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L'identificazione di biomarcatori di RNA e proteine dalle lacrime in modelli murini è molto promettente per la diagnostica precoce in varie malattie. Questo manoscritto fornisce un protocollo completo per ottimizzare l'efficacia e l'efficienza dell'isolamento dell'mRNA e delle proteine dalle lacrime di topo.
Il film lacrimale è un biofluido altamente dinamico in grado di riflettere i cambiamenti molecolari associati alla patologia, non solo nella superficie oculare ma anche in altri tessuti e organi. L'analisi molecolare di questo biofluido offre un modo non invasivo per diagnosticare o monitorare le malattie, valutare l'efficacia del trattamento medico e identificare possibili biomarcatori. A causa del volume limitato del campione, la raccolta di campioni lacrimali richiede competenze specifiche e strumenti appropriati per garantire un'elevata qualità e la massima efficienza. Varie metodologie di campionamento lacrimale sono state descritte in studi sull'uomo. In questo articolo viene presentata una descrizione completa di un protocollo ottimizzato, specificamente studiato per l'estrazione di informazioni proteiche relative alle lacrime da modelli animali sperimentali, in particolare topi. Questo metodo include la stimolazione farmacologica della produzione lacrimale in topi di 2 mesi, seguita dalla raccolta del campione utilizzando strisce di Schirmer e dalla valutazione dell'efficacia e dell'efficienza del protocollo attraverso procedure standard, SDS-PAGE, qPCR e PCR digitale (dPCR). Questo protocollo può essere facilmente adattato per lo studio della firma della proteina lacrimale in una varietà di paradigmi sperimentali. Stabilendo un protocollo di campionamento lacrimale conveniente, standardizzato e ottimizzato per i modelli animali, l'obiettivo era quello di colmare il divario tra la ricerca umana e quella animale, facilitando gli studi traslazionali e accelerando i progressi nel campo della ricerca sulle malattie oculari e sistemiche.
Le lacrime sono considerate un ultrafiltrato plasmatico e sono state anche descritte come un fluido intermedio tra il siero plasmatico e il liquido cerebrospinale a causa di una significativa sovrapposizione nelle biomolecole che condividono1. È stato riportato che le lacrime umane contengono proteine, lipidi lacrimali, metaboliti ed elettroliti2. Recentemente, sono state identificate anche altre biomolecole come mRNA, miRNA e vescicole extracellulari 3,4,5,6,7.
Nell'uomo, le lacrime basali si trovano nel film lacrimale, che consiste di tre strati: lo strato lipidico esterno, che mantiene liscia la superficie lacrimale per permetterci di vedere attraverso di essa e prevenire l'evaporazione delle lacrime; lo strato acquoso intermedio, che mantiene l'occhio idratato, respinge i batteri, protegge la cornea e costituisce il 90% del film lacrimale; e infine, lo strato di mucina, una famiglia di proteine ad alto peso molecolare che sono a contatto con la cornea e permettono alla lacrima di aderire all'occhio8. La distribuzione lacrimale sulla superficie oculare inizia con la secrezione dalla ghiandola lacrimale. Questo fluido viene quindi guidato attraverso i dotti lacrimali per passare sulla superficie dell'occhio e fluire nei canali di drenaggio. Ogni battito di ciglia consente alle lacrime di disperdersi uniformemente su tutto l'occhio, mantenendolo umido9.
Il film lacrimale è un biofluido altamente dinamico in grado di riflettere i cambiamenti molecolari che avvengono non solo sulla superficie oculare ma anche in altri tessuti e organi. L'analisi dell'espressione differenziale in questo biofluido rappresenta un approccio promettente per la scoperta di biomarcatori nelle malattie umane 10,11. L'utilizzo del film lacrimale come fonte di biomarcatori per la diagnosi precoce in varie patologie è stato notevolmente facilitato dalla presenza di metodi di raccolta non invasivi. Il metodo più comune per la raccolta delle lacrime nelle cliniche umane e veterinarie prevede un supporto a membrana (striscia di Schirmer), che opera secondo il principio dell'azione capillare, consentendo all'acqua nelle lacrime di viaggiare lungo la lunghezza di una striscia reattiva di carta o di tubi capillari posizionati nel sacco congiuntivale inferiore del soggetto 12,13,14. Nonostante la limitazione intrinseca dell'ottenimento di un piccolo volume di campione attraverso questo metodo, l'analisi biochimica della composizione lacrimale utilizzando varie tecniche sensibili ha facilitato l'identificazione di potenziali molecole biomarcatrici11,15. I protocolli per l'ottimizzazione e la valutazione dell'eluizione delle proteine lacrimali dalle strisce di Schirmer e dai capillari in pazienti umani sono ben documentati16,17. Tuttavia, sono disponibili descrizioni complete di protocolli ottimizzati specificamente progettati per estrarre informazioni molecolari relative alle lacrime da modelli animali sperimentali, ma scarse. I metodi esistenti, come l'induzione lacrimale attraverso la stimolazione diretta della ghiandola lacrimale18, pur consentendo la raccolta di volumi maggiori, sono invasivi e possono causare disagio agli animali. Metodi non invasivi, come la raccolta di lacrime dalla superficie oculare, sono stati descritti come un modo per isolare il DNA e i miRNA19,21.
Questo protocollo mira a stabilire un metodo economico e ottimizzato per la raccolta e l'elaborazione delle lacrime nei topi. Il metodo dà la priorità alla non invasività e ottiene volumi lacrimali sufficienti adatti all'analisi molecolare attraverso tecniche come SDS-PAGE, qPCR e dPCR. Le informazioni estratte sul contenuto di proteine e mRNA possono quindi essere utilizzate per identificare potenziali biomarcatori nei modelli sperimentali esistenti di malattia.
Tutte le procedure qui descritte sono state approvate dal Comitato Etico Animale di Cinvestav (CICUAL, # 0354/23). Gli animali da laboratorio sono stati trattati e maneggiati in stretta conformità con le linee guida per l'uso degli animali della rivista e secondo la dichiarazione dell'Associazione per la ricerca sulla visione e l'oftalmologia (ARVO) per l'uso degli animali nella ricerca oftalmica e sulla vista. La salute oculare prima e dopo le procedure è stata valutata valutando le secrezioni oculari, le palpebre gonfie, le anomalie oculari e i cambiamenti comportamentali.
1. Animali e preparazione dei reagenti
2. Stimolazione e raccolta della produzione lacrimale
3. Isolamento delle proteine
4. Analisi SDS-PAGE
5. Isolamento dell'mRNA per qPCR e PCR digitale
Il protocollo descritto in questo documento fornisce un metodo semplice ed economico per ottenere informazioni molecolari dal liquido lacrimale utilizzando tecniche comunemente disponibili nella maggior parte dei laboratori di biologia molecolare. Inoltre, il protocollo può essere ampliato impiegando tecniche altamente sensibili come l'ELISA per il rilevamento dell'attività enzimatica.
Dopo queste procedure, la resa proteica totale è stata di circa 3-4 μg/μL. L'analisi della pagina SDS co...
Il liquido lacrimale è facilmente accessibile e la determinazione dei biomarcatori nelle lacrime può essere impiegata come tecnica complementare di successo per la diagnosi precoce di varie malattie umane27. Mentre l'analisi biochimica della composizione lacrimale in modelli animali sperimentali integra questo approccio e promette progressi significativi nella comprensione delle basi molecolari delle malattie, c'è una scarsità di dati e protocolli disponibili, che ci ha portato a svilupparne u...
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Questo lavoro è stato sostenuto da VELUX STIFTUNG [progetto 1852] a M.L. e borse di studio post-laurea da CONAHCYT a M.B. (836810), E.J.M.C. (802436) e A.M.F (CVU 1317418). Sincera gratitudine a tutti i membri del laboratorio, al Centro de Investigación sobre el Envejecimiento e al Departamento de Farmacobiología (Cinvestav) per i loro contributi alle stimolanti discussioni.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2-mercaptoethanol | Gibco | 1985023 | |
2x Laemmli buffer | Bio-Rad | 16-0737 | |
Acetic Acid | Quimica Meyer | 64-19-7 | |
Acrylamide | Sigma-Aldrich | A4058 | |
Bradford Reagent | Sigma-Aldrich | B6916 | |
Chloroform | Sigma-Aldrich | 1003045143 | |
Coomassie Blue R 250 | US Biological | 6104-59-2 | |
Ethanol | Quimica Rique | 64-17-5 | |
GeneRuler 1kb plus DNA Ladder | Thermofisher scientific | SM1331 | |
Glycerol | US Biological | G8145 | |
Glycine | SANTA CRUZ | SC- 29096 | |
Glycogen | Roche | 10901393001 | |
HCl | Quimica Rique | 7647-01-0 | |
Isopropyl alcohol | Quimica Rique | 67-63-0 | |
Methanol | Quimica Meyer | 67-56-1 | |
Micro tubes 1.5 ml | Axygen | MCT-150-C | |
Micro tubes 600 µl | Axygen | MCT-060-C | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
PCR tubes & strips | Novasbio | PCR 0104 | |
Pilocarpine | Sigma-Aldrich | P6503-10g | |
Protease inhibitor | Roche | 11873580001 | |
QIAcuity EvaGreen PCR Kit (5mL) | Qiagen | 250112 | |
QIAcuity Nanoplate 26k 24-well (10) | Qiagen | 250001 | |
Real qPlus 2x Master Mix Green | Ampliqon | A323402 | |
RevertAid First Strad cDNA Synthesis Kit | Thermofisher scientific | K1622 | |
Schirmer's test strips | Laboratorio Santgar | SANT1553 | |
SDS | Sigma-Aldrich | L3771 | |
TEMED | Sigma aldrich | 102560430 | |
TRI reagent | Sigma-Aldrich | T9424-200ML | monophasic solution of phenol and guanidinium isothiocyanate |
Tris | US Biological | T8650 | |
Tris base | Chem Cruz | sc-3715A |
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