خيوط سيليكون مطلية يدويا لنماذج انسداد الشريان الدماغي الأوسط للفئران

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة مباشرة لإنشاء خيوط مغلفة لنموذج انسداد الشريان الدماغي الأوسط (MCAO) في الفئران باستخدام خيوط السيليكون والنايلون وإبر المحقنة. تسمح هذه الطريقة بإنتاج خيوط ذات قطر ثابت وأطوال تغليف سيليكون مختلفة مصممة خصيصا لتلبية الاحتياجات التجريبية.

Abstract

مع تقدم سكان العالم في العمر ، ارتفعت السكتة الدماغية الإقفارية لتصبح السبب الرئيسي الثاني للإعاقة والوفيات في جميع أنحاء العالم ، مما يضع عبئا هائلا على كل من المجتمع والأسر. على الرغم من أن العلاجات مثل انحلال الخثار الوريدي والتدخلات داخل الأوعية الدموية يمكن أن تحسن بشكل كبير النتائج للمرضى الذين يعانون من السكتة الدماغية الإقفارية الحادة ، إلا أن نسبة صغيرة فقط من الأفراد يستفيدون من هذه العلاجات. لتعزيز فهمنا للمرض واكتشاف علاجات أكثر فعالية ، يعمل الباحثون باستمرار على تطوير وتحسين النماذج الحيوانية. من بين هؤلاء ، يبرز نموذج انسداد الشريان الدماغي الأوسط (MCAO) باعتباره النموذج الأكثر استخداما في أبحاث أمراض الأوعية الدموية الدماغية. الفتيل المستخدم في هذا النموذج أمر بالغ الأهمية لتطويره. يحدد هذا البروتوكول طريقة لإنشاء خيوط بأقطار متسقة وأطوال متفاوتة من طلاء السيليكون. أظهر نموذج MCAO الذي تم إنتاجه باستخدام هذه الطريقة في الفئران C57 نجاحا واتساقا عاليا ، مما يوفر أداة قيمة للتحقيقات المصممة خصيصا في أمراض الأوعية الدموية الدماغية الإقفارية.

Introduction

السكتة الدماغية هي واحدة من أكثر أسباب الوفيات والعجز انتشارا في جميع أنحاء العالم. السكتات الدماغية الإقفارية والنزفية هي الأنواع الأساسية للأحداث الدماغية الوعائية ، حيث تمثل السكتات الدماغية الإقفارية حوالي 87٪ من الحالات^1،2،3. حاليا ، هناك طريقتان للعلاج للمرضى الذين يعانون من السكتة الدماغية الإقفارية: العلاج الدوائي باستخدام منشط البلازمينوجين المؤتلف للأنسجة (rtPA) واستئصال الخثرة الميكانيكي. ومع ذلك ، فإن النافذة العلاجية الضيقة ومعايير الاستبعاد الواسعة تحد من تطبيق هذه العلاجات ، ولا تستفيد منها سوى أقلية من المرضى. هذا يؤكد الحاجة إلى بذل جهود متواصلة لتحسين علاجات السكتة الدماغية^{الإقفارية 4،5}. النماذج في المختبر غير كافية لتكرار الاستجابات الفيزيولوجية المرضية المعقدة بعد السكتة الدماغية ، مما يجعل النماذج الحيوانية مكونا لا غنى عنه في أبحاث السكتة الدماغية قبل السريرية. غالبا ما يحدث نقص التروية الدماغية البؤري البشري بسبب انسداد التخثر أو الانسداد الصمي للشريان الدماغي الأوسط (MCA) ، مما يجعل نماذج القوارض المصممة لمحاكاة انسداد MCA (MCAO) وثيقة الصلة^{للغاية 6}.

يسهل نموذج MCAO الناجم عن الخيوط ، وهو الأكثر اعتمادا على نطاق واسع في أبحاث السكتة الدماغية ، الانسداد في بداية الشريان الدماغي الأوسط (MCA) وإعادة التروية اللاحقة ، مما يؤدي إلى احتشاء واسع النطاق عبر المناطق تحت القشرية والقشرية من الدماغ. تكمن ميزة هذا النموذج في قدرته على استعادة تدفق الدم بعد إحداث نقص تروية بؤرية ، وبالتالي موازاة العمليات الفيزيولوجية المرضية التي لوحظت في السكتة الدماغية^{البشرية 7}. بالإضافة إلى ذلك ، يحاكي النموذج إصابة إعادة التروية ، وهو عامل حاسم في مدى الضرر⁸. ومع ذلك ، فإن نموذج MCAO له قيود ، بما في ذلك التباين في حجم الاحتشاء ، حيث من المحتمل أن يصل الانحراف المعياري إلى 64٪ من متوسط القيمة في بعض الدراسات⁹. على الرغم من أكثر من ثلاثة عقود من الاستخدام ، فإن الجهود المبذولة لتعزيز موثوقية النموذج مستمرة ، ومع ذلك لا تزال هناك اختلافات كبيرة في حجم الآفة الإقفارية عبر الدراسات والمختبرات^10،11،12.

تقدم هذه المقالة خيوطا ذاتية الصنع لتحفيز النماذج التي تقيم درجات العجز العصبي ومناطق الاحتشاء الدماغي. يفحص العلاقة بين أطوال الخيوط المطلية بالسيليكون ونجاح واستقرار نموذج MCAO. تنتج تقنية الإنتاج هذه خيوطا ذات تناسق جدير بالثناء ، مما يساهم في تطوير نموذج MCAO مستقر نسبيا.

Protocol

التزمت جميع الإجراءات الحيوانية بالإجراءات والمعايير التجريبية المعتمدة من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسية لمستشفى مقاطعة شانشي الشعبية (رقم الموافقة: 2024 لجنة الأخلاقيات الطبية الإقليمية رقم 64). كانت الفئران المستخدمة في هذه التجربة من ذكور الفئران C57BL / 6 ، تتراوح أعمارهم بين 8 و 10 أسابيع ، ووزنها 24-26 جم. تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. تحضير خيوط

1. وضع علامة على الفتيل الأصلي: لف خياطة النايلون 6-0 بالتساوي حول لوحة المسطرة البلاستيكية. ضع علامات على بعد 5 مم و 10 مم من رأس الفتيل (بما في ذلك نقطة علامة الطلاء ونقطة علامة عمق الإدخال).
2. قم بقصها عموديا لأسفل بشفرة للتأكد من أن كلا الطرفين دائريان تماما ، مما ينتج عنه خيوط أولية بطول 2 سم (الشكل 1).
3. تصنيع جهاز الطلاء: استخدم ملقطا مرقئا لقطع رأس الإبرة لحقنة 26 جم ، ثم قم بتلميع ثقب الإبرة في دائرة مثالية بورق الصنفرة. ارسم 2 مل من مانع التسرب السيليكوني K-704 بحقنة 10 مللي كلفن ، وأخيرا ، قم بتوصيل رأس الإبرة بالمحقنة.
4. طلاء الفتيل: أدخل الفتيل الأولي في فتحة الإبرة المعدة حتى الموضع المحدد 5 مم أو 10 مم. ادفع المحقنة ببطء وثبات حتى يتم طلاء الفتيل بالكامل تحت مجهر مجسم (الشكل 2).
5. ضبط الفتيل المطلي: قم بتثبيت الفتيل المطلي في وضع مستقيم بشريط لاصق وانتظر حوالي 20 دقيقة حتى يتم ضبط السيليكون بالكامل.
6. التعقيم والتعبئة والتغليف: انقع الخيوط المحضرة في كحول 75٪ ، وامسحها حتى تجف بقطعة قطن ، ثم قم بتعبئتها في أنابيب طرد مركزي سعة 5 مل.

2. نموذج MCAO

ملاحظة: تم تعقيم الأدوات الجراحية عن طريق التعقيم (121 درجة مئوية عند 15 رطل لكل بوصة مربعة لمدة 60 دقيقة). تم تعقيم طاولة الجراحة والمعدات الأخرى باستخدام 75٪ من الإيثانول. تم صيام الفئران لمدة 8 ساعات قبل الجراحة ولكن سمح لها بحرية الوصول إلى الماء.

1. يجب تطبيق 5 ملغ/كغ من ميلوكسيكام تحت الجلد لعلاج التسكين قبل 60 دقيقة من الجراحة. قم بتوصيل بطانية حرارية للحفاظ على درجة حرارة جسم الماوس عند 37 درجة مئوية أثناء التخدير.
2. تحفيز التخدير بنسبة 4٪ من الأيزوفلوران حتى تتوقف الحركات العفوية وارتعاش الشعيرات ، ثم حافظ على التخدير بنسبة 1.5٪ (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا). ضع مرهم العين على كلتا العينين.
3. ضع الفأر في وضع ضعيف ، وقم بتأمين رأسه وأطرافه ، وحلق شعر رقبته وأعلى صدره ، وقم بتطهير الجلد بنسبة 75٪ من الإيثانول من الداخل إلى الخارج.
4. قم بعمل شق جلدي بطول 2.5 سم على طول خط الوسط للرقبة ، من الفك السفلي إلى القص.
5. قم بتشريح عضلات الرقبة اليمنى بصراحة لفضح غمد الشريان السباتي. استخدم ملقط العين لفتح الغمد وفصل الشريان السباتي المشترك (CCA) والشريان السباتي الخارجي (ECA) والشريان السباتي الداخلي (ICA) ، مع الحرص على تجنب إزعاج العصب المبهم.
6. قم بربط CCA مؤقتا بعقدة منزلقة قبل التشعب وقم بتثبيت ICA بمشبك شريان جراحي مجهري.
7. كي الشريان الغرقي العلوي من ECA باستخدام قلم تخثر ثنائي القطب.
8. اترك خيطين على ECA للربط: أحدهما على الطرف البعيد للربط الدائم والآخر على الطرف القريب مع عقدة فضفاضة للاستخدام في المستقبل. قم بعمل شق بحجم 0.5 مم تقريبا بين الرباطين على ECA باستخدام مقص العيون لإدخال الفتيل.
9. أدخل الفتيل المطلي بالسيليكون مقاس 5 مم أو 10 مم في CCA من خلال الشق ثم قم بتثبيته عن طريق شد العقدة السائبة.
10. بعد قطع الطرف البعيد من ECA وإزالة المشبك من ICA, سحب الفتيل إلى تشعب CCA. بعد ذلك ، اقلب الفتيل وقدمه إلى ICA العميق حتى يشعر المرء بالمقاومة. اسحب الفتيل قليلا وقم بتثبيته عن طريق شد العقدة.
11. خياطة جلد بخياطة 3-0 وتطهير الجرح باليود. ضع الماوس في غرفة الاسترداد لمدة 1 ساعة.
12. قم بتخدير الماوس مرة أخرى ، وقم بإزالة الفتيل برفق ، واربط خيط ربط ECA الذي يثبت الفتيل ، وحرر عقدة CCA لاستعادة تدفق الدم وإعادة إنفاذ الشريان الدماغي الأوسط.
13. تقليم الخيوط الزائدة ، وخياطة جلد الرقبة ، وتطهير المنطقة مرة أخرى.

3. عملية الشام

1. للعمليات الوهمية ، أدخل خيوطا مطلية بالسيليكون مقاس 7 مم لإغلاق الشريان الدماغي الأوسط الأيمن ثم اسحبه على الفور للسماح بإعادة التروية الفورية.
   ملاحظة: الإجراء اللاحق مطابق لتلك التي يتم إجراؤها على التي تخضع لنقص التروية الدماغية.

4. النقاط العصبية

1. ضع التجارب من كل مجموعة في حقل مفتوح وقم بإجراء تسجيل سلوكي بعد الجراحة بعد 4 ساعات من إعادة تروية نقص التروية الدماغية.
2. للحصول على نمذجة ناجحة ، ضع في اعتبارك الدرجات بين 1 و 3. تستند معايير التقييم إلى طريقة تسجيل لونجا¹⁰ ، كما هو مفصل في الجدول 1.
3. تقييم العجز العصبي وفقا لدرجات الشدة العصبية المعدلة (mNSS) ¹³ ، مع إجراء التقييمات في 24 ساعة و 72 ساعة بعد إعادة التروية (انظر الجدول 2).

5. نضح عبر القلب

1. تخدير الفأر باستخدام 1.5٪ بنتوباربيتال الصوديوم (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا). ضع الماوس مرة أخرى في قفصه وانتظر لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، اضغط على أصابع أصابع الماوس لاختبار عدم وجود ردود أفعال وضمان التخدير العميق.
2. ضع الفأر في وضع ضعيف على حامل رغوي وقم بتأمين أطرافه.
3. اقطع طرف إبرة 25 جم لخففها ، مما يمنع ثقب جدار الأبهر. قم بتوصيل الإبرة بحقنة مملوءة ب 20 مل من المحلول الملحي.
4. ارفع فرو الصدر واستخدم المقص لقطع الجلد لفضح عملية الخنجري. أمسك عملية الخنجري واقطعها أفقيا أسفلها لكشف الحجاب الحاجز عن طريق فتح طبقة العضلات. قطع الحجاب الحاجز بعناية بالمقص ، وتجنب تلف القلب.
5. اقطع على طول الجانب الخارجي من القص لفتح القفص الصدري على كلا الجانبين ، واقلب الجدار الأمامي للصدر ، وثبته بالمرقئ.
6. استخدم قطعة قطن لإزالة الدهون الموجودة في قاعدة القلب ، وتعريض جذر الشريان الأورطي.
7. قم بتأمين القلب بالملقط ، وأدخل الإبرة في قمة القلب ، وتقدم بشكل غير مباشر لأعلى حتى تظهر الإبرة من خلال جدار الأبهر. المشبك الإبرة في مكانها.
8. قم بعمل قطع صغير في الأذين الأيمن لمراقبة تدفق الدم. قم ببث المحلول الملحي بثبات بالمحقنة ، وراقب خروج الدم من الأذين الأيمن. بمجرد أن تصبح النفايات السائلة صافية ، أوقف التروية¹⁴.
9. بعد التروية ، اقطع رأس الفأر لحصاد الدماغ¹⁵ وضعه في فريزر -20 درجة مئوية لمزيد من المعالجة.

6. تقييم حجم الاحتشاء عن طريق تلطيخ TTC

1. قم بتجميد أنسجة المخ المشتراة بسرعة في فريزر -20 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة ، ثم ضعها على قالب تقطيع الدماغ المبرد مسبقا وقم بتقسيمها إلى شرائح بسمك 1 مم.
2. اغمر أقسام الدماغ التي تم الحصول عليها في محلول TTC بنسبة 2٪ واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
3. اغمر شرائح الدماغ في 4٪ بارافورمالدهيد طوال الليل والتقط صورا في اليوم التالي.
4. قم بقياس المنطقة المحشية لكل شريحة ومنطقة الدماغ الكلية باستخدام ImageJ. احسب نسبة حجم الاحتشاء باستخدام الصيغة: حجم الاحتشاء ٪ = (مجموع المناطق المحشية / مجموع إجمالي مناطق الدماغ) × 100٪.

النتائج

في إنشاء نموذج MCAO ، يتم عرض الأدوات الأساسية المستخدمة لتصنيع الخيوط والخيوط النهائية في الشكل 3. بعد إنتاج الخيوط ، يتم إنشاء نموذج MCAO عن طريق إدخال الفتيل من خلال الشريان السباتي الخارجي ، مع تسجيل مدة العملية. يتم تعريف النمذجة الناجحة من خلال درجة لون?...

Discussion

توضح هذه الدراسة طريقة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة لتصنيع الخيوط ، مما يؤكد جدواها في إنشاء نموذج MCAO. يمكن تعديل طول طبقة السيليكون للفتيل وفقا للاحتياجات التجريبية ، مما يوفر مرونة إضافية. حقق تحضير صمة خيوط 5 مم معدل نجاح بنسبة 100٪ دون حدوث أي نزيف تحت العنكبوتية (SAH) في ا...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL Syringe	Haidike Medical Products Co., Ltd.		Instrument for making filaments
2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride (TTC)	Sigma-Aldrich	G3005	Dye for TTC staining
24-well culture plate	Corning	CLS3527	Vessel for TTC staining
26 G syringe needle	Haidike Medical Products Co., Ltd.		Instrument for making filaments
4% paraformaldehyde	Servicebio	G1101	Tissue fixation
6-0 nylon suture	Haidike Medical Products Co., Ltd.		Materials for making filaments
Anesthesia system for isoflurane	Rwd Life Science Co., Ltd.	R610	Anesthetized animal
Bipolar electrocoagulation generator	Yirun Medical Instrument Co., Ltd.	ZG300	Equipment for surgery
Constant temperature water bath	Spring  Instrument Co., Ltd.	HH-M6	TTC staining
Eye ointment	Guangzhou Pharmaceutical	H44023098	Material for surgery
Heat blanket	ZH Biomedical Instrument Co., Ltd.		Maintain body temperatur
Isoflurane	Rwd Life Science Co., Ltd.	R510-22-10	Anesthetized animal
Meloxicam	Boehringer-Ingelheim	J20160020	Analgesia for animal
Microsurgical artery clamp	Shanghai Jinzhong Surgical Instruments Co., Ltd.	W40130	Instrument for surgery
Microsurgical hemostatic clamp forceps	Shanghai Jinzhong Surgical Instruments Co., Ltd.	M-W-0022	Instrument for surgery
Microsurgical instruments set	Rwd Life Science Co., Ltd.	SP0009-R	Equipment for surgery
Mouse thermometer	Hubei Dasjiaer Biotechnology	FT3400	Intraoperative temperature monitoring
Pentobarbital sodium	Sigma-Aldrich	P3761	Euthanized animal
Shaver	Joyu Electrical Appliances	PHC-920	Equipment for surgery
Silicone Sealant	Kafuter	K-704	Materials for making filaments
Stereomicroscope	Rwd Life Science Co., Ltd.	77001S	Equipment for surgery
Suture thread with needle (3-0)	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd.	F404SUS302	Equipment for surgery