JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

قمنا بتصنيع وتوصيف ركيزة قائمة على الجيلاتين قابلة للضبط لزراعة الخلايا البطانية الوعائية (ECs) في ظل ظروف تدفق الأوعية الدموية ذات الصلة. يكرر سطح المحاكاة الحيوية هذا كلا من الحالات الفسيولوجية والمرضية ، مما يتيح دراسة القوى الميكانيكية على سلوك EC وتعزيز فهمنا لصحة الأوعية الدموية وآليات المرض.

Abstract

نقدم نموذجا مبتكرا في المختبر يهدف إلى التحقيق في الآثار المشتركة لصلابة الأنسجة وإجهاد القص على وظيفة الخلايا البطانية (EC) ، والتي تعتبر ضرورية لفهم صحة الأوعية الدموية وظهور أمراض مثل تصلب الشرايين. تقليديا ، استكشفت الدراسات تأثيرات إجهاد القص وصلابة الركيزة على ECs ، بشكل مستقل. ومع ذلك ، يجمع هذا النظام المتكامل بين هذه العوامل لتوفير محاكاة أكثر دقة للبيئة الميكانيكية للأوعية الدموية. الهدف هو فحص النقل الميكانيكي EC عبر مستويات تصلب الأنسجة المختلفة وظروف التدفق باستخدام ECs البشرية. نقوم بتفصيل بروتوكول توليف الهلاميات المائية الجيلاتين ميثاكريلات (GelMA) مع صلابة قابلة للضبط وبذرها مع ECs لتحقيق التقارب. بالإضافة إلى ذلك ، نصف تصميم وتجميع غرفة تدفق فعالة من حيث التكلفة ، تكملها محاكاة ديناميكيات الموائع الحسابية ، لتوليد ظروف تدفق فسيولوجية تتميز بالتدفق الصفحي ومستويات إجهاد القص المناسبة. يتضمن البروتوكول أيضا وضع العلامات الفلورية للفحص المجهري متحد البؤر ، مما يتيح تقييم استجابات EC لكل من امتثال الأنسجة وظروف التدفق. من خلال إخضاع ECs المستزرعة لمحفزات ميكانيكية متكاملة متعددة ، يتيح هذا النموذج إجراء تحقيقات شاملة في كيفية تأثير عوامل مثل ارتفاع ضغط الدم والشيخوخة على وظيفة EC وأمراض الأوعية الدموية بوساطة EC. ستكون الأفكار المكتسبة من هذه التحقيقات مفيدة في توضيح الآليات الكامنة وراء أمراض الأوعية الدموية وفي تطوير استراتيجيات علاج فعالة.

Introduction

تلعب البطانة ، التي تبطن السطح الداخلي للأوعية الدموية ، دورا محوريا في الحفاظ على صحة الأوعية الدموية. تعتبر الخلايا البطانية (ECs) أساسية لتنظيم وظائف القلب والأوعية الدموية المختلفة ، بما في ذلك التحكم في نغمة الأوعية الدموية ، والنفاذية الانتقائية ، والإرقاء ، والنقل الميكانيكي1،2. ربطت الأبحاث بقوة بين ضعف المفوضية الأوروبية والدور الأساسي في تطور تصلب الشرايين. والجدير بالذكر أن ECs تواجه قوى ميكانيكية متنوعة في الواجهات حيث تتفاعل مع تدفق الدم وأنسجة الأوعية الدموية الأساسية 3,4. ربطت العديد من الدراسات اختلال وظيفي في EC بالتغيرات غير الطبيعية في العوامل الميكانيكية داخل بيئة الأوعية الدموية ، مثل إجهاد قص السوائل الناتج عن تدفق الدم وصلابة الأنسجة5،6،7.

ومع ذلك ، فقد حظيت الأبحاث السابقة باهتمام محدود في فهم الآثار المشتركة لصلابة الأنسجة وإجهاد القص على وظيفة EC. لتعزيز القدرة على ترجمة نتائج البحوث إلى علاجات فعالة لتصلب الشرايين وأمراض القلب والأوعية الدموية الأخرى ، من الضروري تحسين النماذج الخلوية المستخدمة في هذا المجال. تم إحراز تقدم كبير في إضفاء الطابع الإنساني على النماذج الخلوية من خلال استخدام ECs البشرية وتعريضها إما لإجهاد القص أو ركائز بمستويات صلابة متفاوتة8،9،10. ومع ذلك ، فإن اعتماد وصقل النماذج الخلوية التي تدمج بيئات التدفق الديناميكية مع ركائز EC التي تمتلك خصائص صلابة قابلة للتعديل قد تقدمت ببطء. يكمن التحدي في ابتكار ركائز EC غير منتفخة لمنع التغيرات في معلمات التدفق داخل قناة التدفق مع تسهيل زراعة أحاديات EC سليمة وملتصقة جيدا. يمكن لنموذج في المختبر قادر على التغلب على هذه العقبات أن يسهل إجراء تحقيقات أكثر فعالية في كيفية تأثير ارتفاع ضغط الدم والشيخوخة وظروف التدفق بشكل تعاوني على النقل الميكانيكي للمفوضية الأوروبية ، وصحة الأوعية الدموية ، وفي النهاية تطور تصلب الشرايين. تم تطوير طرق مختلفة لتطبيق إجهاد القص على الخلايا مع التحكم في صلابة الركيزة ، بما في ذلك الألواح الدوارة وأجهزة الموائع الدقيقة. في طريقة اللوحة الدوارة ، يتم وضع الخلايا بين لوحين ويتم تطبيق إجهاد القص من خلال الحركة الدورانية للألواح. هذه الطريقة أقل تعقيدا وتوفر نموذجا سريعا ؛ ومع ذلك ، فإنه يعاني من تباين إجهاد القص المكاني ، مع إجهاد القص الصفري في المركز والحد الأقصى لإجهاد القص في المحيط11.

