Филамент ручной работы с силиконовым покрытием для мышей модели окклюзии средней мозговой артерии

Резюме

Этот протокол описывает простой метод создания покрытых нитей для модели окклюзии средней мозговой артерии (MCAO) у мышей с использованием силикона, нейлоновых швов и игл шприца. Этот метод позволяет производить филаменты с постоянным диаметром и различной длиной силиконовой оболочки в соответствии с экспериментальными потребностями.

Аннотация

По мере старения населения планеты ишемический инсульт становится второй по значимости причиной инвалидности и смертности во всем мире, ложась огромным бременем как на общество, так и на семьи. Несмотря на то, что такие методы лечения, как внутривенный тромболизис и эндоваскулярные вмешательства, могут значительно улучшить исходы лечения пациентов с острым ишемическим инсультом, только небольшой процент людей получает пользу от этих методов лечения. Чтобы улучшить наше понимание болезни и найти более эффективные методы лечения, исследователи постоянно разрабатывают и совершенствуют животные модели. Среди них модель окклюзии средней мозговой артерии (MCAO) выделяется как наиболее часто используемая модель в исследованиях цереброваскулярных заболеваний. Нить, используемая в этой модели, имеет решающее значение для ее разработки. В этом протоколе описывается метод создания нитей с постоянным диаметром и различной длиной силиконового покрытия. Модель MCAO, полученная с использованием этого метода на мышах C57, продемонстрировала высокий успех и согласованность, предлагая ценный инструмент для специализированных исследований ишемических цереброваскулярных заболеваний.

Введение

Инсульт является одной из наиболее распространенных причин смертности и инвалидности во всем мире. Ишемический и геморрагический инсульты являются основными типами цереброваскулярных событий, при этом ишемические инсульты составляют примерно 87% случаев ^1,2,3. В настоящее время существует два метода лечения пациентов с ишемическим инсультом: фармакологическая терапия рекомбинантным тканевым активатором плазминогена (РТПА) и механическая тромбэктомия. Тем не менее, узкое терапевтическое окно и обширные критерии исключения ограничивают применение этих методов лечения, принося пользу лишь меньшинству пациентов. Это подчеркивает необходимость продолжения усилий по совершенствованию методов лечения ишемического инсульта ^4,5. Модели in vitro неадекватны для воспроизведения сложных патофизиологических реакций после инсульта, что делает животные модели незаменимым компонентом доклинических исследований инсульта. Фокальная ишемия головного мозга человека чаще всего вызвана тромботической или эмболической окклюзией средней мозговой артерии (МКА), что делает модели грызунов, предназначенные для имитации окклюзии МКА (МКАО), весьма актуальными⁶.

Нитевидная модель MCAO, наиболее широко используемая в исследованиях инсульта, способствует окклюзии в начале средней мозговой артерии (MCA) и последующей реперфузии, что приводит к обширным инфарктам в подкорковых и корковых областях мозга. Преимущество данной модели заключается в ее способности восстанавливать кровоток после индукции очаговой ишемии, тем самым параллельно патофизиологическим процессам, наблюдаемым при инсульте^{человека7.} Кроме того, модель моделирует реперфузионное повреждение, которое является критическим фактором в степени повреждения⁸. Тем не менее, модель MCAO имеет ограничения, в том числе вариабельность объема инфаркта, при этом стандартное отклонение потенциально достигает до 64% от среднего значения в некоторых исследованиях⁹. Несмотря на более чем три десятилетия использования, усилия по повышению надежности модели продолжаются, но значительные вариации объема ишемического поражения сохраняются в исследованиях и лабораториях 10,11,12.

В этой статье представлен филамент собственного производства для индуцирования моделей, оценивающих показатели неврологического дефицита и области инфаркта головного мозга. В нем исследуется корреляция между длиной нити, покрытой силиконом, и успехом и стабильностью модели MCAO. Такая технология производства позволяет получать филаменты с похвальной стабильностью, что способствует разработке относительно стабильной модели MCAO.

протокол

Все процедуры на животных соответствовали экспериментальным процедурам и стандартам, утвержденным Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию Народной больницы провинции Шаньси (номер утверждения: 2024 Провинциальный комитет по медицинской этике No 64). В этом эксперименте использовались мыши-самцы C57BL/6 в возрасте 8-10 недель, весом 24-26 г. Подробная информация об используемых реагентах и оборудовании приведена в Таблице материалов.

