Optimisation de la collecte de larmes chez la souris pour l’analyse de l’ARNm et des protéines

Résumé

L’identification de biomarqueurs d’ARN et de protéines à partir de déchirures dans des modèles murins est très prometteuse pour le diagnostic précoce de diverses maladies. Ce manuscrit fournit un protocole complet pour optimiser l’efficacité et l’efficience de l’isolement de l’ARNm et des protéines à partir de larmes de souris.

Résumé

Le film lacrymal est un biofluide hautement dynamique capable de refléter les changements moléculaires associés à la pathologie, non seulement dans la surface oculaire, mais aussi dans d’autres tissus et organes. L’analyse moléculaire de ce biofluide offre un moyen non invasif de diagnostiquer ou de surveiller des maladies, d’évaluer l’efficacité d’un traitement médical et d’identifier d’éventuels biomarqueurs. En raison du volume d’échantillon limité, la collecte d’échantillons lacrymaux nécessite des compétences spécifiques et des outils appropriés pour garantir une qualité élevée et une efficacité maximale. Diverses méthodologies d’échantillonnage des larmes ont été décrites dans des études humaines. Dans cet article, une description complète d’un protocole optimisé est présentée, spécialement conçu pour extraire des informations sur les protéines liées aux larmes à partir de modèles animaux expérimentaux, en particulier de souris. Cette méthode comprend la stimulation pharmacologique de la production de larmes chez des souris âgées de 2 mois, suivie d’un prélèvement d’échantillons à l’aide de bandelettes Schirmer et de l’évaluation de l’efficacité et de l’efficience du protocole par des procédures standard, SDS-PAGE, qPCR et PCR numérique (dPCR). Ce protocole peut être facilement adapté pour l’étude de la signature de la protéine lacrymale dans une variété de paradigmes expérimentaux. En établissant un protocole d’échantillonnage des larmes abordable, standardisé et optimisé pour les modèles animaux, l’objectif était de combler le fossé entre la recherche humaine et animale, en facilitant les études translationnelles et en accélérant les progrès dans le domaine de la recherche sur les maladies oculaires et systémiques.

Introduction

Les larmes sont considérées comme un ultrafiltrat plasmatique et ont également été décrites comme un liquide intermédiaire entre le sérum plasmatique et le liquide céphalo-rachidien en raison d’un chevauchement important des biomolécules qu’elles partagent¹. Il a été rapporté que les larmes humaines contiennent des protéines, des lipides lacrymaux, des métabolites et des électrolytes². Récemment, d’autres biomolécules telles que les ARNm, les miARN et les vésicules extracellulaires ont également été identifiées 3,4,5,6,7.

Chez l’homme, les déchirures basales sont situées dans le film lacrymal, qui se compose de trois couches : la couche lipidique externe, qui maintient la surface des larmes lisse pour nous permettre de voir à travers et d’empêcher l’évaporation des larmes ; la couche aqueuse moyenne, qui maintient l’œil hydraté, repousse les bactéries, protège la cornée et constitue 90 % du film lacrymal ; et enfin, la couche de mucine, une famille de protéines de haut poids moléculaire qui sont en contact avec la cornée et permettent à la larme d’adhérer à l’œil⁸. La distribution des larmes sur la surface oculaire commence par la sécrétion de la glande lacrymale. Ce liquide est ensuite guidé à travers les canaux lacrymaux pour passer sur la surface de l’œil et s’écouler dans des canaux de drainage. Chaque clignement permet aux larmes de se disperser uniformément sur l’ensemble de l’œil, le gardant humide⁹.

Le film lacrymal est un biofluide hautement dynamique capable de refléter les changements moléculaires qui se produisent non seulement sur la surface oculaire, mais aussi dans d’autres tissus et organes. L’analyse de l’expression différentielle dans ce biofluide représente une approche prometteuse pour la découverte de biomarqueurs dans les maladies humaines^10,11. L’utilisation du film lacrymal comme source de biomarqueurs pour le diagnostic précoce de diverses pathologies a été grandement facilitée par la présence de méthodes de collecte non invasives. La méthode la plus courante pour recueillir les larmes dans les cliniques humaines et vétérinaires implique un support à base de membrane (bande de Schirmer), qui fonctionne sur le principe de l’action capillaire, permettant à l’eau contenue dans les larmes de se déplacer sur la longueur d’une bandelette de test en papier ou de tubes capillaires placés dans le sac conjonctival inférieur du sujet 12,13,14. Malgré la limitation inhérente à l’obtention d’un petit volume d’échantillon par cette méthode, l’analyse biochimique de la composition des larmes à l’aide de diverses techniques sensibles a facilité l’identification de molécules biomarqueurs potentielles^11,15. Les protocoles d’optimisation et d’évaluation de l’élution des protéines lacrymales à partir des bandelettes et des capillaires de Schirmer chez les patients humains sont bien documentés^16,17. Cependant, il existe des descriptions complètes de protocoles optimisés spécialement conçus pour extraire des informations moléculaires liées aux déchirures à partir de modèles animaux expérimentaux, mais elles sont rares. Les méthodes existantes, telles que l’induction de larmes par stimulation directe de la glande lacrymale¹⁸, tout en permettant la collecte de plus grands volumes, sont invasives et peuvent causer de l’inconfort aux animaux. Des méthodes non invasives, telles que la collecte de larmes sur la surface oculaire, ont été décrites comme un moyen d’isoler l’ADN et les miARN^19,21.

Ce protocole vise à établir une méthode rentable et optimisée pour la collecte et le traitement des larmes chez la souris. La méthode privilégie la non-invasivité tout en obtenant des volumes de larmes suffisants adaptés à l’analyse moléculaire grâce à des techniques telles que SDS-PAGE, qPCR et dPCR. Les informations extraites sur le contenu des protéines et de l’ARNm peuvent ensuite être utilisées pour identifier des biomarqueurs potentiels dans les modèles expérimentaux existants de la maladie.

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Protocole

Toutes les procédures décrites ici ont été approuvées par le Comité d’Éthique Animale de Cinvestav (CICUAL, # 0354/23). Les animaux de laboratoire ont été traités et manipulés en stricte conformité avec les directives d’utilisation des animaux de la revue et conformément à la déclaration de l’Association pour la recherche en vision et en ophtalmologie (ARVO) pour l’utilisation des animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle. La santé oculaire avant et après les procédures a été évaluée en évaluant les écoulements oculaires, les paupières enflées, les anomalies oculaires et les changements de comportement.

1. Animaux et préparation des réactifs

1. Utiliser trois souris mâles C57BL/6 de 2 mois par répétition pour la procédure, avec un poids de départ de ~25 g (Figure 1). Traitez chaque souris individuellement et placez-la sur un coussin chauffant pour maintenir la chaleur.
2. Pour induire la sécrétion lacrymale, préparer une solution mère de pilocarpine à 20 mg/mL en utilisant de l’eau stérile.
3. Coupez les bandelettes de test de Schirmer à une longueur de 5 mm et pliez chaque bande à l’encoche à un angle de 90°.
4. Préparez 250 μL d’eau stérile avec un inhibiteur de protéase (1 comprimé pour 50 mL, selon les instructions du fabricant).

2. Stimulation et collecte de la production de larmes

1. Pesez chaque souris individuellement pour calculer la posologie appropriée des traitements.
2. Pour stimuler la production de larmes, administrer 30 mg/kg de pilocarpine par voie intrapéritonéale à l’aide d’une seringue à insuline de 6 mm (figure 1B). Attendez 2 minutes après l’injection du médicament pour que ses effets se manifestent.
   REMARQUE : Il n’a pas été possible d’obtenir des données sur des animaux non stimulés en raison de la disponibilité limitée de liquide lacrymal.
3. Prélevez les larmes en plaçant l’extrémité de chaque fragment de bande Schirmer au centre de la paupière inférieure à l’aide d’une pince à épiler et maintenez-la en place jusqu’à ce que la larme atteigne la limite de la bande (Figure 1C). Ensuite, remplacez la bande. Placez séquentiellement 2 bandes Schirmer dans chaque œil, avec un intervalle de 2 minutes entre les bandes pour le prélèvement. Le processus de collecte des larmes nécessite environ quatre fragments de bande sur 10 minutes par souris.
4. Placez les fragments de la bande Schirmer dans des tubes stériles sur de la glace pour éviter la dégradation des composants. Dès que la collection est terminée, commencez le traitement des déchirures.

3. Isolement des protéines

1. Placez les fragments de bandelettes dans un tube de microcentrifugation de 600 μL contenant 20 μL d’eau stérile avec un inhibiteur de protéase et centrifugez-les pendant 1 h à 600 x g à 4 °C, comme indiqué précédemment¹⁷ (figure 1D).
2. Effectuer une ponction à l’aide d’une aiguille d’injection en acier inoxydable de 7,5 cm à l’extrémité du tube de 600 μL contenant l’échantillon (figure 1E). Ensuite, transférez ce tube perforé dans un nouveau tube stérilisé de 1,5 mL et centrifugez les échantillons à 12 000 x g pendant 10 min à 4 °C, comme indiqué^{précédemment 17}, pour récupérer le volume des larmes diluées. Le volume du film lacrymal (surnageant) se trouvera au fond du tube.
3. Créez un pool de protéines en combinant le surnageant récupéré dans tous les échantillons. Dans cette expérience, un volume total d’environ 200 μL a été obtenu.
   REMARQUE : La production de larmes peut durer plus de 1 heure. Pendant ce temps, les larmes peuvent encore être recueillies.
4. Quantifier la teneur totale en protéines du bain lacrymal à l’aide de la méthode standard de Bradford²².

4. Analyse de la FDS-PAGE

1. Chauffer les échantillons de protéines à 99 °C pendant 4 min pour dénaturer les protéines. Vortex brièvement les échantillons pour mélanger les composants.
2. Charger 30 μg de teneur en protéines quantifiée de chaque échantillon sur un gel SDS-PAGE à 10 % (tableau 1) et analyser les échantillons à 90 V pendant 2 h en utilisant la méthode standard²³.
3. Après l’électrophorèse, recouvrez le gel d’une solution de coloration (tableau 1) et incubez pendant 30 minutes pour colorer les protéines.
4. Rincez le gel avec la solution décolorante plusieurs fois jusqu’à ce que l’arrière-plan devienne clair et que des bandes de protéines soient visibles.
5. Acquérez des images avec un système de documentation sur gel.

5. Isolement de l’ARNm pour la qPCR et la PCR numérique

1. Placez les bandelettes dans un tube de microcentrifugation de 600 μL contenant 20 μL d’eau stérile. Faites une ponction à l’extrémité du tube contenant l’échantillon, placez-le dans un nouveau tube stérilisé de 1,5 mL et centrifugez, comme indiqué précédemment dans Human Tears³, pendant 20 min à 2 000 x g à 4 °C (figure 1E-H).
2. Créez un pool à partir de tous les échantillons. Le volume récupéré de cette expérience était d’environ 22 μL de surnageant pour chaque souris, c’est-à-dire 66 μL de volume total. Placez les tubes sur de la glace carbonique pour éviter la dégradation des biomolécules.
3. Ajouter 200 μL de solution monophasique de phénol et d’isothiocyanate de guanidinium (obtenue dans le commerce) et homogénéiser par pipetage. Laisser reposer 5 min à température ambiante. À cette étape, les échantillons peuvent être conservés à -20 °C pendant plusieurs semaines ou à -70 °C pendant plusieurs mois.
4. Ajouter 40 μL de chloroforme et mélanger au tourbillon pendant 15 s. Laisser reposer 2 min à température ambiante. Centrifugeuse à 10 000 x g pendant 15 min à 4°C.
5. Transférez soigneusement la phase aqueuse (sans prendre l’interphase) dans un nouveau tube de 1,5 ml.
6. Ajouter 0,5 μL de glycogène (0,05 μg/μL) à 100 μL d’isopropanol et mélanger par pipetage. Le glycogène est co-précipité avec l’ARN et n’interfère pas avec les étapes suivantes.
7. Laisser reposer 10 min à -20 °C. Centrifugeuse à 10 000 x g pendant 10 min à 4 °C. Décantez rapidement le surnageant.
8. Ajouter 200 μL d’éthanol froid à 75 % et remettre en suspension la pastille d’ARN par vortex. Centrifugeuse à 8 000 x g pendant 5 min à 4 °C.
9. Décantez l’éthanol. Sans retourner le tube, laissez-le sécher à l’air libre pendant 20-30 min. Ajouter 20 μL d’eau sans RNase et remettre en suspension.
10. Procédez à la lecture de la densité optique dans le spectrophotomètre de microvolume à 260 nm et 280 nm pour évaluer la pureté de l’ARN. Les échantillons doivent être sur de la glace.
    REMARQUE : Les bandes ribosomales 28S et 18S ne peuvent pas être observées à l’aide d’un gel d’agarose en raison de la nature de l’échantillon. La présence d’autres ARN, tels que les miARN ou les ARNm, peut être analysée à l’aide d’un bioanalyseur, comme montré précédemment¹⁸.
11. Synthétisez l’ADNc à partir de l’ARN lacrymal à l’aide d’un kit commercial conformément au protocole du fabricant.
    1. Commencer avec un ARN d’entrée dans une plage de 10 ng à 5000 ng ; selon le kit utilisé, mélangez-le avec 1 μL d’Oligo (dT) et jusqu’à 12 μL d’eau sans RNase. Faites-le tourner à 500 x g pendant 30 s et incubez à 65 °C pendant 5 min.
    2. Ajouter au tube de mélange 4 μL de tampon de réaction 5x, 1 μL d’inhibiteur de RNase, 2 μL de mélange dNTP et 1 μL de transcriptase inverse.
    3. Faites tourner le tube à 500 x g pendant 30 s pour tirer le mélange vers le bas. Ensuite, incubez le tube à 42 °C pendant 60 min. Terminez la réaction en incubant le tube à 70 °C pendant 10 min.
12. En raison de la faible concentration d’ARNm dans les larmes, il est recommandé d’utiliser de l’ADNc non dilué pour la qPCR²⁴. Pour cette expérience, 150 ng d’ADNc ont été utilisés. Effectuez une qPCR à l’aide d’amorces DNMT3a :
    Avant : GCCGAATTGTGTCTTGGTGGATGACA, Inverse : CCTGGTGGAATGCACTGCAGAAGGA et amorces GAPDH :
    Avant : ACTGGCATGGCCTTCCGTGTTCTTA, Marche arrière : TCAGTGTAGCCCAAGATGCCCTTC en suivant les instructions des fabricants et les procédures relatives à l’équipement.
    1. Pour le cycle qPCR, utilisez le programme suivant : Dénaturation initiale : 95 °C pendant 10 min suivie de 45 cycles de C 95 °C - 15 s, 60 °C - 30 s et 72 °C - 30 s, se terminant par une extension finale à 72 °C pendant 5 min.
    2. Effectuez une analyse de la courbe de fusion pour évaluer la présence de dimères d’amorce ou d’amplicons non spécifiques dans la réaction. La rampe de température a commencé de 50 °C à 99 °C finale, avec une tenue initiale de 90 s pour la première étape et une tenue de 5 s entre chaque étape.
    3. Pour la dPCR²⁵, effectuez des dilutions en série afin d’optimiser la quantité d’ADNc nécessaire pour détecter l’ARNm d’intérêt. Dans cette expérience, utilisez les dilutions suivantes d’ADNc dans de l’eau exempte de nucléases : 150 ng, 75 ng, 37,5 ng et 18,75 ng d’ADNc. Des amorces pour DNMT3a mentionnées précédemment ont été utilisées. Pour le cycle dPCR, utilisez le programme suivant : dénaturation initiale : 95 °C pendant 2 min suivie de 40 cycles de 95 °C - 15 s et 60 °C - 30 s.

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Résultats

Le protocole décrit dans cet article fournit une méthode simple et abordable pour obtenir des informations moléculaires à partir de liquide lacrymal en utilisant des techniques couramment disponibles dans la plupart des laboratoires de biologie moléculaire. De plus, le protocole peut être mis à l’échelle en utilisant des techniques très sensibles telles que ELISA pour la détection de l’activité enzymatique.

Après ces procédures, le rendement total en protéines était d’envi...

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Discussion

Le liquide lacrymal est facilement accessible, et la détermination de biomarqueurs dans les larmes peut être utilisée comme une technique complémentaire réussie pour le diagnostic précoce de diverses maladies humaines²⁷. Bien que l’analyse biochimique de la composition des larmes dans des modèles animaux expérimentaux complète cette approche et promette des progrès significatifs dans la compréhension de la base moléculaire des maladies, les données et les protocoles disponibles sont...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-mercaptoethanol	Gibco	1985023
2x Laemmli buffer	Bio-Rad	16-0737
Acetic Acid	Quimica Meyer	64-19-7
Acrylamide	Sigma-Aldrich	A4058
Bradford Reagent	Sigma-Aldrich	B6916
Chloroform	Sigma-Aldrich	1003045143
Coomassie Blue R 250	US Biological	6104-59-2
Ethanol	Quimica Rique	64-17-5
GeneRuler 1kb plus DNA Ladder	Thermofisher scientific	SM1331
Glycerol	US Biological	G8145
Glycine	SANTA CRUZ	SC- 29096
Glycogen	Roche	10901393001
HCl	Quimica Rique	7647-01-0
Isopropyl alcohol	Quimica Rique	67-63-0
Methanol	Quimica Meyer	67-56-1
Micro tubes 1.5 ml	Axygen	MCT-150-C
Micro tubes 600 µl	Axygen	MCT-060-C
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
PCR tubes & strips	Novasbio	PCR 0104
Pilocarpine	Sigma-Aldrich	P6503-10g
Protease inhibitor	Roche	11873580001
QIAcuity EvaGreen PCR Kit (5mL)	Qiagen	250112
QIAcuity Nanoplate 26k 24-well (10)	Qiagen	250001
Real qPlus 2x Master Mix Green	Ampliqon	A323402
RevertAid First Strad cDNA Synthesis Kit	Thermofisher scientific	K1622
Schirmer's test strips	Laboratorio Santgar	SANT1553
SDS	Sigma-Aldrich	L3771
TEMED	Sigma aldrich	102560430
TRI reagent	Sigma-Aldrich	T9424-200ML	monophasic solution of phenol and guanidinium isothiocyanate
Tris	US Biological	T8650
Tris base	Chem Cruz	sc-3715A