Filament enduit de silicone fabriqué à la main pour souris Modèles d’occlusion de l’artère cérébrale moyenne

Résumé

Ce protocole décrit une méthode simple de création de filaments enduits pour le modèle d’occlusion de l’artère cérébrale moyenne (MCAO) chez la souris à l’aide de silicone, de sutures en nylon et d’aiguilles de seringue. Cette méthode permet de produire des filaments d’un diamètre constant et de différentes longueurs d’emballage en silicone adaptées aux besoins expérimentaux.

Résumé

Avec le vieillissement de la population mondiale, l’AVC ischémique est devenu la deuxième cause d’invalidité et de mortalité dans le monde, faisant peser un immense fardeau sur la société et les familles. Bien que des traitements tels que la thrombolyse intraveineuse et les interventions endovasculaires puissent améliorer considérablement les résultats pour les patients ayant subi un AVC ischémique aigu, seul un petit pourcentage de personnes bénéficient de ces thérapies. Pour faire progresser notre compréhension de la maladie et découvrir des traitements plus efficaces, les chercheurs développent et perfectionnent continuellement des modèles animaux. Parmi ceux-ci, le modèle d’occlusion de l’artère cérébrale moyenne (MCAO) se distingue comme le modèle le plus couramment utilisé dans la recherche sur les maladies cérébrovasculaires. Le filament utilisé dans ce modèle est crucial pour son développement. Ce protocole décrit une méthode pour créer des filaments avec des diamètres constants et des longueurs variables de revêtement en silicone. Le modèle MCAO produit à l’aide de cette méthode chez des souris C57 a démontré un succès et une cohérence élevés, offrant un outil précieux pour des investigations sur mesure dans les maladies cérébrovasculaires ischémiques.

Introduction

L’AVC est l’une des causes les plus fréquentes de mortalité et d’invalidité dans le monde. Les accidents vasculaires cérébraux ischémiques et hémorragiques sont les principaux types d’événements cérébrovasculaires, les accidents vasculaires cérébraux ischémiques représentant environ 87 % des cas ^1,2,3. À l’heure actuelle, il existe deux modalités de traitement pour les patients victimes d’un AVC ischémique : la thérapie pharmacologique par activateur tissulaire recombinant du plasminogène (rtPA) et la thrombectomie mécanique. Cependant, la fenêtre thérapeutique étroite et les critères d’exclusion étendus limitent l’application de ces traitements, ne bénéficiant qu’à une minorité de patients. Cela souligne la nécessité de poursuivre les efforts pour améliorer les traitements de l’AVC ischémique ^4,5. Les modèles in vitro sont inadéquats pour reproduire les réponses physiopathologiques complexes après un AVC, ce qui fait des modèles animaux un élément indispensable de la recherche préclinique sur l’AVC. L’ischémie cérébrale focale humaine est le plus souvent causée par une occlusion thrombotique ou embolique de l’artère cérébrale moyenne (ACM), ce qui rend les modèles de rongeurs conçus pour simuler l’occlusion de l’ACM (MCAO) très pertinents⁶.

Le modèle MCAO induit par filament, le plus largement adopté dans la recherche sur les accidents vasculaires cérébraux, facilite l’occlusion au début de l’artère cérébrale moyenne (ACM) et la reperfusion ultérieure, entraînant des infarctus étendus dans les zones sous-corticales et corticales du cerveau. L’avantage de ce modèle réside dans sa capacité à rétablir le flux sanguin après avoir induit une ischémie focale, mettant ainsi en parallèle les processus physiopathologiques observés dans l’AVC humain⁷. De plus, le modèle simule une lésion de reperfusion, un facteur critique dans l’étendue des dommages⁸. Cependant, le modèle MCAO présente des limites, notamment la variabilité du volume de l’infarctus, l’écart-type pouvant atteindre jusqu’à 64 % de la valeur moyenne dans certaines études⁹. Malgré plus de trois décennies d’utilisation, des efforts sont en cours pour améliorer la fiabilité du modèle, mais des variations significatives du volume des lésions ischémiques persistent entre les études et les laboratoires 10,11,12.

Cet article présente un filament auto-fabriqué pour induire des modèles évaluant les scores de déficit neurologique et les zones d’infarctus cérébral. Il examine la corrélation entre les longueurs de filament recouvertes de silicone et le succès et la stabilité du modèle MCAO. Cette technique de production produit des filaments avec une cohérence louable, contribuant au développement d’un modèle MCAO relativement stable.

Protocole

Toutes les procédures sur les animaux ont été conformes aux procédures expérimentales et aux normes approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Hôpital populaire provincial du Shanxi (numéro d’approbation : Comité provincial d’éthique médicale n° 64 de 2024). Les souris utilisées dans cette expérience étaient des souris mâles C57BL/6, âgées de 8 à 10 semaines et pesant de 24 à 26 g. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Préparation du filament

1. Marquage du filament d’origine : Enroulez uniformément la suture en nylon 6-0 autour d’une plaque de règle en plastique. Faites des marques à 5 mm et 10 mm de la tête du filament (y compris le point de repère de revêtement et le point de repère de profondeur d’insertion).
2. Coupez verticalement vers le bas à l’aide d’une lame pour vous assurer que les deux extrémités sont parfaitement circulaires, ce qui donne un filament initial de 2 cm de long (figure 1).
3. Fabrication du dispositif de revêtement : à l’aide d’une pince hémostatique, cassez la tête de l’aiguille d’une seringue de 26 G, puis polissez le trou de l’aiguille en un cercle parfait avec du papier de verre. Prélevez 2 ml de mastic silicone K-704 à l’aide d’une seringue de 10 mK, puis fixez la tête de l’aiguille à la seringue.
4. Enduction du filament : Insérez le filament initial dans le trou de l’aiguille préparé jusqu’à la position marquée de 5 mm ou 10 mm. Poussez lentement et régulièrement la seringue jusqu’à ce que le filament soit entièrement recouvert au stéréomicroscope (Figure 2).
5. Réglage du filament enduit : Fixez le filament enduit à la verticale avec du ruban adhésif et attendez environ 20 minutes que le silicone soit complètement pris.
6. Stérilisation et emballage : Faites tremper les filaments préparés dans de l’alcool à 75 %, essuyez-les avec un coton-tige, puis emballez-les dans des tubes à centrifuger de 5 ml.

2. Modèle MCAO

REMARQUE : Les outils chirurgicaux ont été stérilisés par autoclave (121 °C à 15 psi pendant 60 min). La table d’opération et d’autres équipements ont été désinfectés avec de l’éthanol à 75 %. Les souris ont été à jeun pendant 8 heures avant l’opération, mais ont laissé un accès libre à l’eau.

1. Administrer 5 mg/kg de méloxicam par voie sous-cutanée pour l’analgésie 60 minutes avant la chirurgie. Connectez une couverture chauffante pour maintenir la température corporelle de la souris à 37 °C pendant l’anesthésie.
2. Induire une anesthésie avec de l’isoflurane à 4 % jusqu’à ce que les mouvements spontanés et les contractions des moustaches cessent, puis maintenir l’anesthésie à 1,5 % (en suivant les protocoles approuvés par l’établissement). Appliquez une pommade pour les yeux sur les deux yeux.
3. Placez la souris en position couchée, fixez sa tête et ses membres, rasez les poils de son cou et de sa poitrine et désinfectez la peau avec de l’éthanol à 75 % de l’intérieur.
4. Faites une incision cutanée de 2,5 cm de long le long de la ligne médiane du cou, de la mâchoire inférieure au sternum.
5. Disséquez brutalement les muscles droits du cou pour exposer la gaine carotidienne. Utilisez une pince ophtalmique pour ouvrir la gaine et séparer l’artère carotide commune (ACC), l’artère carotide externe (ECA) et l’artère carotide interne (ICA), en prenant soin d’éviter de perturber le nerf vague.
6. Ligaturer temporairement l’ACC avec un nœud coulant avant la bifurcation et clamper l’ICA avec une pince artérielle microchirurgicale.
7. Cautériser l’artère thyroïdienne supérieure de l’ECA à l’aide d’un stylo de coagulation bipolaire.
8. Laissez deux fils sur l’ECA pour la ligature : un sur l’extrémité distale pour la ligature permanente et un autre sur l’extrémité proximale avec un nœud lâche pour une utilisation future. Faites une incision d’environ 0,5 mm entre les deux ligatures sur l’ECA à l’aide de ciseaux ophtalmiques pour insérer le filament.
9. Insérez le filament recouvert de silicone de 5 mm ou 10 mm dans le CCA par l’incision, puis fixez-le en serrant le nœud lâche.
10. Après avoir coupé l’extrémité distale de l’ECA et retiré la pince de l’ICA, rétractez le filament jusqu’à la bifurcation de l’ECA. Ensuite, retournez et avancez le filament dans l’ICA profond jusqu’à ce que l’on ressente une résistance. Retirez légèrement le filament et fixez-le en resserrant le nœud.
11. Suturez la peau de l’animal avec une suture 3-0 et désinfectez la plaie avec de l’iode. Placez la souris dans une chambre de récupération pendant 1 h.
12. Anesthésie à nouveau la souris, retire doucement le filament, attache le fil de ligature ECA fixant le filament et relâche le nœud coulant CCA pour rétablir le flux sanguin et reperfuser l’artère cérébrale moyenne.
13. Coupez les fils en excès, suturez la peau du cou et désinfectez à nouveau la zone.

3. Opération fictive

1. Pour les opérations simulées, insérez un filament recouvert de silicone de 7 mm pour occlure l’artère cérébrale moyenne droite, puis retirez-le immédiatement pour permettre une reperfusion instantanée.
   REMARQUE : La procédure ultérieure est identique à celle effectuée sur les animaux subissant une ischémie cérébrale.

4. Neuroscore

1. Placez les animaux de laboratoire de chaque groupe dans un champ ouvert et effectuez une évaluation comportementale postopératoire 4 heures après la reperfusion de l’ischémie cérébrale.
2. Pour une modélisation réussie, considérez des scores compris entre 1 et 3. Les critères d’évaluation sont basés sur la méthode de notation Longa¹⁰, comme détaillé dans le tableau 1.
3. Évaluer les déficits neurologiques selon les scores de gravité neurologique modifiés (mNSS)¹³, avec des évaluations effectuées 24 h et 72 h après la reperfusion (voir tableau 2).

5. Perfusion transcardiaque

1. Anesthésier la souris avec du pentobarbital sodique à 1,5 % (en suivant les protocoles approuvés par l’établissement). Remettez la souris dans sa cage et attendez 10 min. Ensuite, pincez les orteils de la souris pour tester l’absence de réflexes et assurer une anesthésie profonde.
2. Placez la souris en position couchée sur un support en mousse et fixez ses membres.
3. Coupez la pointe d’une aiguille de 25 G pour l’émousser, évitant ainsi la perforation de la paroi aortique. Branchez l’aiguille à une seringue remplie de 20 ml de solution saline.
4. Soulevez la fourrure du thorax et utilisez des ciseaux pour couper la peau afin d’exposer le processus xiphoïde. Saisissez le processus xiphoïde et coupez horizontalement en dessous pour exposer le diaphragme en ouvrant la couche musculaire. Coupez soigneusement le diaphragme avec des ciseaux, en évitant d’endommager le cœur.
5. Coupez le long de la face externe du sternum pour ouvrir la cage thoracique des deux côtés, retournez la paroi antérieure du thorax et fixez-la avec des hémostats.
6. Utilisez un coton-tige pour enlever la graisse à la base du cœur, exposant la racine de l’aorte.
7. Fixez le cœur à l’aide d’une pince, insérez l’aiguille à l’apex du cœur et avancez obliquement vers le haut jusqu’à ce que l’aiguille soit visible à travers la paroi aortique. Fixez l’aiguille en place.
8. Faites une petite incision dans l’oreillette droite pour observer la circulation sanguine. Perfuser régulièrement la solution saline avec la seringue, en surveillant si le sang sort de l’oreillette droite. Une fois que l’effluent est dégagé, arrêter la perfusion¹⁴.
9. Après la perfusion, décapitez la souris pour récolter le cerveau¹⁵ et placez-la dans un congélateur à -20 °C pour un traitement ultérieur.

6. Évaluation du volume de l’infarctus par coloration TTC

1. Congelez rapidement les tissus cérébraux obtenus dans un congélateur à -20 °C pendant 20 min, puis placez-les sur un moule à trancher le cerveau pré-refroidi et coupez-les en tranches de 1 mm d’épaisseur.
2. Immerger les sections de cerveau obtenues dans une solution à 2 % de TTC et incuber à 37 °C pendant 20 min.
3. Immergez les tranches de cerveau dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant la nuit et prenez des photos le lendemain.
4. Mesurez la zone infarctus de chaque tranche et la surface totale du cerveau à l’aide d’ImageJ. Calculez le rapport de volume de l’infarctus à l’aide de la formule : % de volume de l’infarctus = (Somme des zones infarctus / Somme des aires cérébrales totales) × 100 %.

Résultats

Dans la création du modèle MCAO, les principaux outils utilisés pour la fabrication des filaments et les filaments finis sont illustrés à la figure 3. Après la production du filament, le modèle MCAO est établi en insérant le filament dans l’artère carotide externe, la durée de l’opération étant enregistrée. Une modélisation réussie est définie par un score Longa de 1-3 4 h après le retrait du filament. Le poids corporel est surveillé q...

Discussion

Cette étude démontre une méthode simple et rentable pour fabriquer du filament, confirmant sa faisabilité dans la création d’un modèle MCAO. La longueur de la couche de silicone du filament peut être ajustée en fonction des besoins expérimentaux, offrant ainsi une flexibilité supplémentaire. La préparation d’une embolie filamentaire de 5 mm a permis d’obtenir un taux de réussite de 100 % sans aucune apparition d’hémorragie sous-arachnoïdienne (HSA) chez la souris....

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL Syringe	Haidike Medical Products Co., Ltd.		Instrument for making filaments
2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride (TTC)	Sigma-Aldrich	G3005	Dye for TTC staining
24-well culture plate	Corning	CLS3527	Vessel for TTC staining
26 G syringe needle	Haidike Medical Products Co., Ltd.		Instrument for making filaments
4% paraformaldehyde	Servicebio	G1101	Tissue fixation
6-0 nylon suture	Haidike Medical Products Co., Ltd.		Materials for making filaments
Anesthesia system for isoflurane	Rwd Life Science Co., Ltd.	R610	Anesthetized animal
Bipolar electrocoagulation generator	Yirun Medical Instrument Co., Ltd.	ZG300	Equipment for surgery
Constant temperature water bath	Spring  Instrument Co., Ltd.	HH-M6	TTC staining
Eye ointment	Guangzhou Pharmaceutical	H44023098	Material for surgery
Heat blanket	ZH Biomedical Instrument Co., Ltd.		Maintain body temperatur
Isoflurane	Rwd Life Science Co., Ltd.	R510-22-10	Anesthetized animal
Meloxicam	Boehringer-Ingelheim	J20160020	Analgesia for animal
Microsurgical artery clamp	Shanghai Jinzhong Surgical Instruments Co., Ltd.	W40130	Instrument for surgery
Microsurgical hemostatic clamp forceps	Shanghai Jinzhong Surgical Instruments Co., Ltd.	M-W-0022	Instrument for surgery
Microsurgical instruments set	Rwd Life Science Co., Ltd.	SP0009-R	Equipment for surgery
Mouse thermometer	Hubei Dasjiaer Biotechnology	FT3400	Intraoperative temperature monitoring
Pentobarbital sodium	Sigma-Aldrich	P3761	Euthanized animal
Shaver	Joyu Electrical Appliances	PHC-920	Equipment for surgery
Silicone Sealant	Kafuter	K-704	Materials for making filaments
Stereomicroscope	Rwd Life Science Co., Ltd.	77001S	Equipment for surgery
Suture thread with needle (3-0)	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd.	F404SUS302	Equipment for surgery