JoVE Logo

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, silikon, naylon sütürler ve şırınga iğneleri kullanılarak farelerde orta serebral arter tıkanıklığı (MCAO) modeli için kaplanmış filamentler oluşturmak için basit bir yöntemi açıklar. Bu yöntem, deneysel ihtiyaçlara göre uyarlanmış tutarlı bir çapa ve çeşitli silikon kaplama uzunluklarına sahip filamentlerin üretilmesine izin verir.

Özet

Küresel nüfus yaşlandıkça, iskemik inme dünya çapında sakatlık ve mortalitenin ikinci önde gelen nedeni haline geldi ve hem toplum hem de aileler üzerinde büyük bir yük oluşturdu. İntravenöz tromboliz ve endovasküler girişimler gibi tedaviler akut iskemik inmeli hastalar için sonuçları önemli ölçüde iyileştirebilse de, bireylerin sadece küçük bir yüzdesi bu tedavilerden fayda görmektedir. Hastalık hakkındaki anlayışımızı ilerletmek ve daha etkili tedaviler keşfetmek için araştırmacılar sürekli olarak hayvan modelleri geliştirmekte ve iyileştirmektedir. Bunlar arasında orta serebral arter tıkanıklığı (MCAO) modeli, serebrovasküler hastalık araştırmalarında en sık kullanılan model olarak öne çıkmaktadır. Bu modelde kullanılan filament, geliştirilmesi için çok önemlidir. Bu protokol, tutarlı çaplara ve değişen uzunluklarda silikon kaplamaya sahip filamentler oluşturmak için bir yöntemi ana hatlarıyla belirtir. C57 farelerinde bu yöntem kullanılarak üretilen MCAO modeli, iskemik serebrovasküler hastalıklara yönelik özel araştırmalar için değerli bir araç sunarak yüksek başarı ve tutarlılık göstermiştir.

Giriş

İnme, dünya çapında en yaygın mortalite ve sakatlık nedenlerinden biridir. İskemik ve hemorajik inmeler, serebrovasküler olayın birincil tipleridir ve iskemik inmeler vakaların yaklaşık% 87'sini oluşturur 1,2,3. Günümüzde iskemik inmeli hastalar için rekombinant doku plazminojen aktivatörü (rtPA) ile farmakolojik tedavi ve mekanik trombektomi olmak üzere iki tedavi yöntemi vardır. Bununla birlikte, dar terapötik pencere ve kapsamlı dışlama kriterleri, bu tedavilerin uygulanmasını sınırlamakta ve hastaların sadece küçük bir kısmına fayda sağlamaktadır. Bu, iskemik inme tedavilerini iyileştirmeye yönelik sürekli çabalara duyulan ihtiyacın altını çizmektedir 4,5. İn vitro modeller, inme sonrası karmaşık patofizyolojik yanıtları tekrarlamak için yetersizdir ve bu da hayvan modellerini klinik öncesi inme araştırmalarının vazgeçilmez bir bileşeni haline getirir. İnsan fokal serebral iskemisi en sık orta serebral arterin (MCA) trombotik veya embolik oklüzyonundan kaynaklanır, bu da MCA oklüzyonunu (MCAO) simüle etmek için tasarlanmış kemirgen modellerini son derece alakalı hale getirir6.

İnme araştırmalarında en yaygın olarak benimsenen filament kaynaklı MCAO modeli, orta serebral arterin (MCA) başlangıcında tıkanmayı ve ardından reperfüzyonu kolaylaştırarak beynin subkortikal ve kortikal bölgelerinde geniş enfarktüslere yol açar. Bu modelin avantajı, fokal iskemiyi indükledikten sonra kan akışını eski haline getirme kabiliyetinde yatmaktadır, böylece insan inmesindegözlenen patofizyolojik süreçlere paralel olarak 7. Ek olarak, model, hasarın boyutunda kritik bir faktör olanreperfüzyon hasarını simüle eder 8. Bununla birlikte, MCAO modelinin, enfarktüs hacmindeki değişkenlik de dahil olmak üzere sınırlamaları vardır ve standart sapma, bazı çalışmalarda potansiyel olarak ortalama değerin %64'üne kadar çıkmaktadır9. Otuz yılı aşkın bir süredir kullanılmasına rağmen, modelin güvenilirliğini artırma çabaları devam etmektedir, ancak iskemik lezyon hacmindeki önemli farklılıklar çalışmalar ve laboratuvarlar arasında devam etmektedir 10,11,12.

