优化小鼠泪液收集以进行 mRNA 和蛋白质分析

摘要

从小鼠模型中的泪液中鉴定 RNA 和蛋白质生物标志物对各种疾病的早期诊断具有很大的前景。本手稿提供了优化从小鼠泪液中分离 mRNA 和蛋白质的功效和效率的综合方案。

摘要

泪膜是一种高度动态的生物流体，不仅能够在眼表，而且在其他组织和器官中都能反映与病理相关的分子变化。这种生物流体的分子分析提供了一种非侵入性方法来诊断或监测疾病、评估医疗效果以及识别可能的生物标志物。由于样品量有限，采集撕裂样品需要特定的技能和适当的工具，以确保高质量和最高效率。人类研究中已经描述了各种泪液采样方法。在本文中，提出了一种优化方案的全面描述，专门用于从实验动物模型（尤其是小鼠）中提取与泪液相关的蛋白质信息。该方法包括对 2 个月大小鼠泪液产生的药理学刺激，然后使用 Schirmer 试纸采集样本，并通过标准程序、SDS-PAGE、qPCR 和数字 PCR （dPCR） 评估方案的有效性和效率。该方案可以很容易地适应各种实验范式中泪液蛋白特征的研究。通过为动物模型建立经济实惠、标准化和优化的泪液采样方案，目的是弥合人类和动物研究之间的差距，促进转化研究并加速眼部和全身性疾病研究领域的进步。

引言

泪液被认为是血浆超滤液，也被描述为血浆血清和脑脊液之间的中间液，因为它们共享的生物分子有显著重叠¹。据报道，人类的眼泪含有蛋白质、泪液脂质、代谢物和电解质²。最近，还鉴定出其他生物分子，如 mRNA、miRNA 和细胞外囊泡 ^3,4,5,6,7。

在人类中，基底泪液位于泪膜中，泪膜由三层组成:外层脂质层，保持泪液表面光滑，使我们能够看穿泪液并防止泪液蒸发;中间水层，保持眼睛水分，排斥细菌，保护角膜，构成泪膜的 90%;最后是粘蛋白层，这是一个高分子量蛋白家族，与角膜接触并允许泪液粘附在眼睛上⁸。眼表的泪液分布始于泪腺的分泌。然后，这种液体被引导通过泪管，穿过眼睛表面并流入引流通道。每一次眨眼都会让泪水均匀地分散在整个眼睛上，保持湿润⁹.

泪膜是一种高度动态的生物流体，能够反映不仅发生在眼表而且发生在其他组织和器官中的分子变化。这种生物流体中的差异表达分析代表了在人类疾病中发现生物标志物的一种很有前途的方法 ^10,11。非侵入性收集方法的存在极大地促进了泪膜作为各种病理早期诊断的生物标志物来源。在人类和兽医诊所中收集泪液的最常用方法涉及基于膜的支撑（Schirmer 条），它根据毛细管作用原理工作，允许泪液中的水沿着放置在受试者下结膜囊中的纸试纸或毛细管的长度流动 12,13,14.尽管通过这种方法获得小样本量存在固有限制，但使用各种敏感技术对泪液成分进行生化分析有助于识别潜在的生物标志物分子^11,15。优化和评估人类患者 Schirmer 试纸条和毛细血管泪液蛋白洗脱的方案有据可查^16,17。然而，专门设计用于从实验动物模型中提取与撕裂相关的分子信息的优化方案的完整描述是可用的，但很少。现有的方法，例如通过直接刺激泪腺¹⁸ 诱导泪液，同时允许收集更大的体积，是侵入性的，可能会给动物带来不适。非侵入性方法（例如从眼表收集泪液）已被描述为分离 DNA 和 miRNA 的一种方法^19,21。

该协议旨在建立一种经济高效且优化的方法，用于收集和处理小鼠的眼泪。该方法优先考虑非侵入性，同时通过 SDS-PAGE、qPCR 和 dPCR 等技术获得适合分子分析的足够泪液体积。然后，可以利用提取的蛋白质和 mRNA 含量信息来识别现有疾病实验模型中的潜在生物标志物。

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研究方案

此处描述的所有程序均已获得 Cinvestav 动物伦理委员会 （CICUAL， # 0354/23） 的批准。严格按照该杂志的动物使用指南和视觉与眼科学研究协会 （ARVO） 关于动物在眼科和视觉研究中使用的声明对实验动物进行处理和处理。通过评估眼部分泌物、眼睑肿胀、眼部异常和行为变化来评估手术前后的眼部健康状况。

1. 动物和试剂制备

1. 每次重复使用三只 2 个月大的 C57BL/6 雄性小鼠进行该程序，起始重量为 ~25 克（图 1）。单独处理每个鼠标并将其放在加热垫上以保持温暖。
2. 为了诱导泪液分泌，使用无菌水制备 20 mg/mL 的毛果芸香碱储备液。
3. 将 Schirmer 的试纸条切割成 5 mm 长，并将缺口处的每个试纸条弯曲成 90° 角。
4. 用蛋白酶抑制剂制备 250 μL 无菌水（根据制造商说明，50 mL 1 片）。

2. 泪液产生刺激和收集

1. 单独称重每只小鼠以计算适当的治疗剂量。
2. 为了刺激泪液产生，用 6 毫米胰岛素注射器腹膜内注射 30 mg/kg 毛果芸香碱（图1B）。注射后等待 2 分钟，使其效果显现。
   注意:由于泪液的可用性有限，无法获得来自未受刺激动物的数据。
3. 用镊子将每个 Schirmer 条带碎片的末端放在下眼睑的中心上，收集眼泪，并将其保持在原位，直到撕裂达到条带限制（图 1C）。然后，更换条带。依次在每只眼睛中放置 2 个 Schirmer 条带，条带之间间隔 2 分钟进行收集。撕裂收集过程需要每只小鼠在 10 分钟内大约四个条带片段。
4. 将 Schirmer 条带片段放在冰上的无菌管中，以避免组分降解。集合完成后，立即开始撕裂处理。

3. 蛋白质分离

1. 将条带片段放入含有 20 μL 无菌水和蛋白酶抑制剂的 600 μL 微量离心管中，并在 4 °C 下以 600 x g 离心 1 小时，如前所述¹⁷ （图 1D）。
2. 在含有样品的 600 μL 试管的尖端使用 7.5 cm 不锈钢进样针穿刺（图 1E）。然后，将这根穿孔的试管转移到新的无菌 1.5 mL 试管中，并在 4 °C 下以 12,000 x g 离心样品 10 分钟，如前所述¹⁷，以恢复稀释的泪液体积。泪膜体积（上清液）将位于试管底部。
3. 通过混合从所有样品中回收的上清液来建立蛋白质池。在本实验中，获得的总体积约为 200 μL。
   注意:撕裂产生可持续 1 小时以上。在此期间，仍然可以收集眼泪。
4. 使用 Bradford 标准方法²² 定量泪池的总蛋白质含量。

4. SDS-PAGE 分析

1. 将蛋白质样品在 99 °C 下加热 4 分钟以使蛋白质变性。短暂涡旋样品以混合组分。
2. 将每个样品中的 30 μg 定量蛋白质含量加载到 10% SDS-PAGE 凝胶上（表 1），并使用标准方法²³ 在 90 V 下运行样品 2 小时。
3. 电泳后，用染色溶液（表 1）覆盖凝胶并孵育 30 分钟以对蛋白质进行染色。
4. 用脱色溶液冲洗凝胶数次，直到背景变得清晰并且可以看到蛋白质条带。
5. 使用凝胶成像系统采集图像。

