אופטימיזציה של איסוף דמעות בעכברים לצורך mRNA וניתוח חלבונים

Summary

זיהוי סמנים ביולוגיים של RNA וחלבונים מדמעות במודלים של עכברים טומן בחובו הבטחה גדולה לאבחון מוקדם במחלות שונות. כתב יד זה מספק פרוטוקול מקיף למיטוב היעילות והיעילות של mRNA ובידוד חלבונים מדמעות עכברים.

Abstract

סרט הדמעות הוא נוזל ביולוגי דינמי ביותר המסוגל לשקף שינויים מולקולריים הקשורים לפתולוגיה, לא רק בפני השטח של העין אלא גם ברקמות ואיברים אחרים. ניתוח מולקולרי של נוזל ביולוגי זה מציע דרך לא פולשנית לאבחן או לפקח על מחלות, להעריך את יעילות הטיפול הרפואי ולזהות סמנים ביולוגיים אפשריים. בשל נפח הדגימה המוגבל, איסוף דגימות דמעות דורש מיומנויות ספציפיות וכלים מתאימים כדי להבטיח איכות גבוהה ויעילות מרבית. מתודולוגיות שונות של דגימת דמעות תוארו במחקרים בבני אדם. במאמר זה מוצג תיאור מקיף של פרוטוקול ממוטב, המותאם במיוחד לחילוץ מידע חלבוני הקשור לדמעות ממודלים ניסיוניים של בעלי חיים, במיוחד עכברים. שיטה זו כוללת גירוי תרופתי של ייצור דמעות בעכברים בני חודשיים, ולאחר מכן איסוף דגימות באמצעות רצועות Schirmer והערכת היעילות והיעילות של הפרוטוקול באמצעות הליכים סטנדרטיים, SDS-PAGE, qPCR ו- PCR דיגיטלי (dPCR). פרוטוקול זה יכול להיות מותאם בקלות לחקר חתימת חלבון הדמעות במגוון פרדיגמות ניסיוניות. על ידי קביעת פרוטוקול דגימת דמעות במחיר סביר, סטנדרטי וממוטב עבור מודלים של בעלי חיים, המטרה הייתה לגשר על הפער בין מחקר בבני אדם למחקר בבעלי חיים, להקל על מחקרים תרגומיים ולהאיץ את ההתקדמות בתחום חקר מחלות עיניים ומחלות מערכתיות.

Introduction

דמעות נחשבות לאולטרה-פילטרט פלזמה ותוארו גם כנוזל ביניים בין סרום הפלזמה לנוזל השדרה בשל חפיפה משמעותית בביומולקולות שהן חולקות¹. דווח כי דמעות אנושיות מכילות חלבונים, שומנים מדמעות, מטבוליטים ואלקטרוליטים². לאחרונה זוהו גם ביומולקולות אחרות כגון mRNA, miRNA ושלפוחיות חוץ-תאיות 3,4,5,6,7.

בבני אדם, קרעים בזאליים ממוקמים בסרט הדמעות, המורכב משלוש שכבות: שכבת השומנים החיצונית, השומרת על משטח הדמעה חלק כדי לאפשר לנו לראות דרכו ולמנוע אידוי דמעות; השכבה המימית האמצעית, השומרת על לחות העין, דוחה חיידקים, מגנה על הקרנית ומהווה 90% מסרט הדמעות; ולבסוף, שכבת המוצין, משפחה של חלבונים בעלי משקל מולקולרי גבוה הנמצאים במגע עם הקרנית ומאפשרים לדמעה להיצמד לעין⁸. פיזור הדמעות על פני משטח העין מתחיל בהפרשה מבלוטת הדמעות. נוזל זה מונחה דרך צינורות דמעות כדי לעבור מעל פני השטח של העין ולזרום לתוך תעלות ניקוז. כל מצמוץ מאפשר לדמעות להתפזר באופן שווה על פני כל העין, ושומר אותה לחה⁹.

סרט הדמעות הוא נוזל ביולוגי דינמי ביותר המסוגל לשקף שינויים מולקולריים המתרחשים לא רק על פני השטח של העין אלא גם ברקמות ואיברים אחרים. ניתוח הביטוי הדיפרנציאלי בנוזל ביולוגי זה מייצג גישה מבטיחה לגילוי סמנים ביולוגיים במחלות אנושיות^10,11. השימוש בסרט הדמעות כמקור לסמנים ביולוגיים לאבחון מוקדם בפאתולוגיות שונות הקל מאוד על ידי נוכחותן של שיטות איסוף לא פולשניות. השיטה הנפוצה ביותר לאיסוף קרעים במרפאות אנושיות ווטרינריות כוללת תמיכה מבוססת קרום (רצועת שירמר), הפועלת על עקרון הפעולה הנימית, ומאפשרת למים בקרעים לנוע לאורך רצועת בדיקה מנייר או צינורות נימים הממוקמים בשק הלחמית התחתון של הנבדק 12,13,14. למרות המגבלה המובנית של קבלת נפח דגימה קטן בשיטה זו, הניתוח הביוכימי של הרכב הדמעות באמצעות טכניקות רגישות שונות הקל על זיהוי מולקולות סמנים ביולוגיים פוטנציאליים^11,15. פרוטוקולים לאופטימיזציה והערכה של פליטת חלבוני דמעות מרצועות ונימים של שירמר בחולים אנושיים מתועדים היטב^16,17. עם זאת, תיאורים מלאים של פרוטוקולים ממוטבים שתוכננו במיוחד כדי לחלץ מידע מולקולרי הקשור לדמעות ממודלים ניסיוניים של בעלי חיים זמינים אך נדירים. שיטות קיימות, כגון השראת דמעות באמצעות גירוי ישיר של בלוטת הדמעות¹⁸, תוך מתן אפשרות לאיסוף נפחים גדולים יותר, הן פולשניות ועלולות לגרום אי נוחות לבעלי החיים. שיטות לא פולשניות, כגון איסוף קרעים משטח העין, תוארו כדרך לבודד DNA ו- miRNA^19,21.

פרוטוקול זה נועד לבסס שיטה חסכונית ואופטימלית לאיסוף ועיבוד דמעות בעכברים. השיטה נותנת עדיפות ללא-פולשניות תוך השגת נפחי דמעות מספיקים המתאימים לאנליזה מולקולרית באמצעות טכניקות כמו SDS-PAGE, qPCR ו-dPCR. לאחר מכן ניתן להשתמש במידע על תכולת החלבון וה-mRNA המופק כדי לזהות סמנים ביולוגיים פוטנציאליים במודלים ניסיוניים קיימים של מחלות.

Protocol

כל הנהלים המתוארים כאן אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים של Cinvestav (CICUAL, # 0354/23). חיות המעבדה טופלו וטופלו בהתאם קפדני להנחיות השימוש בבעלי חיים של כתב העת ובהתאם להצהרת האגודה לחקר הראייה והעיניים (ARVO) לשימוש בבעלי חיים בחקר העיניים והראייה. בריאות העין לפני ואחרי ההליכים הוערכה על ידי הערכת הפרשות עיניות, עפעפיים נפוחים, הפרעות עיניות ושינויים התנהגותיים.

1. בעלי חיים והכנת מגיבים

1. השתמשו בשלושה עכברים זכרים C57BL/6 בני חודשיים לכל שכפול לצורך ההליך, עם משקל התחלתי של ~25 גרם (איור 1). עבד כל עכבר בנפרד והנח אותו על כרית חימום כדי לשמור על חום.
2. כדי לגרום להפרשת דמעות, להכין תמיסת מלאי של פילוקרפין ב 20 מ"ג / מ"ל באמצעות מים סטריליים.
3. חתכו את רצועות הבדיקה של שירמר לאורך של 5 מ"מ וכופפו כל רצועה בחריץ לזווית של 90°.
4. להכין 250 μL של מים סטריליים עם מעכב פרוטאז (1 טבליה עבור 50 מ"ל, על פי הוראות היצרן).

