Filamento recubierto de silicona hecho a mano para modelos de oclusión de la arteria cerebral media de ratones

Resumen

Este protocolo describe un método sencillo para crear filamentos recubiertos para el modelo de oclusión de la arteria cerebral media (MCAO) en ratones utilizando silicona, suturas de nailon y agujas de jeringa. Este método permite la producción de filamentos con un diámetro constante y varias longitudes de envoltura de silicona adaptadas a las necesidades experimentales.

Resumen

A medida que la población mundial envejece, el accidente cerebrovascular isquémico se ha convertido en la segunda causa principal de discapacidad y mortalidad en todo el mundo, lo que supone una inmensa carga tanto para la sociedad como para las familias. Aunque los tratamientos como la trombólisis intravenosa y las intervenciones endovasculares pueden mejorar sustancialmente los resultados de los pacientes con accidente cerebrovascular isquémico agudo, solo un pequeño porcentaje de personas se benefician de estas terapias. Para avanzar en nuestra comprensión de la enfermedad y descubrir tratamientos más efectivos, los investigadores están continuamente desarrollando y refinando modelos animales. Entre estos, destaca el modelo de oclusión de la arteria cerebral media (MCAO, por sus siglas en inglés) como el modelo más utilizado en la investigación de las enfermedades cerebrovasculares. El filamento utilizado en este modelo es crucial para su desarrollo. Este protocolo describe un método para crear filamentos con diámetros consistentes y longitudes variables de recubrimiento de silicona. El modelo MCAO producido con este método en ratones C57 ha demostrado un alto éxito y consistencia, ofreciendo una valiosa herramienta para investigaciones personalizadas sobre enfermedades cerebrovasculares isquémicas.

Introducción

El accidente cerebrovascular es una de las causas más prevalentes de mortalidad y discapacidad en todo el mundo. Los accidentes cerebrovasculares isquémicos y hemorrágicos son los principales tipos de eventos cerebrovasculares, y los accidentes cerebrovasculares isquémicos representan aproximadamente el 87% de los casos ^1,2,3. En la actualidad, existen dos modalidades de tratamiento para los pacientes con accidente cerebrovascular isquémico: la terapia farmacológica con activador tisular recombinante del plasminógeno (rtPA) y la trombectomía mecánica. Sin embargo, la estrecha ventana terapéutica y los extensos criterios de exclusión limitan la aplicación de estos tratamientos, beneficiando solo a una minoría de pacientes. Esto subraya la necesidad de esfuerzos continuos para mejorar las terapias del ictus isquémico ^4,5. Los modelos in vitro son inadecuados para replicar las complejas respuestas fisiopatológicas después de un accidente cerebrovascular, lo que hace que los modelos animales sean un componente indispensable de la investigación preclínica del accidente cerebrovascular. La isquemia cerebral focal humana es causada con mayor frecuencia por la oclusión trombótica o embólica de la arteria cerebral media (ACM), lo que hace que los modelos de roedores diseñados para simular la oclusión de la ACM (ACM) sean altamente relevantes⁶.

El modelo MCAO inducido por filamentos, el más ampliamente adoptado en la investigación del accidente cerebrovascular, facilita la oclusión al inicio de la arteria cerebral media (ACM) y la posterior reperfusión, lo que conduce a infartos extensos en áreas subcorticales y corticales del cerebro. La ventaja de este modelo radica en su capacidad para restaurar el flujo sanguíneo después de inducir isquemia focal, lo que es paralelo a los procesos fisiopatológicos observados en el accidente cerebrovascular humano⁷. Además, el modelo simula la lesión por reperfusión, un factor crítico en la extensión del daño⁸. Sin embargo, el modelo MCAO tiene limitaciones, incluyendo la variabilidad en el volumen del infarto, con una desviación estándar que puede alcanzar hasta el 64% del valor medio en algunos estudios⁹. A pesar de más de tres décadas de uso, los esfuerzos para mejorar la confiabilidad del modelo son continuos, sin embargo, persisten variaciones significativas en el volumen de la lesión isquémica entre estudios y laboratorios 10,11,12.