Bu makale, nörolojik defisit skorlarını ve serebral enfarktüs alanlarını değerlendiren indükleyici modeller için kendi ürettiği bir filamenti tanıtmaktadır. Silikon ile kaplanmış filament uzunlukları ile MCAO modelinin başarısı ve kararlılığı arasındaki korelasyonu inceler. Bu üretim tekniği, övgüye değer tutarlılığa sahip filamentler verir ve nispeten kararlı bir MCAO modelinin geliştirilmesine katkıda bulunur.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri, Shanxi İl Halk Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan deneysel prosedürlere ve standartlara uygundur (onay numarası: 2024 İl Tıbbi Etik Kurulu No. 64). Bu deneyde kullanılan fareler, 8-10 haftalık, 24-26 g ağırlığında erkek C57BL / 6 fareleriydi. Kullanılan reaktiflerin ve ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Filament hazırlama

  1. Orijinal filamentin işaretlenmesi: 6-0 naylon sütürü plastik bir cetvel plakasının etrafına eşit şekilde sarın. Filament kafasından 5 mm ve 10 mm uzakta işaretler yapın (kaplama işaret noktası ve yerleştirme derinliği işaret noktası dahil).
  2. Her iki ucun da mükemmel bir şekilde dairesel olduğundan emin olmak için bir bıçakla dikey olarak aşağı doğru kesin, bu da başlangıçta 2 cm uzunluğunda bir filament ile sonuçlanır (Şekil 1).
  3. Kaplama cihazının imalatı: 26 G'lik bir şırınganın iğne başını koparmak için hemostatik forseps kullanın, ardından iğne deliğini zımpara kağıdı ile mükemmel bir daire şeklinde parlatın. 10 mK'lık bir şırınga ile 2 mL K-704 silikon dolgu macunu çekin ve son olarak iğne başını şırıngaya takın.
  4. Filamentin kaplanması: İlk filamenti, işaretlenmiş 5 mm veya 10 mm konumuna kadar hazırlanan iğne deliğine yerleştirin. Filament stereomikroskop altında tamamen kaplanana kadar şırıngayı yavaşça ve sabit bir şekilde itin (Şekil 2).
  5. Kaplanmış filamentin ayarlanması: Kaplanmış filamenti yapışkan bantla dik olarak sabitleyin ve silikonun tamamen oturması için yaklaşık 20 dakika bekleyin.
  6. Sterilizasyon ve paketleme: Hazırlanan filamentleri %75 alkole batırın, pamuklu çubukla silerek kurulayın ve ardından 5 mL'lik santrifüj tüplerinde paketleyin.

2. MCAO modeli

NOT: Cerrahi aletler otoklavlama ile sterilize edildi (60 dakika boyunca 15 psi'de 121 °C). Ameliyat masası ve diğer ekipmanlar %75 etanol kullanılarak sterilize edildi. Fareler ameliyat öncesi 8 saat aç bırakıldı, ancak suya serbest erişime izin verildi.