2. גירוי ואיסוף ייצור דמעות

1. שקול כל עכבר בנפרד כדי לחשב את המינון המתאים של הטיפולים.
2. כדי לעורר ייצור דמעות, יש לתת 30 מ"ג/ק"ג של פילוקרפין תוך צפקית באמצעות מזרק אינסולין בקוטר 6 מ"מ (איור 1B). המתן 2 דקות לאחר הזרקת התרופה כדי שהשפעותיה יבואו לידי ביטוי.
   הערה: לא היתה אפשרות להשיג נתונים מבעלי חיים לא מגורים עקב הזמינות המוגבלת של נוזל דמעות.
3. אספו את הדמעות על-ידי הנחת הקצה של כל קטע רצועת שירמר על מרכז העפעף התחתון בעזרת זוג פינצטות ושמרו אותו במקומו עד שהקרע יגיע לגבול הרצועה (איור 1C). לאחר מכן, החלף את הרצועה. מניחים ברצף 2 רצועות שירמר בכל עין, עם מרווח של 2 דקות בין רצועות לאיסוף. תהליך איסוף הדמעות דורש כארבעה שברי רצועה במשך 10 דקות לכל עכבר.
4. הניחו את שברי רצועת שירמר בצינורות סטריליים על קרח כדי למנוע התפרקות של רכיבים. ברגע שהקולקציה מסתיימת, התחילו בעיבוד הדמעות.

3. בידוד חלבונים

1. הניחו את שברי הרצועה בצינור מיקרוצנטריפוגה של 600 μL המכיל 20 μL של מים סטריליים עם מעכב פרוטאז וצנטריפוגה למשך שעה אחת ב-600 x גרם ב-4°C, כפי שמוצג קודם לכן¹⁷ (איור 1D).
2. צרו נקב באמצעות מחט מזרק נירוסטה בקוטר 7.5 ס"מ בקצה הצינור בגודל 600 μL שמכיל את הדגימה (איור 1E). לאחר מכן, העבירו את הצינור המנוקב הזה לצינור מעוקר חדש של 1.5 מ"ל וצנטריפוגו את הדגימות ב -12,000 x גרם למשך 10 דקות ב -4 מעלות צלזיוס, כפי שדווח קודם לכן¹⁷, כדי לשחזר את נפח הדמעות המדוללות. נפח סרט הדמעות (סופרנטנט) יהיה בתחתית הצינור.
3. יצירת מאגר חלבונים על ידי שילוב הסופרנאטנט שנאסף מכל הדגימות. בניסוי זה התקבל נפח כולל של כ-200 μL.
   הערה: ייצור הדמעות יכול להימשך יותר משעה. במהלך תקופה זו, עדיין ניתן לאסוף דמעות.
4. כמת את תכולת החלבון הכוללת של בריכת הדמעות באמצעות שיטה^{סטנדרטית ברדפורד 22}.

4. ניתוח SDS-PAGE

1. חממו את דגימות החלבון בטמפרטורה של 99°C למשך 4 דקות כדי לנטרל את החלבונים. מערבלים את הדגימות בקצרה כדי לערבב את הרכיבים.
2. טען 30 מיקרוגרם של תכולת חלבון מכומת מכל דגימה לג'ל SDS-PAGE 10% (טבלה 1) והפעל את הדגימות במתח של 90 וולט למשך שעתיים בשיטה סטנדרטית²³.
3. לאחר אלקטרופורזה, מכסים את הג'ל בתמיסת צביעה (טבלה 1) ודגרים במשך 30 דקות כדי להכתים את החלבונים.
4. שוטפים את הג'ל בתמיסת העיכוב מספר פעמים עד שהרקע מתבהר ורצועות חלבון נראות לעין.
5. לרכוש תמונות עם מערכת תיעוד ג'ל.

5. בידוד mRNA עבור qPCR ו- PCR דיגיטלי

1. מניחים את הרצועות בתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 600 μL המכיל 20 μL של מים סטריליים. עשו נקב בקצה הצינור שמכיל את הדגימה, הכניסו אותו לצינור מעוקר חדש של 1.5 מ"ל, וצנטריפוגה, כפי שדווח בעבר בדמעות אדם³, למשך 20 דקות ב-2,000 x גרם ב-4°C (איור 1E-H).
2. צור מאגר מכל הדוגמאות. הנפח המשוחזר של ניסוי זה היה בערך 22 μL של supernatant עבור כל עכבר, כלומר, 66 μL של נפח כולל. הניחו את הצינורות על קרח יבש כדי למנוע התפרקות של ביומולקולות.
3. הוסף 200 μL של תמיסה מונופאזית של פנול ו guanidinium isothiocyanate (מתקבל מסחרית) הומוגניזציה על ידי pipetting. תן לעמוד במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. בשלב זה, דגימות ניתן לאחסן ב -20 ° C במשך מספר שבועות או -70 ° C במשך מספר חודשים.
4. מוסיפים 40 μL של כלורופורם ומערבבים במערבולת במשך 15 שניות. תן לעמוד במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה ב-10,000 x גרם למשך 15 דקות ב-4°C.
5. בזהירות להעביר את הפאזה המימית (מבלי לקחת את interphase) לצינור חדש 1.5 מ"ל.
6. יש להוסיף 0.5 מיקרוליטר גליקוגן (0.05 מק"ג/μL) ל-100 מיקרוליטר איזופרופנול ולערבב באמצעות פיפטינג. הגליקוגן מואץ יחד עם הרנ"א ואינו מפריע לשלבים הבאים.
7. תן לעמוד במשך 10 דקות ב -20 ° C. צנטריפוגה ב-10,000 x גרם למשך 10 דקות ב-4°C. מרוקנים במהירות את הסופר-נטנט.
8. הוסף 200 μL של אתנול קר 75% והשהה מחדש את גלולת RNA על ידי מערבולת. צנטריפוגה ב-8,000 x גרם למשך 5 דקות ב-4°C.
9. דקנט את האתנול. מבלי להפוך את הצינור, תן לו להתייבש באוויר במשך 20-30 דקות. הוסף 20 μL של מים ללא RNase והשהה מחדש.
10. המשך לקרוא את הצפיפות האופטית בספקטרופוטומטר מיקרו-נפח ב- 260 ננומטר ו- 280 ננומטר כדי להעריך את טוהר ה- RNA. הדגימות חייבות להיות על קרח.
    הערה: לא ניתן לצפות ברצועות ריבוזומליות 28S ו-18S באמצעות ג'ל אגרוז בשל אופי הדגימה. נוכחותם של רנ"א אחרים, כגון miRNA או mRNAs, ניתנת לניתוח באמצעות ביואנלייזר, כפי שהוצג קודם לכן¹⁸.
11. סנתז את cDNA מדמעות RNA באמצעות ערכה מסחרית בהתאם לפרוטוקול היצרן.
    1. התחל עם RNA קלט בטווח של 10 ng-5000 ng; על פי הערכה בשימוש, לערבב אותו עם 1 μL של אוליגו (dT) ועד 12 μL של מים ללא RNase. סובבו אותו ב 500 x גרם במשך 30 שניות ודגרו ב 65 ° C במשך 5 דקות.
    2. הוסף לצינור הערבוב 4 μL של 5x מאגר תגובה, 1 μL של מעכב RNase, 2 μL של תערובת dNTP, ו 1 μL של שעתוק הפוך.
    3. סובבו את הצינור ב 500 x גרם במשך 30 שניות כדי למשוך את התערובת. לאחר מכן, לדגור את הצינור ב 42 ° C במשך 60 דקות. סיים את התגובה על ידי דגירה של הצינור ב 70 ° C במשך 10 דקות.
12. בשל הריכוז הנמוך של mRNA בדמעות, מומלץ להשתמש cDNA לא מדולל עבור qPCR²⁴. עבור ניסוי זה, 150 ng של cDNA שימשו. בצע qPCR באמצעות פריימרים DNMT3a :
    קדימה: GCCGAATTGTGTCTTGGTGGATGACA, הפוך: CCTGGTGGAATGCACTGCAGAAGGA ופריימרים GAPDH :
    קדימה: ACTGGCATGGCCTTCCGTGTGTTTA, הפוך: TCAGTGTAGCCCAAGATGCCCTTC בהתאם להוראות היצרנים ונהלי הציוד.
    1. עבור מחזור qPCR, השתמש בתוכנית הבאה: דנטורציה ראשונית: 95 ° C למשך 10 דקות ואחריה 45 מחזורים של C 95 ° C - 15 שניות, 60 ° C - 30 שניות ו- 72 ° C - 30 שניות, מסתיימים בהארכה סופית ב 72 ° C למשך 5 דקות.
    2. בצע ניתוח עקומת התכה כדי להעריך את נוכחותם של דימרים פריימרים או אמפליקונים לא ספציפיים בתגובה. רמפת הטמפרטורה החלה מ 50 ° C עד 99 ° C סופי, עם אחיזה ראשונית של 90 s עבור הצעד הראשון ואחיזה של 5 s בין כל צעד.
    3. עבור dPCR²⁵, בצע דילולים סדרתיים כדי לייעל את כמות cDNA הנדרשת כדי לזהות את mRNA של עניין. בניסוי זה, השתמש בדילולים הבאים של cDNA במים נטולי נוקלאז: 150 ננוגרם, 75 ננוגרם, 37.5 ננוגרם ו-18.75 ננוגרם של cDNA. פריימרים עבור DNMT3a שהוזכרו קודם לכן שימשו. עבור מחזור dPCR, השתמש בתוכנית הבאה: דנטורציה ראשונית: 95 ° C במשך 2 דקות ואחריו 40 מחזורים של 95 ° C - 15 s ו 60 ° C - 30 שניות.

תוצאות

הפרוטוקול המתואר במאמר זה מספק שיטה קלה ובמחיר סביר לקבלת מידע מולקולרי מנוזל דמעות באמצעות טכניקות הזמינות בדרך כלל ברוב מעבדות הביולוגיה המולקולרית. יתר על כן, ניתן להרחיב את הפרוטוקול על ידי שימוש בטכניקות רגישות מאוד כגון ELISA לזיהוי פעילות אנזימטית.

לאחר ההליכים האלה, ?...

Discussion

נוזל הדמעות נגיש בקלות, וניתן להשתמש בקביעת סמנים ביולוגיים בדמעות כטכניקה משלימה מוצלחת לאבחון מוקדם של מחלות אנושיות שונות²⁷. בעוד שהניתוח הביוכימי של הרכב הדמעות במודלים ניסיוניים של בעלי חיים משלים גישה זו ומבטיח התקדמות משמעותית בהבנת הבסיס המולקולרי של מחלות, קיים מחס?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-mercaptoethanol	Gibco	1985023
2x Laemmli buffer	Bio-Rad	16-0737
Acetic Acid	Quimica Meyer	64-19-7
Acrylamide	Sigma-Aldrich	A4058
Bradford Reagent	Sigma-Aldrich	B6916
Chloroform	Sigma-Aldrich	1003045143
Coomassie Blue R 250	US Biological	6104-59-2
Ethanol	Quimica Rique	64-17-5
GeneRuler 1kb plus DNA Ladder	Thermofisher scientific	SM1331
Glycerol	US Biological	G8145
Glycine	SANTA CRUZ	SC- 29096
Glycogen	Roche	10901393001
HCl	Quimica Rique	7647-01-0
Isopropyl alcohol	Quimica Rique	67-63-0
Methanol	Quimica Meyer	67-56-1
Micro tubes 1.5 ml	Axygen	MCT-150-C
Micro tubes 600 µl	Axygen	MCT-060-C
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
PCR tubes & strips	Novasbio	PCR 0104
Pilocarpine	Sigma-Aldrich	P6503-10g
Protease inhibitor	Roche	11873580001
QIAcuity EvaGreen PCR Kit (5mL)	Qiagen	250112
QIAcuity Nanoplate 26k 24-well (10)	Qiagen	250001
Real qPlus 2x Master Mix Green	Ampliqon	A323402
RevertAid First Strad cDNA Synthesis Kit	Thermofisher scientific	K1622
Schirmer's test strips	Laboratorio Santgar	SANT1553
SDS	Sigma-Aldrich	L3771
TEMED	Sigma aldrich	102560430
TRI reagent	Sigma-Aldrich	T9424-200ML	monophasic solution of phenol and guanidinium isothiocyanate
Tris	US Biological	T8650
Tris base	Chem Cruz	sc-3715A