En este artículo se presenta un filamento de fabricación propia para inducir modelos que evalúan las puntuaciones de déficit neurológico y las áreas de infarto cerebral. Examina la correlación entre las longitudes de los filamentos recubiertos con silicona y el éxito y la estabilidad del modelo MCAO. Esta técnica de producción produce filamentos con una consistencia encomiable, lo que contribuye al desarrollo de un modelo MCAO relativamente estable.

Protocolo

Todos los procedimientos con animales se adhirieron a los procedimientos y estándares experimentales aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Hospital Popular Provincial de Shanxi (número de aprobación: Comité Provincial de Ética Médica No. 64 de 2024). Los ratones utilizados en este experimento fueron ratones machos C57BL/6, de 8-10 semanas de edad, con un peso de 24-26 g. Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación del filamento

1. Marcar el filamento original: Enrolle la sutura de nailon 6-0 de manera uniforme alrededor de una placa de regla de plástico. Haga marcas a 5 mm y 10 mm de la cabeza del filamento (incluyendo el punto de marca del recubrimiento y el punto de marca de la profundidad de inserción).
2. Cortar verticalmente hacia abajo con una cuchilla para asegurarse de que ambos extremos sean perfectamente circulares, dando como resultado un filamento inicial de 2 cm de largo (Figura 1).
3. Fabricación del dispositivo de recubrimiento: Utilice pinzas hemostáticas para romper la cabeza de la aguja de una jeringa de 26 G, luego pula el orificio de la aguja en un círculo perfecto con papel de lija. Extraiga 2 ml de sellador de silicona K-704 con una jeringa de 10 mK y, por último, fije la cabeza de la aguja a la jeringa.
4. Recubrimiento del filamento: Inserte el filamento inicial en el orificio de la aguja preparado hasta la posición marcada de 5 mm o 10 mm. Empuje lenta y constantemente la jeringa hasta que el filamento esté completamente cubierto bajo un microscopio estereoscópico (Figura 2).
5. Ajuste del filamento recubierto: Fije el filamento recubierto en posición vertical con cinta adhesiva y espere unos 20 minutos para que la silicona se asiente por completo.
6. Esterilización y embalaje: Remoje los filamentos preparados en alcohol al 75%, séquelos con un hisopo de algodón y luego empaquételos en tubos de centrífuga de 5 ml.

2. Modelo MCAO

NOTA: Los instrumentos quirúrgicos se esterilizaron en autoclave (121 °C a 15 psi durante 60 min). La mesa de cirugía y otros equipos se desinfectaron con etanol al 75%. Los ratones fueron ayunados durante 8 h antes de la operación, pero se les permitió el libre acceso al agua.

1. Administrar 5 mg/kg de meloxicam por vía subcutánea para la analgesia 60 min antes de la cirugía. Conecte una manta térmica para mantener la temperatura corporal del ratón a 37 °C durante la anestesia.
2. Inducir la anestesia con isoflurano al 4% hasta que cesen los movimientos espontáneos y los espasmos de los bigotes, luego mantener la anestesia al 1,5% (siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente). Aplique ungüento para los ojos en ambos ojos.
3. Coloque al ratón en posición supina, asegure su cabeza y extremidades, afeite el vello del cuello y la parte superior del pecho, y desinfecte la piel con etanol al 75% de adentro hacia afuera.
4. Realice una incisión cutánea de 2,5 cm de largo a lo largo de la línea media del cuello, desde la mandíbula inferior hasta el esternón.
5. Diseccione sin rodeos los músculos del cuello derecho para exponer la vaina carotídea. Use pinzas oftálmicas para abrir la vaina y separar la arteria carótida común (CCA), la arteria carótida externa (ECA) y la arteria carótida interna (ACI), teniendo cuidado de evitar alterar el nervio vago.
6. Ligar temporalmente el CCA con un nudo corredizo antes de la bifurcación y pinzar el ACI con una pinza arteria microquirúrgica.
7. Cauterizar la arteria tiroidea superior a partir de la ECA utilizando una pluma de coagulación bipolar.
8. Deje dos hilos en el ECA para la ligadura: uno en el extremo distal para la ligadura permanente y otro en el extremo proximal con un nudo suelto para uso futuro. Realice una incisión de aproximadamente 0,5 mm entre las dos ligaduras en el ECA utilizando unas tijeras oftálmicas para insertar el filamento.
9. Inserte el filamento recubierto de silicona de 5 mm o 10 mm en el CCA a través de la incisión y luego asegúrelo apretando el nudo suelto.
10. Después de cortar el extremo distal del ECA y quitar la abrazadera del ICA, retraiga el filamento a la bifurcación del CCA. A continuación, voltea y avanza el filamento hacia el ICA profundo hasta que sientas resistencia. Retira ligeramente el filamento y asegúralo apretando el nudo.
11. Suturar la piel del animal con sutura 3-0 y desinfectar la herida con yodo. Coloque el mouse en una cámara de recuperación durante 1 h.
12. Anestesiar al ratón de nuevo, retirar suavemente el filamento, atar el hilo de ligadura de ECA que sujeta el filamento y soltar el nudo corredizo CCA para restaurar el flujo sanguíneo y reperfundir la arteria cerebral media.
13. Recorta el exceso de hilos, sutura la piel del cuello y desinfecta la zona una vez más.

3. Operación simulada

1. Para operaciones simuladas, inserte un filamento recubierto de silicona de 7 mm para ocluir la arteria cerebral media derecha y luego retírelo inmediatamente para permitir una reperfusión instantánea.
   NOTA: El procedimiento subsiguiente es idéntico al que se realiza en los animales sometidos a isquemia cerebral.

4. Puntuación neurológica

1. Colocar los animales de experimentación de cada grupo en un campo abierto y realizar una puntuación conductual postoperatoria 4 h después de la reperfusión por isquemia cerebral.
2. Para un modelado exitoso, considere puntuaciones entre 1 y 3. Los criterios de evaluación se basan en el método de puntuación Longa¹⁰, como se detalla en la Tabla 1.
3. Evaluar los déficits neurológicos según las Escalas de Severidad Neurológica Modificada (mNSS)¹³, realizando evaluaciones a las 24 h y 72 h post-reperfusión (ver Tabla 2).

5. Perfusión transcardíaca

1. Anestesiar al ratón con pentobarbital sódico al 1,5% (siguiendo protocolos aprobados institucionalmente). Vuelva a colocar al ratón en su jaula y espere 10 minutos. Luego, pellizque los dedos de los pies del ratón para probar la ausencia de reflejos y asegurar una anestesia profunda.
2. Coloque el ratón en posición supina sobre un soporte de espuma y asegure sus extremidades.
3. Cortar la punta de una aguja de 25 g para desafilarla y evitar la punción de la pared aórtica. Conecte la aguja a una jeringa llena de 20 ml de solución salina.
4. Levante el pelaje del tórax y use unas tijeras para cortar la piel y exponer el proceso xifoides. Agarre la apófisis xifoides y corte horizontalmente por debajo de ella para exponer el diafragma abriendo la capa muscular. Corta cuidadosamente el diafragma con unas tijeras, evitando dañar el corazón.
5. Corta a lo largo del lado exterior del esternón para abrir la caja torácica en ambos lados, voltea la pared anterior del tórax y asegúrala con hemostáticos.
6. Use un hisopo de algodón para eliminar la grasa en la base del corazón, exponiendo la raíz de la aorta.
7. Asegure el corazón con fórceps, inserte la aguja en el ápice del corazón y avance oblicuamente hacia arriba hasta que la aguja sea visible a través de la pared aórtica. Sujete la aguja en su lugar.
8. Haz una pequeña incisión en la aurícula derecha para observar el flujo sanguíneo. Perfunda solución salina con la jeringa, vigilando que la sangre salga de la aurícula derecha. Una vez que el efluente esté limpio, detenga la perfusión¹⁴.
9. Después de la perfusión, decapitar al ratón para extraer el cerebro¹⁵ y colocarlo en un congelador a -20 °C para su posterior procesamiento.