  1. Ameliyattan 60 dakika önce analjezi için deri altına 5 mg / kg meloksikam uygulayın. Anestezi sırasında farenin vücut ısısını 37 °C'de tutmak için bir ısı battaniyesi bağlayın.
  2. Spontan hareketler ve bıyık seğirmesi durana kadar% 4 izofluran ile anesteziyi indükleyin, ardından% 1.5'te anesteziyi koruyun (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek). Her iki göze de göz merhemi sürün.
  3. Fareyi sırtüstü pozisyona getirin, başını ve uzuvlarını sabitleyin, boynundaki ve göğsünün üst kısmındaki kılları tıraş edin ve cildi içten dışa %75 etanol ile dezenfekte edin.
  4. Alt çeneden sternuma kadar boynun orta hattı boyunca 2,5 cm uzunluğunda bir cilt kesisi yapın.
  5. Karotis kılıfını ortaya çıkarmak için sağ boyun kaslarını künt bir şekilde inceleyin. Kılıfı açmak ve ortak karotis arteri (CCA), dış karotis arteri (ECA) ve iç karotis arteri (ICA) ayırmak için oftalmik forseps kullanın, vagus sinirini rahatsız etmemeye dikkat edin.
  6. Çatallanmadan önce CCA'yı bir kayma ile geçici olarak bağlayın ve ICA'yı bir mikrocerrahi arter klempi ile klempleyin.
  7. Bipolar pıhtılaşma kalemi kullanarak superior tiroid arterini ECA'dan koterize edin.
  8. Ligasyon için ECA'da iki iplik bırakın: biri kalıcı ligasyon için distal uçta ve diğeri ileride kullanmak üzere gevşek bir düğüm ile proksimal uçta. Filamenti yerleştirmek için oftalmik makas kullanarak ECA üzerindeki iki bitişik harf arasında yaklaşık 0.5 mm'lik bir kesi yapın.
  9. 5 mm veya 10 mm silikon kaplı filamenti kesiden CCA'ya yerleştirin ve ardından gevşek düğümü sıkarak sabitleyin.
  10. ECA'nın distal ucunu kestikten ve kelepçeyi ICA'dan çıkardıktan sonra, filamenti CCA çatallanmasına geri çekin. Ardından, direnç hissedene kadar filamenti derin ICA'ya çevirin ve ilerletin. Filamenti hafifçe geri çekin ve düğümü sıkarak sabitleyin.
  11. Hayvanın derisini 3-0 dikişle dikin ve yarayı iyot ile dezenfekte edin. Fareyi 1 saat boyunca bir kurtarma odasına yerleştirin.
  12. Fareyi tekrar uyuşturun, filamenti nazikçe çıkarın, filamenti sabitleyen ECA ligasyon ipini bağlayın ve kan akışını eski haline getirmek ve orta serebral arteri yeniden perfüze etmek için CCA slipknot'u serbest bırakın.
  13. Fazla iplikleri kesin, boyun derisini dikin ve bölgeyi bir kez daha dezenfekte edin.

3. Sahte operasyon

  1. Sahte operasyonlar için, sağ orta serebral arteri tıkamak için 7 mm'lik silikon kaplı bir filament yerleştirin ve ardından anında reperfüzyona izin vermek için hemen geri çekin.
    NOT: Sonraki prosedür, serebral iskemi geçiren hayvanlarda gerçekleştirilenle aynıdır.

4. Sinir puanı

  1. Her gruptan deney hayvanlarını açık bir alana yerleştirin ve serebral iskemi reperfüzyonundan 4 saat sonra davranışsal postoperatif skorlama yapın.
  2. Başarılı bir modelleme için 1 ile 3 arasındaki puanları göz önünde bulundurun. Değerlendirme kriterleri, Tablo 1'de ayrıntılı olarak açıklandığı gibi Longa puanlama yöntemine10 dayanmaktadır.
  3. Nörolojik eksiklikleri Modifiye Nörolojik Şiddet Skorlarına (mNSS)13 göre değerlendirin ve değerlendirmeler reperfüzyondan 24 saat ve 72 saat sonra yapılır (bkz. Tablo 2).