1. Подготовка филамента

1. Маркировка оригинальной нити: равномерно намотайте нейлоновый шов 6-0 на пластиковую пластину линейки. Сделайте отметки на расстоянии 5 мм и 10 мм от головки филамента (включая точку отметки покрытия и точку отметки глубины вставки).
2. Отрежьте вертикально вниз лезвием, чтобы оба конца были идеально круглыми, в результате чего получится начальная нить длиной 2 см (Рисунок 1).
3. Изготовление устройства для нанесения покрытия: С помощью гемостатических щипцов отломите головку иглы шприца 26 G, затем отполируйте отверстие иглы в идеальный круг с помощью наждачной бумаги. Наберите 2 мл силиконового герметика K-704 с помощью шприца 10 мК и, наконец, прикрепите головку иглы к шприцу.
4. Нанесение покрытия на нить: Вставьте исходную нить в подготовленное отверстие для иглы с точностью до отмеченного положения 5 мм или 10 мм. Медленно и неуклонно нажимайте на шприц до полного покрытия нити под стереомикроскопом (Рисунок 2).
5. Установка нити с покрытием: Зафиксируйте нить с покрытием вертикально с помощью клейкой ленты и подождите около 20 минут, пока силикон полностью схватится.
6. Стерилизация и упаковка: Подготовленные нити замочите в 75% спирте, вытрите насухо ватным тампоном, а затем расфасовайте в центрифужные пробирки объемом 5 мл.

2. Модель MCAO

ПРИМЕЧАНИЕ: Хирургические инструменты стерилизовали автоклавированием (121 °C при 15 фунтах на квадратный дюйм в течение 60 минут). Операционный стол и другое оборудование были продезинфицированы с использованием этанола на 75%. Мышей голодали в течение 8 ч перед операцией, но им разрешали свободный доступ к воде.

1. Введите 5 мг/кг мелоксикама подкожно для обезболивания за 60 минут до операции. Подключите тепловое одеяло, чтобы поддерживать температуру тела мыши на уровне 37 °C во время анестезии.
2. Вводите анестезию 4% изофлураном до тех пор, пока не прекратятся спонтанные движения и подергивания усов, затем поддерживайте анестезию на уровне 1,5% (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами). Нанесите глазную мазь на оба глаза.
3. Поместите мышь в лежачее положение, закрепите ее голову и конечности, сбрейте волосы на шее и верхней части груди и продезинфицируйте кожу 75% этанолом изнутри.
4. Сделайте разрез кожи длиной 2,5 см по средней линии шеи, от нижней челюсти до грудины.
5. Тупо рассеките правые мышцы шеи, чтобы обнажить влагалище сонной артерии. С помощью офтальмологических щипцов откройте влагалище и отделите общую сонную артерию (CCA), наружную сонную артерию (ECA) и внутреннюю сонную артерию (ICA), стараясь не повредить блуждающий нерв.
6. Перед бифуркацией временно перевязать ОСА скользящим узлом и пережать ВСА микрохирургическим зажимом для артерии.
7. Прижгите верхнюю щитовидную артерию от ЭКА с помощью биполярного коагуляционного шприц-ручки.
8. Оставьте две нити на ECA для лигирования: одну на дистальном конце для постоянной лигирования, а другую на проксимальном конце со слабым узлом для дальнейшего использования. Сделайте разрез примерно 0,5 мм между двумя лигатурами на ECA с помощью офтальмологических ножниц, чтобы ввести нить.
9. Вставьте нить с силиконовым покрытием толщиной 5 мм или 10 мм в CCA через разрез, а затем закрепите ее, затянув ослабленный узел.
10. Отрезав дистальный конец ЭХА и сняв зажим с ВСА, втяните филамент в зону бифуркации ОСА. Затем переверните и продвигайте нить в глубокий ВСА, пока не почувствуете сопротивление. Слегка оттяните нить и закрепите ее, затянув узел.
11. Зашить кожу животного швом 3-0 и продезинфицировать рану йодом. Поместите мышь в камеру восстановления на 1 час.
12. Снова обезболите мышь, аккуратно удалите нить, перевяжите нить для лигирования ECA, фиксирующую нить, и отпустите узел CCA для восстановления кровотока и реперфузии средней мозговой артерии.
13. Обрежьте лишние нити, зашите кожу шеи и еще раз продезинфицируйте область.

3. Фиктивная операция

1. При фиктивных операциях введите филамент с силиконовым покрытием толщиной 7 мм, чтобы окклюзировать правую среднюю мозговую артерию, а затем немедленно удалите ее, чтобы обеспечить мгновенную реперфузию.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Последующая процедура идентична той, которая проводится на животных с ишемией головного мозга.

4. Нейрооценка

1. Экспериментальных животных из каждой группы поместить в открытый грунт и провести поведенческую послеоперационную оценку через 4 ч после реперфузии ишемии головного мозга.
2. Для успешного моделирования учитывайте баллы от 1 до 3. Критерии оценки основаны на скоринговом методе^{Лонга 10}, как подробно описано в таблице 1.
3. Оценивайте неврологические дефициты в соответствии с модифицированной шкалой тяжести неврологического расстройства (mNSS)¹³, проводя оценку через 24 ч и 72 ч после реперфузии (см. Таблицу 2).

