم كبير في فهم ا...

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل VELUX STIFTUNG [مشروع 1852] إلى ML ومنح زمالة الدراسات العليا من CONAHCYT إلى M.B. (836810) و E.J.M.C. (802436) و A.M.F (CVU 1317418). خالص الامتنان لجميع أعضاء المختبر، ومركز البحوث في المستقبل، وقسم الفارماكوبيولوجيا (Cinvestav) لمساهماتهم في المناقشات المحفزة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2-mercaptoethanolGibco1985023
2x Laemmli bufferBio-Rad16-0737
Acetic AcidQuimica Meyer64-19-7
AcrylamideSigma-AldrichA4058
Bradford ReagentSigma-AldrichB6916
ChloroformSigma-Aldrich1003045143
Coomassie Blue R 250US Biological6104-59-2
EthanolQuimica Rique64-17-5
GeneRuler 1kb plus DNA LadderThermofisher scientificSM1331
GlycerolUS BiologicalG8145
GlycineSANTA CRUZSC- 29096
GlycogenRoche10901393001
HClQuimica Rique7647-01-0
Isopropyl alcoholQuimica Rique67-63-0
MethanolQuimica Meyer67-56-1
Micro tubes 1.5 mlAxygenMCT-150-C
Micro tubes 600 µlAxygenMCT-060-C
NaClSigma-AldrichS3014
PCR tubes & stripsNovasbioPCR 0104
PilocarpineSigma-AldrichP6503-10g
Protease inhibitorRoche11873580001
QIAcuity EvaGreen PCR Kit (5mL)Qiagen250112
QIAcuity Nanoplate 26k 24-well (10)Qiagen250001
Real qPlus 2x Master Mix GreenAmpliqonA323402
RevertAid First Strad cDNA Synthesis KitThermofisher scientificK1622
Schirmer's test stripsLaboratorio SantgarSANT1553
SDSSigma-AldrichL3771
TEMEDSigma aldrich102560430
TRI reagentSigma-AldrichT9424-200MLmonophasic solution of phenol and guanidinium isothiocyanate
TrisUS BiologicalT8650
Tris baseChem Cruzsc-3715A