5. Transkardiyak perfüzyon

  1. Fareyi %1,5 pentobarbital sodyum ile uyuşturun (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek). Fareyi tekrar kafesine yerleştirin ve 10 dakika bekleyin. Ardından, refleks olup olmadığını test etmek ve derin anestezi sağlamak için farenin ayak parmaklarını sıkıştırın.
  2. Fareyi köpük bir stand üzerinde sırtüstü pozisyonda konumlandırın ve uzuvlarını sabitleyin.
  3. Aort duvarının delinmesini önlemek için 25 G'lik bir iğnenin ucunu köreltmek için kesin. İğneyi 20 mL tuzlu su ile doldurulmuş bir şırıngaya bağlayın.
  4. Göğüs kafesinin kürkünü kaldırın ve ksifoid sürecini ortaya çıkarmak için cildi kesmek için makas kullanın. Ksifoid sürecini kavrayın ve kas tabakasını açarak diyaframı ortaya çıkarmak için altından yatay olarak kesin. Kalbe zarar vermemek için diyaframı makasla dikkatlice kesin.
  5. Göğüs kafesini her iki taraftan açmak için sternumun dış tarafı boyunca kesin, toraksın ön duvarını çevirin ve kanama durdurucularla sabitleyin.
  6. Kalbin tabanındaki yağı çıkarmak için pamuklu çubuk kullanın ve aortun kökünü açığa çıkarın.
  7. Kalbi forseps ile sabitleyin, iğneyi kalbin tepesine yerleştirin ve iğne aort duvarından görünene kadar yukarı doğru eğik bir şekilde ilerleyin. İğneyi yerine sıkıştırın.
  8. Kan akışını gözlemlemek için sağ atriyumda küçük bir kesi yapın. Şırınga ile salini sabit bir şekilde perfüze edin, kanın sağ atriyumdan çıkmasını izleyin. Atık su berraklaştığında perfüzyonudurdurun 14.
  9. Perfüzyondan sonra, beyni15 hasat etmek için farenin kafasını kesin ve daha sonraki işlemler için -20 ° C'lik bir dondurucuya koyun.

6. TTC boyama ile enfarktüs hacmi değerlendirmesi

  1. Temin edilen beyin dokularını -20 °C'lik bir dondurucuda 20 dakika boyunca hızlı bir şekilde dondurun, ardından önceden soğutulmuş bir beyin dilimleme kalıbına yerleştirin ve 1 mm kalınlığında dilimler halinde porsiyonlayın.
  2. Elde edilen beyin bölümlerini %2 TTC çözeltisine daldırın ve 37 ° C'de 20 dakika inkübe edin.
  3. Beyin dilimlerini gece boyunca %4 paraformaldehite batırın ve ertesi gün fotoğraf çekin.
  4. ImageJ kullanarak her dilim için enfarktüslü alanı ve toplam beyin alanını ölçün. Aşağıdaki formülü kullanarak enfarktüs hacim oranını hesaplayın: Enfarktüs Hacmi % = (Enfarktüslü alanların toplamı / Toplam beyin alanlarının toplamı) × %100.

Sonuçlar

MCAO modelinin oluşturulmasında, filamentleri ve bitmiş filamentleri imal etmek için kullanılan birincil araçlar Şekil 3'te gösterilmektedir. Filament üretimini takiben, filamentin dış karotis arterden sokulmasıyla MCAO modeli oluşturulur ve operasyon süresi kaydedilir. Başarılı modelleme, filamentin çekilmesinden 4 saat sonra 1-3 Longa skoru ile tanımlanır. Ameliyattan sonra vücut ağırlığı günlük olarak takip edilir. Nörolojik d...

Tartışmalar

Bu çalışma, filament üretimi için basit ve uygun maliyetli bir yöntem göstermekte ve bir MCAO modeli oluşturmada fizibilitesini doğrulamaktadır. Filamentin silikon kaplamasının uzunluğu, deneysel ihtiyaçlara göre ayarlanabilir ve ek esneklik sunar. 5 mm'lik bir filament embolinin hazırlanması, farelerde herhangi bir subaraknoid kanama (SAK) oluşumu olmadan% 100 başarı oranı elde etti. 10 mm filament emboli kullanan grupta, SAK vakaları vardı, farelerin geri kalanı...