5. Транскардиальная перфузия

1. Обезболите мышь 1,5% пентобарбиталом натрия (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами). Поместите мышь обратно в клетку и подождите 10 минут. Затем ущипните пальцы ног мыши, чтобы проверить отсутствие рефлексов и обеспечить глубокую анестезию.
2. Расположите мышь в лежачем положении на подставке из пенопласта и закрепите ее конечности.
3. Отрежьте кончик иглы 25 G, чтобы затупить его, не допуская прокола стенки аорты. Подсоедините иглу к шприцу, наполненному 20 мл физраствора.
4. Поднимите шерсть грудной клетки и с помощью ножниц срежьте кожу, чтобы обнажить мечевидный отросток. Возьмитесь за мечевидный отросток и разрежьте горизонтально под ним, чтобы обнажить диафрагму, открыв мышечный слой. Аккуратно разрежьте диафрагму ножницами, не допуская повреждения сердца.
5. Разрежьте вдоль внешней стороны грудины, чтобы открыть грудную клетку с обеих сторон, переверните переднюю стенку грудной клетки и закрепите ее гемостатитом.
6. С помощью ватного тампона удалите жир у основания сердца, обнажив корень аорты.
7. Закрепите сердце щипцами, введите иглу в верхушку сердца и продвигайтесь наискось вверх, пока игла не станет видна через стенку аорты. Зажмите иглу на месте.
8. Сделайте небольшой надрез в правом предсердии, чтобы наблюдать за кровотоком. Неуклонно прокалывайте физиологический раствор с помощью шприца, следя за тем, чтобы кровь выходила из правого предсердия. Как только сточные воды станут прозрачными, прекратите перфузию¹⁴.
9. После перфузии обезглавьте мышь, чтобы собрать мозг¹⁵ и поместите его в морозильную камеру при температуре -20 °C для дальнейшей обработки.

6. Оценка объема инфаркта с помощью окрашивания ТТС

1. Быстро заморозьте полученные ткани мозга в морозильной камере при температуре -20 °C на 20 минут, затем поместите их на предварительно охлажденную форму для нарезки мозга и нарежьте на ломтики толщиной 1 мм.
2. Полученные участки мозга погрузить в 2% раствор ТТС и инкубировать при 37 °С в течение 20 мин.
3. Погрузите срезы мозга в 4% параформальдегид на ночь и сделайте фотографии на следующий день.
4. Измерьте площадь инфаркта для каждого среза и общую площадь мозга с помощью ImageJ. Рассчитайте коэффициент объема инфаркта по формуле: Объем инфаркта % = (Сумма инфарктных площадей / Сумма общих площадей мозга) × 100%.

Результаты

При создании модели MCAO основные инструменты, используемые для изготовления нитей и готовых нитей, показаны на рисунке 3. После производства филамента модель MCAO устанавливается путем введения филамента через наружную сонную артерию, при этом продолжи?...

Обсуждение

Данное исследование демонстрирует простой и экономически эффективный метод изготовления нити, подтверждая его целесообразность при создании модели MCAO. Длина силиконового покрытия нити может быть отрегулирована в соответствии с экспериментальными потребностями, ч...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL Syringe	Haidike Medical Products Co., Ltd.		Instrument for making filaments
2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride (TTC)	Sigma-Aldrich	G3005	Dye for TTC staining
24-well culture plate	Corning	CLS3527	Vessel for TTC staining
26 G syringe needle	Haidike Medical Products Co., Ltd.		Instrument for making filaments
4% paraformaldehyde	Servicebio	G1101	Tissue fixation
6-0 nylon suture	Haidike Medical Products Co., Ltd.		Materials for making filaments
Anesthesia system for isoflurane	Rwd Life Science Co., Ltd.	R610	Anesthetized animal
Bipolar electrocoagulation generator	Yirun Medical Instrument Co., Ltd.	ZG300	Equipment for surgery
Constant temperature water bath	Spring  Instrument Co., Ltd.	HH-M6	TTC staining
Eye ointment	Guangzhou Pharmaceutical	H44023098	Material for surgery
Heat blanket	ZH Biomedical Instrument Co., Ltd.		Maintain body temperatur
Isoflurane	Rwd Life Science Co., Ltd.	R510-22-10	Anesthetized animal
Meloxicam	Boehringer-Ingelheim	J20160020	Analgesia for animal
Microsurgical artery clamp	Shanghai Jinzhong Surgical Instruments Co., Ltd.	W40130	Instrument for surgery
Microsurgical hemostatic clamp forceps	Shanghai Jinzhong Surgical Instruments Co., Ltd.	M-W-0022	Instrument for surgery
Microsurgical instruments set	Rwd Life Science Co., Ltd.	SP0009-R	Equipment for surgery
Mouse thermometer	Hubei Dasjiaer Biotechnology	FT3400	Intraoperative temperature monitoring
Pentobarbital sodium	Sigma-Aldrich	P3761	Euthanized animal
Shaver	Joyu Electrical Appliances	PHC-920	Equipment for surgery
Silicone Sealant	Kafuter	K-704	Materials for making filaments
Stereomicroscope	Rwd Life Science Co., Ltd.	77001S	Equipment for surgery
Suture thread with needle (3-0)	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd.	F404SUS302	Equipment for surgery