References

  1. Ravishankar, P., Daily, A. Tears as the next diagnostic biofluid: A comparative study between ocular fluid and blood. Appl Sci. 12 (6), 2884 (2022).
  2. Masoudi, S. Biochemistry of human tear film: A review. Exp Eye Res. 220, 109101 (2022).
  3. Dara, M., et al. Novel RNA extraction method from human tears. Mol Biol Res Commun. 11 (4), 167-172 (2022).
  4. Amorim, M., et al. Putative biomarkers in tears for diabetic retinopathy diagnosis. Front Med (Lausanne). 9, 873483 (2022).
  5. Arslan, M. A., et al. Expanded biochemical analyses of human tear fluid: Polyvalent faces of the Schirmer strip. Exp Eye Res. 237, 109679 (2023).
  6. Liu, R., et al. Analysis of th17-associated cytokines and clinical correlations in patients with dry eye disease. PloS one. 12 (4), e0173301 (2017).
  7. Cross, T., et al. Rna profiles of tear fluid extracellular vesicles in patients with dry eye-related symptoms. Int J Mol Sci. 24 (20), 15390 (2023).
  8. Paranjpe, V., Phung, L., Galor, A. The tear film: Anatomy and physiology. Ocular Fluid Dyn: Anat, Physiol, Imaging Tech, and Math Model. , 329-345 (2019).
  9. Jung, J. H., et al. Proteomic analysis of human lacrimal and tear fluid in dry eye disease. Sci Rep. 7 (1), 13363 (2017).
  10. Di Zazzo, A., Micera, A., De Piano, M., Cortes, M., Bonini, S. Tears and ocular surface disorders: Usefulness of biomarkers. J Cell Physiol. 234 (7), 9982-9993 (2019).
  11. Von Thun Und Hohenstein-Blaul, N., Funke, S., Grus, F. H. Tears as a source of biomarkers for ocular and systemic diseases. Exp Eye Res. 117, 126-137 (2013).
  12. Pieczynski, J., Szulc, U., Harazna, J., Szulc, A., Kiewisz, J. Tear fluid collection methods: Review of current techniques. Eur J Ophthalmol. 31 (5), 2245-2251 (2021).
  13. Shiraki, T., Shigeta, M., Tahara, N., Furukawa, H., Ohtsuka, H. A tear production assessment by using Schirmer tear test strips in mice, rats and dogs. Animal Eye Res. 24 (1-2), 1-5 (2005).
  14. Zhao, J., Nagasaki, T. Lacrimal gland as the major source of mouse tear factors that are cytotoxic to corneal keratocytes. Exp Eye Res. 77 (3), 297-304 (2003).
  15. Khanna, R. K., et al. Metabolomics and lipidomics approaches in human tears: A systematic review. Surv Ophthalmol. 67 (4), 1229-1243 (2022).
  16. Bachhuber, F., Huss, A., Senel, M., Tumani, H. Diagnostic biomarkers in tear fluid: From sampling to preanalytical processing. Sci Rep. 11 (1), 10064 (2021).
  17. Koduri, M. A., et al. Optimization and evaluation of tear protein elution from Schirmer's strips in dry eye disease. Indian J Ophthalmol. 71 (4), 1413-1419 (2023).
  18. Kakan, S. S., et al. Tear miRNAs identified in a murine model of sjogren's syndrome as potential diagnostic biomarkers and indicators of disease mechanism. Front Immunol. 13, 833254 (2022).
  19. Moore, M., Ma, T., Yang, B., Verkman, A. Tear secretion by lacrimal glands in transgenic mice lacking water channels aqp1, aqp3, aqp4 and aqp5. Exp Eye Res. 70 (5), 557-562 (2000).
  20. Balafas, E., et al. A noninvasive ocular (tear) sampling method for genetic ascertainment of transgenic mice and research ethics innovation. OMICS. 23 (6), 312-317 (2019).
  21. Nakagawa, A., Nakajima, T., Azuma, M. Tear miRNA expression analysis reveals mir-203 as a potential regulator of corneal epithelial cells. BMC Ophthalmol. 21 (1), 377 (2021).
  22. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  23. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular cloning: A laboratory manual. , (1989).
  24. RealQPlus2x Master Mix Green without ROX. Ampliqon Available from: https://ampliqon.com/en/pcr-enzymes/pcr-enzymes/real-time-pcr/realq-plus-2x-master-mix-green (2023)
  25. Qiagen. Quick-Start Protocol QIAcuity EG PCR Kit. Qiagen. , (2023).
  26. Anier, K., Malinovskaja, K., Aonurm-Helm, A., Zharkovsky, A., Kalda, A. DNA methylation regulates cocaine-induced behavioral sensitization in mice. Neuropsychopharmacology. 35 (12), 2450-2461 (2010).
  27. Hagan, S., Martin, E., Enriquez-De-Salamanca, A. Tear fluid biomarkers in ocular and systemic disease: Potential use for predictive, preventive, and personalized medicine. EPMA J. 7 (1), 15 (2016).
  28. Gasparini, M. S., et al. Identification of sars-cov-2 on the ocular surface in a cohort of covid-19 patients from Brazil. Exp Biol Med. 246 (23), 2495-2501 (2021).
  29. Sebbag, L., Harrington, D. M., Mochel, J. P. Tear fluid collection in dogs and cats using ophthalmic sponges. Vet Ophthalmol. 21, 249-254 (2018).
  30. Abusharha, A. A., et al. Analysis of basal and reflex human tear osmolarity in normal subjects: assessment of tear osmolarity. Ther Adv Ophthal. 10, 2515841418794886 (2018).
  31. Fullard, R. J., Snyder, C. Protein levels in nonstimulated and stimulated tears of normal human subjects. Inves Opht Vis Sci. 31 (6), 1119-1126 (1990).
  32. Longwell, A., Birss, S., Keller, N., Moore, D. Effect of topically applied pilocarpine on tear film pH. J Pharm Sci. 65 (11), 1654-1657 (1976).
  33. Dartt, D. A. Neural regulation of lacrimal gland secretory processes: relevance in dry eye diseases. Prog Ret Eye Res. 28 (3), 155-177 (2009).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 209

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved