Ottimizzazione della raccolta lacrimale nei topi per l'analisi di mRNA e proteine

Riepilogo

L'identificazione di biomarcatori di RNA e proteine dalle lacrime in modelli murini è molto promettente per la diagnostica precoce in varie malattie. Questo manoscritto fornisce un protocollo completo per ottimizzare l'efficacia e l'efficienza dell'isolamento dell'mRNA e delle proteine dalle lacrime di topo.

Abstract

Il film lacrimale è un biofluido altamente dinamico in grado di riflettere i cambiamenti molecolari associati alla patologia, non solo nella superficie oculare ma anche in altri tessuti e organi. L'analisi molecolare di questo biofluido offre un modo non invasivo per diagnosticare o monitorare le malattie, valutare l'efficacia del trattamento medico e identificare possibili biomarcatori. A causa del volume limitato del campione, la raccolta di campioni lacrimali richiede competenze specifiche e strumenti appropriati per garantire un'elevata qualità e la massima efficienza. Varie metodologie di campionamento lacrimale sono state descritte in studi sull'uomo. In questo articolo viene presentata una descrizione completa di un protocollo ottimizzato, specificamente studiato per l'estrazione di informazioni proteiche relative alle lacrime da modelli animali sperimentali, in particolare topi. Questo metodo include la stimolazione farmacologica della produzione lacrimale in topi di 2 mesi, seguita dalla raccolta del campione utilizzando strisce di Schirmer e dalla valutazione dell'efficacia e dell'efficienza del protocollo attraverso procedure standard, SDS-PAGE, qPCR e PCR digitale (dPCR). Questo protocollo può essere facilmente adattato per lo studio della firma della proteina lacrimale in una varietà di paradigmi sperimentali. Stabilendo un protocollo di campionamento lacrimale conveniente, standardizzato e ottimizzato per i modelli animali, l'obiettivo era quello di colmare il divario tra la ricerca umana e quella animale, facilitando gli studi traslazionali e accelerando i progressi nel campo della ricerca sulle malattie oculari e sistemiche.

Introduzione

Le lacrime sono considerate un ultrafiltrato plasmatico e sono state anche descritte come un fluido intermedio tra il siero plasmatico e il liquido cerebrospinale a causa di una significativa sovrapposizione nelle biomolecole che condividono¹. È stato riportato che le lacrime umane contengono proteine, lipidi lacrimali, metaboliti ed elettroliti². Recentemente, sono state identificate anche altre biomolecole come mRNA, miRNA e vescicole extracellulari 3,4,5,6,7.

Nell'uomo, le lacrime basali si trovano nel film lacrimale, che consiste di tre strati: lo strato lipidico esterno, che mantiene liscia la superficie lacrimale per permetterci di vedere attraverso di essa e prevenire l'evaporazione delle lacrime; lo strato acquoso intermedio, che mantiene l'occhio idratato, respinge i batteri, protegge la cornea e costituisce il 90% del film lacrimale; e infine, lo strato di mucina, una famiglia di proteine ad alto peso molecolare che sono a contatto con la cornea e permettono alla lacrima di aderire all'occhio⁸. La distribuzione lacrimale sulla superficie oculare inizia con la secrezione dalla ghiandola lacrimale. Questo fluido viene quindi guidato attraverso i dotti lacrimali per passare sulla superficie dell'occhio e fluire nei canali di drenaggio. Ogni battito di ciglia consente alle lacrime di disperdersi uniformemente su tutto l'occhio, mantenendolo umido⁹.

Il film lacrimale è un biofluido altamente dinamico in grado di riflettere i cambiamenti molecolari che avvengono non solo sulla superficie oculare ma anche in altri tessuti e organi. L'analisi dell'espressione differenziale in questo biofluido rappresenta un approccio promettente per la scoperta di biomarcatori nelle malattie umane ^10,11. L'utilizzo del film lacrimale come fonte di biomarcatori per la diagnosi precoce in varie patologie è stato notevolmente facilitato dalla presenza di metodi di raccolta non invasivi. Il metodo più comune per la raccolta delle lacrime nelle cliniche umane e veterinarie prevede un supporto a membrana (striscia di Schirmer), che opera secondo il principio dell'azione capillare, consentendo all'acqua nelle lacrime di viaggiare lungo la lunghezza di una striscia reattiva di carta o di tubi capillari posizionati nel sacco congiuntivale inferiore del soggetto 12,13,14. Nonostante la limitazione intrinseca dell'ottenimento di un piccolo volume di campione attraverso questo metodo, l'analisi biochimica della composizione lacrimale utilizzando varie tecniche sensibili ha facilitato l'identificazione di potenziali molecole biomarcatrici^11,15. I protocolli per l'ottimizzazione e la valutazione dell'eluizione delle proteine lacrimali dalle strisce di Schirmer e dai capillari in pazienti umani sono ben documentati^16,17. Tuttavia, sono disponibili descrizioni complete di protocolli ottimizzati specificamente progettati per estrarre informazioni molecolari relative alle lacrime da modelli animali sperimentali, ma scarse. I metodi esistenti, come l'induzione lacrimale attraverso la stimolazione diretta della ghiandola lacrimale¹⁸, pur consentendo la raccolta di volumi maggiori, sono invasivi e possono causare disagio agli animali. Metodi non invasivi, come la raccolta di lacrime dalla superficie oculare, sono stati descritti come un modo per isolare il DNA e i miRNA^19,21.

Questo protocollo mira a stabilire un metodo economico e ottimizzato per la raccolta e l'elaborazione delle lacrime nei topi. Il metodo dà la priorità alla non invasività e ottiene volumi lacrimali sufficienti adatti all'analisi molecolare attraverso tecniche come SDS-PAGE, qPCR e dPCR. Le informazioni estratte sul contenuto di proteine e mRNA possono quindi essere utilizzate per identificare potenziali biomarcatori nei modelli sperimentali esistenti di malattia.

Protocollo

Tutte le procedure qui descritte sono state approvate dal Comitato Etico Animale di Cinvestav (CICUAL, # 0354/23). Gli animali da laboratorio sono stati trattati e maneggiati in stretta conformità con le linee guida per l'uso degli animali della rivista e secondo la dichiarazione dell'Associazione per la ricerca sulla visione e l'oftalmologia (ARVO) per l'uso degli animali nella ricerca oftalmica e sulla vista. La salute oculare prima e dopo le procedure è stata valutata valutando le secrezioni oculari, le palpebre gonfie, le anomalie oculari e i cambiamenti comportamentali.

1. Animali e preparazione dei reagenti

1. Utilizzare tre topi maschi C57BL/6 di 2 mesi per replica per la procedura, con un peso iniziale di ~25 g (Figura 1). Elabora ogni mouse individualmente e posizionalo su un termoforo per mantenere il calore.
2. Per indurre la secrezione lacrimale, preparare una soluzione madre di pilocarpina a 20 mg/mL utilizzando acqua sterile.
3. Tagliare le strisce reattive di Schirmer a 5 mm di lunghezza e piegare ogni striscia alla tacca a un angolo di 90°.
4. Preparare 250 μL di acqua sterile con un inibitore della proteasi (1 compressa per 50 mL, secondo le istruzioni del produttore).

2. Stimolazione e raccolta della produzione lacrimale

1. Pesare ogni topo individualmente per calcolare il dosaggio appropriato dei trattamenti.
2. Per stimolare la produzione lacrimale, somministrare 30 mg/kg di pilocarpina per via intraperitoneale con una siringa da insulina da 6 mm (Figura 1B). Attendere 2 minuti dopo l'iniezione del farmaco affinché i suoi effetti si manifestino.
   NOTA: Non è stato possibile ottenere dati da animali non stimolati a causa della limitata disponibilità di liquido lacrimale.
3. Raccogli le lacrime posizionando l'estremità di ogni frammento di striscia di Schirmer al centro della palpebra inferiore con un paio di pinzette e tienilo in posizione fino a quando la lacrima non raggiunge il limite della striscia (Figura 1C). Quindi, sostituisci la striscia. Posizionare in sequenza 2 strisce di Schirmer in ciascun occhio, con un intervallo di 2 minuti tra le strisce per la raccolta. Il processo di raccolta delle lacrime richiede circa quattro frammenti di striscia in 10 minuti per topo.
4. Posizionare i frammenti della striscia di Schirmer in tubi sterili su ghiaccio per evitare la degradazione dei componenti. Non appena termina la raccolta, inizia l'elaborazione delle lacrime.

3. Isolamento delle proteine

1. Mettere i frammenti di striscia in una provetta da microcentrifuga da 600 μl contenente 20 μl di acqua sterile con un inibitore della proteasi e centrifugare per 1 ora a 600 x g a 4 °C, come mostrato in precedenza¹⁷ (Figura 1D).
2. Effettuare una puntura utilizzando un ago per iniettore in acciaio inossidabile da 7,5 cm sulla punta del tubo da 600 μL contenente il campione (Figura 1E). Quindi, trasferire questa provetta perforata in una nuova provetta sterilizzata da 1,5 ml e centrifugare i campioni a 12.000 x g per 10 minuti a 4 °C, come riportato in precedenza¹⁷, per recuperare il volume delle lacrime diluite. Il volume del film lacrimale (surnatante) si troverà sul fondo del tubo.
3. Creare un pool proteico combinando il surnatante recuperato da tutti i campioni. In questo esperimento è stato ottenuto un volume totale di circa 200 μL.
   NOTA: La produzione di strappi può durare più di 1 ora. Durante questo periodo, le lacrime possono ancora essere raccolte.
4. Quantificare il contenuto proteico totale del pool lacrimale utilizzando il metodo standard di Bradford²².

