Filamento revestido de silicone artesanal para modelos de oclusão da artéria cerebral média de camundongos

Resumo

Este protocolo descreve um método simples para criar filamentos revestidos para o modelo de oclusão da artéria cerebral média (MCAO) em camundongos usando silicone, suturas de náilon e agulhas de seringa. Este método permite a produção de filamentos com um diâmetro consistente e vários comprimentos de embalagem de silicone adaptados às necessidades experimentais.

Resumo

À medida que a população global envelhece, o AVC isquêmico aumentou e se tornou a segunda principal causa de incapacidade e mortalidade em todo o mundo, colocando um imenso fardo sobre a sociedade e as famílias. Embora tratamentos como trombólise intravenosa e intervenções endovasculares possam melhorar substancialmente os resultados para pacientes com AVC isquêmico agudo, apenas uma pequena porcentagem de indivíduos se beneficia dessas terapias. Para avançar nossa compreensão da doença e descobrir tratamentos mais eficazes, os pesquisadores estão continuamente desenvolvendo e refinando modelos animais. Dentre estes, destaca-se o modelo de oclusão da artéria cerebral média (MCAO) como o modelo mais comumente utilizado na pesquisa de doenças cerebrovasculares. O filamento utilizado neste modelo é crucial para o seu desenvolvimento. Este protocolo descreve um método para criar filamentos com diâmetros consistentes e comprimentos variados de revestimento de silicone. O modelo MCAO produzido usando este método em camundongos C57 demonstrou alto sucesso e consistência, oferecendo uma ferramenta valiosa para investigações personalizadas em doenças cerebrovasculares isquêmicas.

Introdução

O AVC é uma das causas mais prevalentes de mortalidade e incapacidade em todo o mundo. Os acidentes vasculares cerebrais isquêmicos e hemorrágicos são os principais tipos de eventos cerebrovasculares, sendo os acidentes vasculares cerebrais isquêmicos responsáveis por aproximadamente 87% dos^casos1,2,3. Atualmente, existem duas modalidades de tratamento para pacientes com AVC isquêmico: terapia farmacológica com ativador de plasminogênio tecidual recombinante (rtPA) e trombectomia mecânica. No entanto, a estreita janela terapêutica e os extensos critérios de exclusão limitam a aplicação desses tratamentos, beneficiando apenas uma minoria dos pacientes. Isso ressalta a necessidade de esforços contínuos para melhorar as terapias de AVC isquêmico ^4,5. Os modelos in vitro são inadequados para replicar as respostas fisiopatológicas complexas após um AVC, tornando os modelos animais um componente indispensável da pesquisa pré-clínica de AVC. A isquemia cerebral focal humana é mais freqüentemente causada por oclusão trombótica ou embólica da artéria cerebral média (ACM), o que torna os modelos de roedores projetados para simular a oclusão da ACM (MCAO) altamente relevantes⁶.

O modelo MCAO induzido por filamento, o mais amplamente adotado na pesquisa de AVC, facilita a oclusão no início da artéria cerebral média (MCA) e a subsequente reperfusão, levando a infartos extensos nas áreas subcorticais e corticais do cérebro. A vantagem desse modelo reside em sua capacidade de restaurar o fluxo sanguíneo após a indução de isquemia focal, paralelamente aos processos fisiopatológicos observados no AVC humano⁷. Além disso, o modelo simula lesão de reperfusão, fator crítico na extensão do dano⁸. No entanto, o modelo MCAO apresenta limitações, incluindo variabilidade no volume do infarto, com o desvio padrão podendo atingir até 64% do valor médio em alguns estudos⁹. Apesar de mais de três décadas de uso, esforços para aumentar a confiabilidade do modelo estão em andamento, mas variações significativas no volume da lesão isquêmica persistem em estudos e laboratórios 10,11,12.

Este artigo apresenta um filamento de fabricação própria para induzir modelos que avaliam escores de déficit neurológico e áreas de infarto cerebral. Ele examina a correlação entre os comprimentos dos filamentos revestidos com silicone e o sucesso e a estabilidade do modelo MCAO. Esta técnica de produção produz filamentos com consistência louvável, contribuindo para o desenvolvimento de um modelo MCAO relativamente estável.

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Protocolo

Todos os procedimentos em animais aderiram aos procedimentos e padrões experimentais aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Hospital Popular da Província de Shanxi (número de aprovação: Comitê de Ética Médica Provincial nº 64 de 2024). Os camundongos utilizados neste experimento foram camundongos C57BL/6 machos, de 8 a 10 semanas de idade, pesando 24 a 26 g. Os detalhes dos reagentes e equipamentos usados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação do filamento

1. Marcando o filamento original: Enrole a sutura de náilon 6-0 uniformemente em torno de uma placa de régua de plástico. Fazer marcas a 5 mm e 10 mm da cabeça do filamento (incluindo o ponto de marca de revestimento e o ponto de marcação da profundidade de inserção).
2. Corte verticalmente para baixo com uma lâmina para garantir que ambas as extremidades estejam perfeitamente circulares, resultando em um filamento inicial de 2 cm de comprimento (Figura 1).
3. Fabricação do dispositivo de revestimento: Use uma pinça hemostática para retirar a cabeça da agulha de uma seringa de 26 G e, em seguida, polir o orifício da agulha em um círculo perfeito com uma lixa. Retire 2 mL de selante de silicone K-704 com uma seringa de 10 mK e, finalmente, prenda a cabeça da agulha à seringa.
4. Revestindo o filamento: Insira o filamento inicial no orifício da agulha preparado até a posição marcada de 5 mm ou 10 mm. Empurre lenta e firmemente a seringa até que o filamento esteja totalmente revestido sob um estereomicroscópio (Figura 2).
5. Ajuste do filamento revestido: Fixe o filamento revestido na vertical com fita adesiva e aguarde cerca de 20 minutos para que o silicone endureça totalmente.
6. Esterilização e embalagem: Mergulhe os filamentos preparados em álcool 75%, seque-os com um cotonete e embale-os em tubos de centrífuga de 5 mL.

2. Modelo MCAO

NOTA: As ferramentas cirúrgicas foram esterilizadas em autoclavagem (121 °C a 15 psi por 60 min). A mesa cirúrgica e os demais equipamentos foram higienizados com etanol a 75%. Os camundongos foram mantidos em jejum por 8 h no pré-operatório, mas tiveram livre acesso à água.

1. Administre 5 mg/kg de meloxicam por via subcutânea para analgesia 60 minutos antes da cirurgia. Conecte um cobertor térmico para manter a temperatura corporal do camundongo em 37 °C durante a anestesia.
2. Induza a anestesia com isoflurano a 4% até que os movimentos espontâneos e os espasmos dos bigode cessem e, em seguida, mantenha a anestesia a 1.5% (seguindo os protocolos aprovados institucionalmente). Aplique pomada para os olhos em ambos os olhos.
3. Coloque o rato em decúbito dorsal, prenda a cabeça e os membros, raspe os pelos do pescoço e da parte superior do tórax e desinfete a pele com etanol 75% de dentro para fora.
4. Faça uma incisão na pele de 2,5 cm de comprimento ao longo da linha média do pescoço, da mandíbula inferior ao esterno.
5. Disseque sem rodeios os músculos direitos do pescoço para expor a bainha carotídea. Use uma pinça oftálmica para abrir a bainha e separar a artéria carótida comum (ACC), a artéria carótida externa (ACE) e a artéria carótida interna (ACI), tomando cuidado para não perturbar o nervo vago.
6. Ligue temporariamente o CCA com um nó corrediço antes da bifurcação e clampeie o ICA com uma pinça microcirúrgica da artéria.
7. Cauterize a artéria tireoidiana superior da ECA usando uma caneta de coagulação bipolar.
8. Deixe dois fios na ECA para ligadura: um na extremidade distal para ligadura permanente e outro na extremidade proximal com um nó frouxo para uso futuro. Faça uma incisão de aproximadamente 0,5 mm entre as duas ligaduras no ECA usando uma tesoura oftálmica para inserir o filamento.
9. Insira o filamento revestido de silicone de 5 mm ou 10 mm no CCA através da incisão e, em seguida, prenda-o apertando o nó solto.
10. Depois de cortar a extremidade distal do ECA e remover o grampo do ICA, retraia o filamento para a bifurcação do CCA. Em seguida, vire e avance o filamento para o ICA profundo até sentir resistência. Retire ligeiramente o filamento e prenda-o apertando o nó.
11. Suturar a pele do animal com sutura 3-0 e desinfetar a ferida com iodo. Coloque o mouse em uma câmara de recuperação por 1 h.
12. Anestesie o mouse novamente, remova suavemente o filamento, amarre o fio de ligadura ECA que prende o filamento e solte o nó corrediço CCA para restaurar o fluxo sanguíneo e reperfundir a artéria cerebral média.
13. Apare o excesso de fios, suture a pele do pescoço e desinfete a área mais uma vez.

3. Operação simulada

1. Para operações simuladas, insira um filamento revestido de silicone de 7 mm para ocluir a artéria cerebral média direita e, em seguida, retire-o imediatamente para permitir a reperfusão instantânea.
   NOTA: O procedimento subsequente é idêntico ao realizado em animais submetidos a isquemia cerebral.

4. Neuroscore

1. Colocar os animais experimentais de cada grupo em campo aberto e realizar escore comportamental pós-operatório 4 h após a reperfusão da isquemia cerebral.
2. Para uma modelagem bem-sucedida, considere pontuações entre 1 e 3. Os critérios de avaliação são baseados no método de pontuação de Longa¹⁰, conforme detalhado na Tabela 1.
3. Avalie os déficits neurológicos de acordo com os Escores de Gravidade Neurológica Modificados (mNSS)¹³, com avaliações realizadas em 24 h e 72 h pós-reperfusão (ver Tabela 2).

5. Perfusão transcardíaca

1. Anestesiar o camundongo com 1,5% de pentobarbital sódico (seguindo protocolos aprovados institucionalmente). Coloque o mouse de volta em sua gaiola e aguarde 10 min. Em seguida, aperte os dedos dos pés do mouse para testar a ausência de reflexos e garantir uma anestesia profunda.
2. Posicione o mouse em decúbito dorsal em um suporte de espuma e prenda seus membros.
3. Corte a ponta de uma agulha de 25 G para embotá-la, evitando a perfuração da parede aórtica. Conecte a agulha a uma seringa cheia de 20 mL de solução salina.
4. Levante o pelo do tórax e use uma tesoura para cortar a pele para expor o processo xifóide. Segure o processo xifóide e corte horizontalmente abaixo dele para expor o diafragma abrindo a camada muscular. Corte cuidadosamente o diafragma com uma tesoura, evitando danos ao coração.
5. Corte ao longo do lado externo do esterno para abrir a caixa torácica em ambos os lados, vire a parede anterior do tórax e prenda-a com hemostáticos.
6. Use um cotonete para remover a gordura na base do coração, expondo a raiz da aorta.
7. Prenda o coração com uma pinça, insira a agulha no ápice do coração e avance obliquamente para cima até que a agulha fique visível através da parede aórtica. Prenda a agulha no lugar.
8. Faça um pequeno corte no átrio direito para observar o fluxo sanguíneo. Perfunda constantemente a solução salina com a seringa, observando o sangue sair do átrio direito. Uma vez que o efluente esteja limpo, interrompa a perfusão¹⁴.
9. Após a perfusão, decapitar o ratinho para colher o cérebro¹⁵ e colocá-lo num congelador a -20 °C para posterior processamento.

6. Avaliação do volume de infarto por coloração TTC

1. Congele rapidamente os tecidos cerebrais obtidos num congelador a -20 °C durante 20 min, depois coloque-os num molde pré-arrefecido e corte-os em fatias de 1 mm de espessura.
2. Mergulhe as seções cerebrais obtidas em solução de TTC a 2% e incube a 37 ° C por 20 min.
3. Mergulhe as fatias de cérebro em paraformaldeído a 4% durante a noite e tire fotos no dia seguinte.
4. Meça a área infartada de cada fatia e a área total do cérebro usando o ImageJ. Calcule a razão do volume do infarto usando a fórmula: % do volume do infarto = (Soma das áreas infartadas / Soma das áreas totais do cérebro) × 100%.

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Resultados

Na criação do modelo MCAO, as principais ferramentas usadas para fabricar os filamentos e os filamentos acabados são mostradas na Figura 3. Após a produção do filamento, o modelo MCAO é estabelecido inserindo o filamento através da artéria carótida externa, com a duração da operação registrada. A modelagem bem-sucedida é definida por uma pontuação de Longa de 1-3 4 h após a retirada do filamento. O peso corporal é monitorado diariamente ap...

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Discussão

Este estudo demonstra um método simples e econômico para a fabricação de filamentos, confirmando sua viabilidade na criação de um modelo MCAO. O comprimento do revestimento de silicone do filamento pode ser ajustado de acordo com as necessidades experimentais, oferecendo flexibilidade adicional. A preparação de um êmbolo filamentar de 5 mm alcançou uma taxa de sucesso de 100% sem qualquer ocorrência de hemorragia subaracnóidea (HSA) em camundongos. No grupo que usou êmbolos ...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL Syringe	Haidike Medical Products Co., Ltd.		Instrument for making filaments
2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride (TTC)	Sigma-Aldrich	G3005	Dye for TTC staining
24-well culture plate	Corning	CLS3527	Vessel for TTC staining
26 G syringe needle	Haidike Medical Products Co., Ltd.		Instrument for making filaments
4% paraformaldehyde	Servicebio	G1101	Tissue fixation
6-0 nylon suture	Haidike Medical Products Co., Ltd.		Materials for making filaments
Anesthesia system for isoflurane	Rwd Life Science Co., Ltd.	R610	Anesthetized animal
Bipolar electrocoagulation generator	Yirun Medical Instrument Co., Ltd.	ZG300	Equipment for surgery
Constant temperature water bath	Spring  Instrument Co., Ltd.	HH-M6	TTC staining
Eye ointment	Guangzhou Pharmaceutical	H44023098	Material for surgery
Heat blanket	ZH Biomedical Instrument Co., Ltd.		Maintain body temperatur
Isoflurane	Rwd Life Science Co., Ltd.	R510-22-10	Anesthetized animal
Meloxicam	Boehringer-Ingelheim	J20160020	Analgesia for animal
Microsurgical artery clamp	Shanghai Jinzhong Surgical Instruments Co., Ltd.	W40130	Instrument for surgery
Microsurgical hemostatic clamp forceps	Shanghai Jinzhong Surgical Instruments Co., Ltd.	M-W-0022	Instrument for surgery
Microsurgical instruments set	Rwd Life Science Co., Ltd.	SP0009-R	Equipment for surgery
Mouse thermometer	Hubei Dasjiaer Biotechnology	FT3400	Intraoperative temperature monitoring
Pentobarbital sodium	Sigma-Aldrich	P3761	Euthanized animal
Shaver	Joyu Electrical Appliances	PHC-920	Equipment for surgery
Silicone Sealant	Kafuter	K-704	Materials for making filaments
Stereomicroscope	Rwd Life Science Co., Ltd.	77001S	Equipment for surgery
Suture thread with needle (3-0)	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd.	F404SUS302	Equipment for surgery