6. Evaluación del volumen del infarto mediante tinción TTC

1. Congele rápidamente los tejidos cerebrales obtenidos en un congelador a -20 °C durante 20 minutos, luego colóquelos en un molde para cortar cerebros previamente enfriado y córtelos en rodajas de 1 mm de grosor.
2. Sumerja las secciones de cerebro obtenidas en una solución de TTC al 2% e incube a 37 °C durante 20 min.
3. Sumerja las rodajas de cerebro en paraformaldehído al 4% durante la noche y tome fotografías al día siguiente.
4. Mida el área infartada de cada corte y el área total del cerebro con ImageJ. Calcule la relación de volumen de infarto usando la fórmula: % de volumen de infarto = (Suma de las áreas infartadas / Suma de las áreas cerebrales totales) × 100%.

Resultados

En la creación del modelo MCAO, las herramientas principales utilizadas para fabricar los filamentos y los filamentos terminados se muestran en la Figura 3. Después de la producción de filamento, el modelo MCAO se establece insertando el filamento a través de la arteria carótida externa, con la duración de la operación registrada. El modelado exitoso se define por una puntuación de Longa de 1-3 4 h después de la extracción del filamento. El peso co...

Discusión

Este estudio demuestra un método simple y rentable para fabricar filamento, lo que confirma su viabilidad en la creación de un modelo MCAO. La longitud de la capa de silicona del filamento se puede ajustar según las necesidades experimentales, lo que ofrece una flexibilidad adicional. La preparación de un émbolo de filamento de 5 mm logró una tasa de éxito del 100% sin que se produjera hemorragia subaracnoidea (HSA) en ratones. En el grupo que utilizó émbolos de filamento de 10 ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL Syringe	Haidike Medical Products Co., Ltd.		Instrument for making filaments
2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride (TTC)	Sigma-Aldrich	G3005	Dye for TTC staining
24-well culture plate	Corning	CLS3527	Vessel for TTC staining
26 G syringe needle	Haidike Medical Products Co., Ltd.		Instrument for making filaments
4% paraformaldehyde	Servicebio	G1101	Tissue fixation
6-0 nylon suture	Haidike Medical Products Co., Ltd.		Materials for making filaments
Anesthesia system for isoflurane	Rwd Life Science Co., Ltd.	R610	Anesthetized animal
Bipolar electrocoagulation generator	Yirun Medical Instrument Co., Ltd.	ZG300	Equipment for surgery
Constant temperature water bath	Spring  Instrument Co., Ltd.	HH-M6	TTC staining
Eye ointment	Guangzhou Pharmaceutical	H44023098	Material for surgery
Heat blanket	ZH Biomedical Instrument Co., Ltd.		Maintain body temperatur
Isoflurane	Rwd Life Science Co., Ltd.	R510-22-10	Anesthetized animal
Meloxicam	Boehringer-Ingelheim	J20160020	Analgesia for animal
Microsurgical artery clamp	Shanghai Jinzhong Surgical Instruments Co., Ltd.	W40130	Instrument for surgery
Microsurgical hemostatic clamp forceps	Shanghai Jinzhong Surgical Instruments Co., Ltd.	M-W-0022	Instrument for surgery
Microsurgical instruments set	Rwd Life Science Co., Ltd.	SP0009-R	Equipment for surgery
Mouse thermometer	Hubei Dasjiaer Biotechnology	FT3400	Intraoperative temperature monitoring
Pentobarbital sodium	Sigma-Aldrich	P3761	Euthanized animal
Shaver	Joyu Electrical Appliances	PHC-920	Equipment for surgery
Silicone Sealant	Kafuter	K-704	Materials for making filaments
Stereomicroscope	Rwd Life Science Co., Ltd.	77001S	Equipment for surgery
Suture thread with needle (3-0)	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd.	F404SUS302	Equipment for surgery