Açıklamalar

Yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma Wu Jieping Tıp Vakfı (320.6750.161290) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
10 mL SyringeHaidike Medical Products Co., Ltd.Instrument for making filaments
2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride (TTC)Sigma-AldrichG3005Dye for TTC staining
24-well culture plateCorning CLS3527Vessel for TTC staining
26 G syringe needleHaidike Medical Products Co., Ltd.Instrument for making filaments
4% paraformaldehydeServicebioG1101Tissue fixation
6-0 nylon sutureHaidike Medical Products Co., Ltd.Materials for making filaments
Anesthesia system for isofluraneRwd Life Science Co., Ltd.R610 Anesthetized animal
Bipolar electrocoagulation generatorYirun Medical Instrument Co., Ltd.ZG300Equipment for surgery
Constant temperature water bathSpring  Instrument Co., Ltd.HH-M6TTC staining
Eye ointmentGuangzhou PharmaceuticalH44023098Material for surgery
Heat blanketZH Biomedical Instrument Co., Ltd.Maintain body temperatur 
IsofluraneRwd Life Science Co., Ltd.R510-22-10Anesthetized animal
MeloxicamBoehringer-IngelheimJ20160020Analgesia for animal
Microsurgical artery clampShanghai Jinzhong Surgical Instruments Co., Ltd. W40130Instrument for surgery
Microsurgical hemostatic clamp forcepsShanghai Jinzhong Surgical Instruments Co., Ltd. M-W-0022Instrument for surgery
Microsurgical instruments setRwd Life Science Co., Ltd.SP0009-REquipment for surgery
Mouse thermometerHubei Dasjiaer BiotechnologyFT3400Intraoperative temperature monitoring
Pentobarbital sodiumSigma-AldrichP3761Euthanized animal
ShaverJoyu Electrical AppliancesPHC-920Equipment for surgery
Silicone SealantKafuterK-704Materials for making filaments
StereomicroscopeRwd Life Science Co., Ltd.77001SEquipment for surgery
Suture thread with needle (3-0)Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. F404SUS302Equipment for surgery

Referanslar

  1. Collaborators GBDS. Global, regional, and national burden of stroke and its risk factors, 1990-2019: A systematic analysis for the global burden of disease study 2019. Lancet Neurol. 20 (10), 795-820 (2021).
  2. Kleindorfer, D. O., et al. Guideline for the prevention of stroke in patients with stroke and transient ischemic attack: A guideline from the American Heart Association/American Stroke Association. Stroke. 52 (7), e364-e467 (2021).
  3. Saini, V., Guada, L., Yavagal, D. R. Global epidemiology of stroke and access to acute ischemic stroke interventions. Neurology. 97 (20 Suppl 2), S6-S16 (2021).
  4. Hill, M. D., Coutts, S. B. Alteplase in acute ischaemic stroke: The need for speed. Lancet. 384 (9958), 1904-1906 (2014).
  5. Asif, K. S., et al. Mechanical thrombectomy global access for stroke (mt-glass): A mission thrombectomy (mt-2020 plus) study. Circulation. 147 (16), 1208-1220 (2023).
  6. Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Des Devel Ther. 9, 3445-3454 (2015).
  7. Ringelstein, E. B., et al. Type and extent of hemispheric brain infarctions and clinical outcome in early and delayed middle cerebral artery recanalization. Neurology. 42 (2), 289-298 (1992).
  8. Shaik, N. F., Regan, R. F., Naik, U. P. Platelets as drivers of ischemia/reperfusion injury after stroke. Blood Adv. 5 (5), 1576-1584 (2021).
  9. Zhang, S. R., et al. Large-scale multivariate analysis to interrogate an animal model of stroke: Novel insights into poststroke pathology. Stroke. 52 (11), 3661-3669 (2021).
  10. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
  11. Chen, Y., Ito, A., Takai, K., Saito, N. Blocking pterygopalatine arterial blood flow decreases infarct volume variability in a mouse model of intraluminal suture middle cerebral artery occlusion. J Neurosci Methods. 174 (1), 18-24 (2008).
  12. Yuan, F., et al. Optimizing suture middle cerebral artery occlusion model in c57bl/6 mice circumvents posterior communicating artery dysplasia. J Neurotrauma. 29 (7), 1499-1505 (2012).
  13. Bieber, M., et al. Validity and reliability of neurological scores in mice exposed to middle cerebral artery occlusion. Stroke. 50 (10), 2875-2882 (2019).
  14. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), e3564 (2012).
  15. Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy. J Cereb Blood Flow Metab. 13 (4), 683-692 (1993).
  16. Kitagawa, K., et al. Cerebral ischemia after bilateral carotid artery occlusion and intraluminal suture occlusion in mice: Evaluation of the patency of the posterior communicating artery. J Cereb Blood Flow Metab. 18 (5), 570-579 (1998).
  17. Mccoll, B. W., Carswell, H. V., Mcculloch, J., Horsburgh, K. Extension of cerebral hypoperfusion and ischaemic pathology beyond mca territory after intraluminal filament occlusion in c57bl/6j mice. Brain Res. 997 (1), 15-23 (2004).
  18. Liu, Z., et al. Optimisation of a mouse model of cerebral ischemia-reperfusion to address issues of survival and model reproducibility and consistency. Comput Intell Neurosci. 2022, 7594969 (2022).
  19. Ward, R., Collins, R. L., Tanguay, G., Miceli, D. A quantitative study of cerebrovascular variation in inbred mice. J Anat. 173, 87-95 (1990).
  20. Hanna, K. L., Hepworth, L. R., Rowe, F. Screening methods for post-stroke visual impairment: A systematic review. Disabil Rehabil. 39 (25), 2531-2543 (2017).
  21. Rowe, F. J. Stroke survivors' views and experiences on impact of visual impairment. Brain Behav. 7 (9), e00778 (2017).
  22. Scoles, D., Mcgeehan, B., Vanderbeek, B. L. The association of stroke with central and branch retinal arterial occlusion. Eye (Lond). 36 (4), 835-843 (2022).
  23. Kim, Y. D., et al. Cerebral magnetic resonance imaging of coincidental infarction and small vessel disease in retinal artery occlusion. Sci Rep. 11 (1), 864 (2021).
  24. Emiroglu, M. Y., et al. Effects of obstructive carotid artery disease on ocular circulation and the safety of carotid artery stenting. Heart Lung Circ. 26 (10), 1069-1078 (2017).
  25. Cotofana, S., Lachman, N. Arteries of the face and their relevance for minimally invasive facial procedures: An anatomical review. Plast Reconstr Surg. 143 (2), 416-426 (2019).
  26. Xu, X., et al. Dibazol-induced relaxation of ophthalmic artery in C57bl/6J mice is correlated with the potency to inhibit voltage-gated ca(2+) channels. Exp Eye Res. 231, 109468 (2023).
  27. Justic, H., et al. Redefining the Koizumi model of mouse cerebral ischemia: A comparative longitudinal study of cerebral and retinal ischemia in the Koizumi and Longa middle cerebral artery occlusion models. J Cereb Blood Flow Metab. 42 (11), 2080-2094 (2022).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Silikon Kapl FilamentFarelerOrta Serebral Arter T kan klMCAO Modeliskemik nmeSerebrovask ler Hastal k Ara t rmalarHayvan ModelleriTrombolizEndovask ler Giri imlerProtokol Geli tirmeC57 FarelerTedavi Sonu larnme z rl l

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Araştırma

Eğitim

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır