mRNA およびタンパク質解析のためのマウスの涙液採取の最適化

要約

マウスモデルの涙からRNAおよびタンパク質バイオマーカーを同定することは、さまざまな疾患の早期診断に大きな期待が寄せられています。この原稿は、マウスの涙液からのmRNAおよびタンパク質単離の有効性と効率を最適化するための包括的なプロトコルを提供します。

要約

涙液膜は、眼の表面だけでなく、他の組織や臓器の病理に関連する分子変化を反映できる非常に動的な生体流体です。この生体液の分子分析は、疾患の診断またはモニタリング、治療効果の評価、および可能なバイオマーカーの特定のための非侵襲的な方法を提供します。サンプル量が限られているため、涙液サンプルの収集には、高品質と最大の効率を確保するための特定のスキルと適切なツールが必要です。さまざまな涙液サンプリング方法論が人間の研究で説明されています。この記事では、実験動物モデル、特にマウスから涙液関連のタンパク質情報を抽出するために特別に調整された、最適化されたプロトコルの包括的な説明を示します。この方法には、生後2ヶ月齢のマウスにおける涙液産生の薬理学的刺激、続いてシルマーストリップを用いたサンプル採取、および標準的な手順、SDS-PAGE、qPCR、およびデジタルPCR(dPCR)によるプロトコールの有効性と効率の評価が含まれます。このプロトコールは、さまざまな実験パラダイムにおける涙液タンパク質のシグネチャーの研究に容易に適合させることができます。動物モデル用の手頃な価格で標準化され、最適化された涙液サンプリングプロトコルを確立することで、ヒトと動物の研究の間のギャップを埋め、トランスレーショナルスタディを促進し、眼疾患および全身疾患研究の分野における進歩を加速することを目的としています。

概要

涙液は血漿限外濾過液と考えられており、血漿血清と脳脊髄液の中間体液としても説明されています^それらが共有する生体分子の大幅な重複により1。ヒトの涙液には、タンパク質、涙液脂質、代謝物、電解質が含まれていることが報告されています²。最近では、mRNA、miRNA、細胞外小胞などの他の生体分子も同定されている3,4,5,6,7。

人間では、基底の涙は涙液膜にあり、これは3つの層で構成されています:外側の脂質層は、涙液の表面を滑らかに保ち、涙液の蒸発を防ぎます。目の水分を保ち、バクテリアをはじき、角膜を保護し、涙液膜の90%を構成する中央の水層。そして最後に、角膜と接触し、涙液^が眼に付着することを可能にする高分子量タンパク質のファミリーであるムチン層8。眼表面全体の涙液の分布は、涙腺からの分泌から始まります。次に、この液体は涙管を通って目の表面を通過し、ドレナージチャネルに流れ込みます。まばたきをするたびに、涙が目全体に均一に分散し、しっとりとした状態を保ちます⁹。

涙液膜は、眼球表面だけでなく、他の組織や臓器でも発生する分子変化を反射できる非常にダイナミックな生体流体です。この生体液における差次的発現の解析は、ヒト疾患におけるバイオマーカーの発見のための有望なアプローチである^10,11。涙液膜をバイオマーカーの供給源として利用することは、さまざまな病状における早期診断のためのバイオマーカーの供給源であり、非侵襲的な収集方法の存在によって大幅に促進されてきました。ヒトおよび獣医診療所で涙を採取するための最も一般的な方法は、毛細管現象の原理に基づいて作動する膜ベースの支持体(シルマーストリップ)を含み、涙の中の水が被験者の下部結膜嚢12,13,14に配置された紙の試験紙または毛細管の長さに沿って移動することを可能にする.この方法を通じて少量のサンプルを得るという固有の制限にもかかわらず、種々の高感度技術を用いた涙液組成の生化学的分析は、潜在的なバイオマーカー分子の同定を容易にした^11,15。ヒト患者におけるシルマーストリップおよびキャピラリーからの涙タンパク質の溶出を最適化および評価するためのプロトコルは、十分に文書化されています^16,17。しかし、実験動物モデルから涙液に関連する分子情報を抽出するために特別に設計された最適化されたプロトコルの完全な説明は入手可能ですが、ほとんどありません。涙腺¹⁸の直接刺激による涙液誘導のような既存の方法は、より大きな量の収集を可能にする一方で、侵襲的であり、動物に不快感を与える可能性がある。眼表面から涙液を採取するなどの非侵襲的な方法は、DNAおよびmiRNAを単離する方法として説明されている^19,21。