5. 用于 qPCR 和数字 PCR 的 mRNA 分离

1. 将试纸条放入含有 20 μL 无菌水的 600 μL 微量离心管中。在含有样品的管尖穿孔，将其放入新的消毒 1.5 mL 管中，然后如前所述，如之前在人类眼泪³ 中报道的那样，在 4 °C 下以 2,000 x g 离心 20 分钟（图 1E-H）。
2. 从所有样本创建池。本实验的回收体积为每只小鼠约 22 μL 上清液，即 66 μL 总体积。将试管放在干冰上，以避免生物分子降解。
3. 加入 200 μL 苯酚和异硫氰酸胍单相溶液（市售），通过移液匀浆。在室温下静置 5 分钟。在此步骤中，样品可以在 -20 °C 下储存数周或 -70 °C 下储存数月。
4. 加入 40 μL 氯仿并在涡旋中混合 15 秒。在室温下静置 2 分钟。在 4°C 下以 10,000 x g 离心 15 分钟。
5. 小心地将水相（不取中间相）转移到新的 1.5 mL 试管中。
6. 向 100 μL 异丙醇中加入 0.5 μL 糖原 （0.05 μg/μL），并通过移液混合。糖原与 RNA 共沉淀，不会干扰后续步骤。
7. 在 -20 °C 下静置 10 分钟。 在 4 °C 下以 10,000 x g 离心 10 分钟。 快速倒出上清液。
8. 加入 200 μL 冷的 75% 乙醇，涡旋重悬 RNA 沉淀。在 4 °C 下以 8,000 x g 离心 5 分钟。
9. 倒出乙醇。在不倒置试管的情况下，让它风干 20-30 分钟。加入 20 μL 不含 RNase 的水并重悬。
10. 继续在微量分光光度计中读取 260 nm 和 280 nm 处的光密度，以评估 RNA 的纯度。样品必须在冰上。
    注:由于样品的性质，使用琼脂糖凝胶无法观察到核糖体带 28S 和 18S。可以使用生物分析仪分析其他 RNA（如 miRNA 或 mRNA）的存在，如前所述¹⁸。
11. 根据制造商的方案，使用商业试剂盒从 tears RNA 合成 cDNA。
    1. 从 10 ng-5000 ng 范围内的起始 RNA 开始;根据所使用的试剂盒，将其与 1 μL Oligo （dT） 和最多 12 μL 不含 RNase 的水混合。以 500 x g 旋转 30 秒，并在 65 °C 下孵育 5 分钟。
    2. 向混合管中加入 4 μL 5x 反应缓冲液、1 μL RNase 抑制剂、2 μL dNTP 混合物和 1 μL 逆转录酶。
    3. 以 500 x g 的速度旋转试管 30 秒以拉下混合物。然后，将试管在 42 °C 下孵育 60 分钟。通过将试管在 70 °C 下孵育 10 分钟来完成反应。
12. 由于泪液中 mRNA 的浓度较低，建议使用未稀释的 cDNA 进行 qPCR²⁴。对于该实验，使用了 150 ng cDNA。使用 DNMT3a 引物进行 qPCR:
    正向:GCCGAATTGTGTCTTGGTGGATGACA，反向:CCTGGTGGAATGCACTGCAGAAGGA 和 GAPDH 引物:
    正向:ACTGGCATGGCCTTCCGTGTTCTTA，反向:TCAGTGTAGCCCAAGATGCCCTTC 遵循制造商和设备程序的说明。
    1. 对于 qPCR 循环，请使用以下程序:初始变性:95 °C 10 分钟，然后是 C 95°C - 15 秒、60 °C- 30 秒和 72 °C- 30 秒的 45 个循环，最后在 72 °C 下延伸 5 分钟。
    2. 进行熔解曲线分析，以评估反应中是否存在引物二聚体或非特异性扩增子。升温从 50 °C 开始到最终的 99 °C，第一步的初始保持时间为 90 s，每步之间保持 5 s。
    3. 对于 dPCR²⁵，进行连续稀释以优化检测目标 mRNA 所需的 cDNA 量。在本实验中，使用以下稀释的 cDNA 溶液（含无核酸酶）:150 ng、75 ng、37.5 ng 和 18.75 ng cDNA。使用了前面提到的 DNMT3a 引物。对于 dPCR 循环，使用以下程序:初始变性:95 °C 2 分钟，然后是 95 °C - 15 s 和 60 °C- 30 s 的 40 个循环。

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结果

本文中描述的方案提供了一种简单且经济实惠的方法，可以使用大多数分子生物学实验室中常用的技术从泪液中获取分子信息。此外，该方案可以通过采用高灵敏度技术（如 ELISA）进行酶活性检测来扩大规模。

经过这些程序后，总蛋白产量约为 3-4 μg/μL。总蛋白提取物的考马斯染色 SDS 页面分析揭示了总视网膜和泪液中蛋白质表达的模式（图 2A）。

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讨论

泪液很容易获得，泪液中生物标志物的测定可以作为各种人类疾病早期诊断的成功补充技术²⁷。虽然在实验动物模型中对泪液成分的生化分析补充了这种方法，并有望在理解疾病的分子基础方面取得重大进展，但缺乏可用的数据和协议，这促使我们开发了一个。本报告中描述的方法在技术上易于执行，并允许初步鉴定不同疾病相关候选分子的差异表达。

泪液...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-mercaptoethanol	Gibco	1985023
2x Laemmli buffer	Bio-Rad	16-0737
Acetic Acid	Quimica Meyer	64-19-7
Acrylamide	Sigma-Aldrich	A4058
Bradford Reagent	Sigma-Aldrich	B6916
Chloroform	Sigma-Aldrich	1003045143
Coomassie Blue R 250	US Biological	6104-59-2
Ethanol	Quimica Rique	64-17-5
GeneRuler 1kb plus DNA Ladder	Thermofisher scientific	SM1331
Glycerol	US Biological	G8145
Glycine	SANTA CRUZ	SC- 29096
Glycogen	Roche	10901393001
HCl	Quimica Rique	7647-01-0
Isopropyl alcohol	Quimica Rique	67-63-0
Methanol	Quimica Meyer	67-56-1
Micro tubes 1.5 ml	Axygen	MCT-150-C
Micro tubes 600 µl	Axygen	MCT-060-C
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
PCR tubes & strips	Novasbio	PCR 0104
Pilocarpine	Sigma-Aldrich	P6503-10g
Protease inhibitor	Roche	11873580001
QIAcuity EvaGreen PCR Kit (5mL)	Qiagen	250112
QIAcuity Nanoplate 26k 24-well (10)	Qiagen	250001
Real qPlus 2x Master Mix Green	Ampliqon	A323402
RevertAid First Strad cDNA Synthesis Kit	Thermofisher scientific	K1622
Schirmer's test strips	Laboratorio Santgar	SANT1553
SDS	Sigma-Aldrich	L3771
TEMED	Sigma aldrich	102560430
TRI reagent	Sigma-Aldrich	T9424-200ML	monophasic solution of phenol and guanidinium isothiocyanate
Tris	US Biological	T8650
Tris base	Chem Cruz	sc-3715A