4. Analisi SDS-PAGE

1. Riscaldare i campioni di proteine a 99 °C per 4 minuti per denaturare le proteine. Agitare brevemente i campioni per mescolare i componenti.
2. Caricare 30 μg di contenuto proteico quantificato da ciascun campione su un gel SDS-PAGE al 10% (Tabella 1) ed eseguire i campioni a 90 V per 2 ore utilizzando un metodo standard²³.
3. Dopo l'elettroforesi, coprire il gel con una soluzione colorante (Tabella 1) e incubare per 30 minuti per colorare le proteine.
4. Sciacquare più volte il gel con la soluzione decolorante fino a quando lo sfondo diventa chiaro e le bande proteiche sono visibili.
5. Acquisizione di immagini con un sistema di documentazione su gel.

5. Isolamento dell'mRNA per qPCR e PCR digitale

1. Mettere le strisce in una provetta da microcentrifuga da 600 μl contenente 20 μl di acqua sterile. Praticare una puntura sulla punta della provetta contenente il campione, inserirlo in una nuova provetta sterilizzata da 1,5 ml e centrifugare, come precedentemente riportato in lacrime umane³, per 20 minuti a 2.000 x g a 4 °C (Figura 1E-H).
2. Creare un pool da tutti gli esempi. Il volume recuperato di questo esperimento è stato di circa 22 μL di surnatante per ogni topo, cioè 66 μL di volume totale. Posizionare le provette su ghiaccio secco per evitare la degradazione delle biomolecole.
3. Aggiungere 200 μl di soluzione monofasica di fenolo e isotiocianato di guanidinio (ottenuto commercialmente) e omogeneizzare mediante pipettaggio. Lasciate riposare per 5 minuti a temperatura ambiente. In questa fase, i campioni possono essere conservati a -20 °C per diverse settimane o a -70 °C per diversi mesi.
4. Aggiungere 40 μl di cloroformio e mescolare a vortice per 15 s. Lasciate riposare per 2 minuti a temperatura ambiente. Centrifugare a 10.000 x g per 15 min a 4°C.
5. Trasferire con cautela la fase acquosa (senza assumere l'interfase) in una nuova provetta da 1,5 mL.
6. Aggiungere 0,5 μl di glicogeno (0,05 μg/μl) a 100 μl di isopropanolo e miscelare mediante pipettaggio. Il glicogeno è co-precipitato con l'RNA e non interferisce con i passaggi successivi.
7. Lasciare riposare per 10 minuti a -20 °C. Centrifugare a 10.000 x g per 10 min a 4 °C. Decantare rapidamente il surnatante.
8. Aggiungere 200 μl di etanolo freddo al 75% e risospendere il pellet di RNA mediante vortex. Centrifugare a 8.000 x g per 5 min a 4 °C.
9. Decantare l'etanolo. Senza capovolgere il tubo, lasciarlo asciugare all'aria per 20-30 minuti. Aggiungere 20 μl di acqua priva di RNasi e risospendere.
10. Procedere con la lettura della densità ottica nello spettrofotometro a microvolumi a 260 nm e 280 nm per valutare la purezza dell'RNA. I campioni devono essere su ghiaccio.
    NOTA: Le bande ribosomiali 28S e 18S non possono essere osservate utilizzando un gel di agarosio a causa della natura del campione. La presenza di altri RNA, come miRNA o mRNA, può essere analizzata utilizzando un bioanalizzatore, come mostrato in precedenza¹⁸.
11. Sintetizzare il cDNA dall'RNA lacrimale utilizzando un kit commerciale secondo il protocollo del produttore.
    1. Inizia con un RNA in ingresso in un intervallo da 10 ng-5000 ng; a seconda del kit utilizzato, mescolarlo con 1 μL di Oligo (dT) e fino a 12 μL di acqua priva di RNasi. Centrifugare a 500 x g per 30 s e incubare a 65 °C per 5 min.
    2. Aggiungere alla provetta di miscelazione 4 μl di tampone di reazione 5x, 1 μl di inibitore della RNasi, 2 μl di miscela dNTP e 1 μl di trascrittasi inversa.
    3. Centrifugare il tubo a 500 x g per 30 s per tirare giù la miscela. Quindi, incubare la provetta a 42 °C per 60 minuti. Terminare la reazione incubando la provetta a 70 °C per 10 minuti.
12. A causa della bassa concentrazione di mRNA nelle lacrime, si consiglia di utilizzare cDNA non diluito per la qPCR²⁴. Per questo esperimento sono stati utilizzati 150 ng di cDNA. Eseguire la qPCR utilizzando i primer DNMT3a :
    Avanti: GCCGAATTGTGTCTTGGTGGATGACA, Rovescio: CCTGGTGGAATGCACTGCAGAAGGA e GAPDH primer:
    Avanti: ACTGGCATGGCCCCGTGTTCTTA, Indietro: TCAGTGTAGCCCAAGATGCCCTTC seguendo le istruzioni dei produttori e le procedure delle apparecchiature.
    1. Per il ciclo qPCR, utilizzare il seguente programma: Denaturazione iniziale: 95 °C per 10 minuti seguiti da 45 cicli di C 95°C - 15 s, 60 °C - 30 s e 72 °C - 30 s, terminare con un'estensione finale a 72 °C per 5 minuti.
    2. Eseguire un'analisi della curva di fusione per valutare la presenza di dimeri di primer o ampliconi non specifici nella reazione. La rampa di temperatura è partita da 50 °C fino a 99 °C finali, con una tenuta iniziale di 90 s per il primo passaggio e una tenuta di 5 s tra ogni fase.
    3. Per la dPCR²⁵, eseguire diluizioni seriali per ottimizzare la quantità di cDNA necessaria per rilevare l'mRNA di interesse. In questo esperimento, utilizzare le seguenti diluizioni di cDNA in acqua priva di nucleasi: 150 ng, 75 ng, 37,5 ng e 18,75 ng di cDNA. Sono stati utilizzati i primer per DNMT3a precedentemente menzionati. Per il ciclo dPCR, utilizzare il seguente programma: denaturazione iniziale: 95 °C per 2 minuti seguiti da 40 cicli di 95 °C - 15 s e 60 °C - 30 s.

Risultati

Il protocollo descritto in questo documento fornisce un metodo semplice ed economico per ottenere informazioni molecolari dal liquido lacrimale utilizzando tecniche comunemente disponibili nella maggior parte dei laboratori di biologia molecolare. Inoltre, il protocollo può essere ampliato impiegando tecniche altamente sensibili come l'ELISA per il rilevamento dell'attività enzimatica.

Dopo queste procedure, la resa proteica totale è stata di circa 3-4 μg/μL. L'analisi della pagina SDS co...

Discussione

Il liquido lacrimale è facilmente accessibile e la determinazione dei biomarcatori nelle lacrime può essere impiegata come tecnica complementare di successo per la diagnosi precoce di varie malattie umane²⁷. Mentre l'analisi biochimica della composizione lacrimale in modelli animali sperimentali integra questo approccio e promette progressi significativi nella comprensione delle basi molecolari delle malattie, c'è una scarsità di dati e protocolli disponibili, che ci ha portato a svilupparne u...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-mercaptoethanol	Gibco	1985023
2x Laemmli buffer	Bio-Rad	16-0737
Acetic Acid	Quimica Meyer	64-19-7
Acrylamide	Sigma-Aldrich	A4058
Bradford Reagent	Sigma-Aldrich	B6916
Chloroform	Sigma-Aldrich	1003045143
Coomassie Blue R 250	US Biological	6104-59-2
Ethanol	Quimica Rique	64-17-5
GeneRuler 1kb plus DNA Ladder	Thermofisher scientific	SM1331
Glycerol	US Biological	G8145
Glycine	SANTA CRUZ	SC- 29096
Glycogen	Roche	10901393001
HCl	Quimica Rique	7647-01-0
Isopropyl alcohol	Quimica Rique	67-63-0
Methanol	Quimica Meyer	67-56-1
Micro tubes 1.5 ml	Axygen	MCT-150-C
Micro tubes 600 µl	Axygen	MCT-060-C
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
PCR tubes & strips	Novasbio	PCR 0104
Pilocarpine	Sigma-Aldrich	P6503-10g
Protease inhibitor	Roche	11873580001
QIAcuity EvaGreen PCR Kit (5mL)	Qiagen	250112
QIAcuity Nanoplate 26k 24-well (10)	Qiagen	250001
Real qPlus 2x Master Mix Green	Ampliqon	A323402
RevertAid First Strad cDNA Synthesis Kit	Thermofisher scientific	K1622
Schirmer's test strips	Laboratorio Santgar	SANT1553
SDS	Sigma-Aldrich	L3771
TEMED	Sigma aldrich	102560430
TRI reagent	Sigma-Aldrich	T9424-200ML	monophasic solution of phenol and guanidinium isothiocyanate
Tris	US Biological	T8650
Tris base	Chem Cruz	sc-3715A