このプロトコルは、マウスの涙を収集して処理するための費用対効果が高く最適化された方法を確立することを目的としています。この方法は、非侵襲性を優先しながら、SDS-PAGE、qPCR、dPCRなどの技術による分子分析に適した十分な涙液量を取得します。抽出されたタンパク質とmRNAの含有量情報は、既存の疾患の実験モデルにおける潜在的なバイオマーカーを特定するために利用することができます。

プロトコル

ここに記載されているすべての手順は、Cinvestavの動物倫理委員会(CICUAL、#0354/23)によって承認されました。実験動物は、ジャーナルの動物使用ガイドラインと、眼科および視覚研究における動物の使用に関するAssociation for Research in Vision and Ophthalmology(ARVO)の声明に従って厳密に取り扱われ、取り扱われました。処置前後の眼の健康は、眼の分泌物、まぶたの腫れ、眼の異常、および行動の変化を評価することにより評価されました。

1. 動物および試薬の準備

1. この手順では、反復ごとに生後2か月のC57BL/6雄マウスを3匹、開始重量を~25 gで使用します(図1)。各マウスを個別に処理し、温かさを保つために加熱パッドに置きます。
2. 涙液分泌を誘発するには、滅菌水を使用して20 mg / mLのピロカルピンの原液を調製します。.
3. シルマーのテストストリップを長さ5mmにカットし、ノッチで各ストリップを90°の角度に曲げます。
4. プロテアーゼ阻害剤を含む滅菌水250μLを調製します(メーカーの指示に従って、50mLに1錠)。

2.涙液生成の刺激と収集

1. 各マウスの体重を個別に測定して、適切な治療量を計算します。
2. 涙液の産生を刺激するには、6mmインスリン注射器を使用して30 mg / kgのピロカルピンを腹腔内に投与します(図1B)。.その効果が現れるまで、薬物注射後2分待ちます。.
   注:涙液の入手可能性が限られているため、刺激されていない動物からのデータは取得できませんでした。.
3. 各シルマーストリップフラグメントの端を下まぶたの中央にピンセットで配置して涙を集め、涙がストリップの制限に達するまで所定の位置に保ちます(図1C)。次に、ストリップを交換します。2つのシルマーストリップを各目に順番に置き、収集のためにストリップの間に2分の間隔を空けます。涙液採取プロセスには、マウス1匹あたり10分以上かけて約4つのストリップフラグメントが必要です。
4. Schirmer ストリップの断片を氷上の滅菌チューブに入れて、コンポーネントの劣化を防ぎます。コレクションが終わったらすぐにティア加工を始めます。

3. タンパク質の単離

1. プロテアーゼ阻害剤を添加した滅菌水20 μLを入れた600 μLの微量遠心チューブにストリップフラグメントを入れ、前述した¹⁷(図1D)のように、600 x g、4°Cで1時間遠心分離します。
2. サンプルが入った600 μLチューブの先端にある7.5 cmのステンレス製インジェクター針を使用して穿刺します(図1E)。次に、この穿刺したチューブを新しい滅菌した1.5 mLチューブに移し、以前に報告した¹⁷と同様に、サンプルを12,000 x gで4°Cで10分間遠心分離して、希釈した涙液の量を回復します。涙液膜の体積(上清)はチューブの底にあります。
3. すべてのサンプルから回収した上清を組み合わせてタンパク質プールを作成します。この実験では、約200μLの総容量が得られました。
   注:涙液の生成は1時間以上続くことがあります。この間、涙はまだ溜まることができます。
4. 涙液溜まりの総タンパク質含有量をBradford標準法²²を用いて定量化します。

4. SDS-PAGE分析

1. タンパク質サンプルを99°Cで4分間加熱して、タンパク質を変性させます。サンプルを短時間ボルテックスして、成分を混合します。
2. 各サンプルから定量したタンパク質含有量30 μgを10% SDS-PAGEゲル(表1)にロードし、標準的な方法²³を使用してサンプルを90 Vで2時間分析します。
3. 電気泳動後、ゲルを染色溶液(表1)で覆い、30分間インキュベートしてタンパク質を染色します。
4. ゲルを脱染液で数回すすぎ、背景が鮮明になり、タンパク質バンドが見えるまで洗い流します。
5. ゲルドキュメンテーションシステムで画像を取得します。

5. qPCRおよびデジタルPCRのためのmRNA単離

1. ストリップを20μLの滅菌水が入った600μLの微量遠心チューブに入れます。サンプルが入ったチューブの先端に穴を開け、新しい滅菌済み1.5 mLチューブに入れ、以前に^ヒトの涙3で報告したように、2,000 x g、4°Cで20分間遠心分離します(図1E-H)。
2. すべてのサンプルからプールを作成します。この実験の回収量は、マウス1匹につき約22μLの上清、すなわち総体積66μLであった。生体分子の分解を避けるために、チューブをドライアイスの上に置きます。
3. フェノールとイソチオシアネートグアニジン(市販品)の単相溶液200μLを加え、ピペッティングでホモジナイズします。室温で5分間放置します。このステップでは、サンプルを-20°Cで数週間、または-70°Cで数ヶ月間保存できます。
4. クロロホルム40μLを加え、ボルテックスで15秒間混合します。室温で2分間放置します。10,000 x g で4°Cで15分間遠心分離します。
5. 水相を(間相を取らずに)新しい1.5mLチューブに慎重に移します。
6. 100 μLのイソプロパノールに0.5 μLのグリコーゲン (0.05 μg/μL) を加え、ピペッティングで混合します。グリコーゲンはRNAと共沈殿し、その後のステップを妨げません。
7. -20°Cで10分間放置します。 10,000 x g で4°Cで10分間遠心分離します。 上清をすばやくデカントします。
8. 200 μLの冷75%エタノールを加え、ボルテックスしてRNAペレットを再懸濁します。8,000 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
9. エタノールをデカントします。チューブを反転させずに、20〜30分間風乾させます。20 μLのRNaseフリー水を加え、再懸濁します。
10. 260 nmおよび280 nmの微量分光光度計で光学密度を読み取り、RNAの純度を評価します。サンプルは氷上にある必要があります。
    注:リボソームバンド28Sおよび18Sは、サンプルの性質上、アガロースゲルを使用して観察することはできません。miRNAやmRNAなどの他のRNAの存在は、前に示したように、バイオアナライザーを使用して分析できます¹⁸。
11. メーカーのプロトコルに従って、市販のキットを使用して涙液RNAからcDNAを合成します。
    1. 10 ng〜5000 ngの範囲の入力RNAから始めます。使用するキットに応じて、1 μL のオリゴ (dT) と最大 12 μL の RNase フリー水と混合します。500 x g で30秒間遠心し、65°Cで5分間インキュベートします。
    2. 5x 反応バッファー 4 μL 、RNase 阻害剤 1 μL 、dNTP ミックス 2 μL 、逆転写酵素 1 μL をミキシングチューブに加えます。
    3. チューブを500 x g で30秒間回転させ、混合物を引き下げます。次に、チューブを42°Cで60分間インキュベートします。チューブを70°Cで10分間インキュベートして反応を終了します。
12. 涙液中のmRNAの濃度が低いため、qPCR²⁴には希釈されていないcDNAを使用することをお勧めします。この実験では、150 ngのcDNAを使用しました。 DNMT3a プライマーを使用してqPCRを実行します。
    フォワード:GCCGAATTGTGTCTTGGTGGATGACA、リバース:CCTGGTGGAATGCACTGCAGAAGGAおよび GAPDH プライマー:
    フォワード:ACTGGCATGGCCTTCCGTTCTTA、リバース:TCAGTGTAGCCCAAGATGCCCTTCメーカーおよび機器の手順による指示に従います。
    1. qPCRサイクルの場合、次のプログラムを使用します:初期変性:95°Cで10分間、その後C 95°C-15秒、60°C-30秒、および72°C-30秒の45サイクルを行い、72°Cで5分間の最終延長で終了します。
    2. メルトカーブ解析を実施して、反応中のプライマーダイマーまたは非特異的アンプリコンの存在を評価します。温度上昇は50°Cから始まり、最終的な99°Cまでで、最初のステップでは90秒の初期ホールド、各ステップ間では5秒のホールドがありました。
    3. dPCR²⁵では、目的のmRNAを検出するために必要なcDNAの量を最適化するために、段階希釈を行います。この実験では、ヌクレアーゼフリー水で希釈したcDNAを150 ng、75 ng、37.5 ng、および18.75 ngのcDNAに使用します。前述の DNMT3a のプライマーを使用しました。dPCRサイクルには、次のプログラムを使用します:初期変性:95°Cで2分間、続いて95°C-15秒および60°C-30秒の40サイクル。

結果

この論文に記載されているプロトコルは、ほとんどの分子生物学研究室で一般的に利用可能な技術を使用して、涙液から分子情報を取得するための簡単で手頃な方法を提供します。さらに、酵素活性検出にELISAなどの高感度技術を採用することで、プロトコルをスケールアップすることができます。

これらの処置後、総タンパク質収量は約3〜4μg/μLでした。クマシー染色...

ディスカッション

涙液は容易に入手でき、涙液中のバイオマーカーの測定は、さまざまなヒト疾患の早期診断のための成功した補完技術として採用することができる²⁷。実験動物モデルにおける涙液組成の生化学的解析は、このアプローチを補完し、疾患の分子基盤の理解における大きな進歩を約束しますが、利用可能なデータやプロトコルが不足しているため、開発に至りました。このレ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-mercaptoethanol	Gibco	1985023
2x Laemmli buffer	Bio-Rad	16-0737
Acetic Acid	Quimica Meyer	64-19-7
Acrylamide	Sigma-Aldrich	A4058
Bradford Reagent	Sigma-Aldrich	B6916
Chloroform	Sigma-Aldrich	1003045143
Coomassie Blue R 250	US Biological	6104-59-2
Ethanol	Quimica Rique	64-17-5
GeneRuler 1kb plus DNA Ladder	Thermofisher scientific	SM1331
Glycerol	US Biological	G8145
Glycine	SANTA CRUZ	SC- 29096
Glycogen	Roche	10901393001
HCl	Quimica Rique	7647-01-0
Isopropyl alcohol	Quimica Rique	67-63-0
Methanol	Quimica Meyer	67-56-1
Micro tubes 1.5 ml	Axygen	MCT-150-C
Micro tubes 600 µl	Axygen	MCT-060-C
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
PCR tubes & strips	Novasbio	PCR 0104
Pilocarpine	Sigma-Aldrich	P6503-10g
Protease inhibitor	Roche	11873580001
QIAcuity EvaGreen PCR Kit (5mL)	Qiagen	250112
QIAcuity Nanoplate 26k 24-well (10)	Qiagen	250001
Real qPlus 2x Master Mix Green	Ampliqon	A323402
RevertAid First Strad cDNA Synthesis Kit	Thermofisher scientific	K1622
Schirmer's test strips	Laboratorio Santgar	SANT1553
SDS	Sigma-Aldrich	L3771
TEMED	Sigma aldrich	102560430
TRI reagent	Sigma-Aldrich	T9424-200ML	monophasic solution of phenol and guanidinium isothiocyanate
Tris	US Biological	T8650
Tris base	Chem Cruz	sc-3715A