من ناحية أخرى ، تمثل أجهزة الموائع الدقيقة الجيل الجديد من الأدوات مع القدرة على التحكم في صلابة الركيزة وظروف التدفق. هذه الأنظمة مناسبة لمحاكاة الأوعية الدموية الدقيقة تحت ظروف التدفق الصفحي. ومع ذلك ، فإن دراسة تصلب الشرايين بمثل هذه الأجهزة أمر غير عملي ، حيث يحدث تصلب الشرايين في الأوعية الكبيرة ذات التدفق المضطرب11. تهدف هذه الورقة إلى المساهمة في مجال البحث النقدي لدراسات EC من خلال تقديم نظام فعال من حيث التكلفة قادر على فحص آثار مستويات الصلابة المتفاوتة في ركائز EC في ظل ظروف تدفق مختلفة. يدمج النظام ركائز ذات صلابة مختلفة لمحاكاة الأوعية الدموية المرضية والفسيولوجية. يحدد هذا البروتوكول طريقة إنشاء الهلاميات المائية القائمة على الجيلاتين بدون مستويات تورم وتصلب تبلغ 5 كيلو باسكال و 10 كيلو باسكال ، مما يمثل الصلابة الفسيولوجية والمرضية ، على التوالي. بالإضافة إلى ذلك ، تم تفصيل بناء غرفة تدفق لوحة متوازية قادرة على دمج هذه الركائز. تم استخدام ديناميكا الموائع الحسابية (CFD) لتقييم إجهاد القص وظروف التدفق. تم وصف تحضير الهلاميات المائية لثقافة EC وتنفيذ تجربة تدفق لمدة 6 ساعات ، تليها مناقشة حول التلوين المناعي بعد التجربة.

Protocol

1. تخليق GelMA

  1. تحضير محلول 0.2 M من كربونات الصوديوم اللامائية ومحلول 0.2 M من بيكربونات الصوديوم.
  2. امزج 46 مل من محلول بيكربونات الصوديوم مع 15 مل من محلول كربونات الصوديوم وأضف 139 مل من الماء منزوع الأيونات (DI). اضبط الرقم الهيدروجيني على 9.5 باستخدام 0.1 M NaOH و HCl إذا لزم الأمر.
  3. أضف 10 جم من النوع A ، 300 بلوم جيلاتين من جلد الخنزير إلى 100 مل من المخزن المؤقت لكربونات بيكربونات بتركيز 10٪ وزن / حجم.
  4. قم بإذابة الجيلاتين باستخدام حمام مائي 55 درجة مئوية مع تقليب المحلول عند 700 دورة في الدقيقة باستخدام محرك مغناطيسي. بمجرد إذابته بالكامل ، اضبط الرقم الهيدروجيني لمحلول الجيلاتين على 9.5 باستخدام 0.1 M NaOH.
  5. لبدء الميثاكريل ، أضف 938 ميكرولتر من أنهيدريد الميثاكريليك (MAH) بالتنقيط إلى المحلول. تحسين التوزيع الأولي ل MAH في محلول الجيلاتين عن طريق حقنه في مواقع مختلفة ، بما في ذلك أعماق مختلفة ومسافات شعاعية من المركز.
  6. لف وعاء التفاعل بورق الألمنيوم لمنع التعرض للضوء. حافظ على درجة الحرارة عند 55 درجة مئوية وحرك المحلول عند 500 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة لإكمال التفاعل (الشكل 1 أ)12.
    ملاحظة: يتوقف التفاعل عند درجة حموضة أقل من 7.4.
  7. تحضير كأس زجاجية سعة 2 لتر تحتوي على 1.8 لتر من الأسيتون، وكأس زجاجية سعة 0.6 لتر تحتوي على 0.3 لتر من الأسيتون.
  8. أضف محلول GelMA الناتج بالتنقيط إلى الدورق سعة 2 لتر مع التقليب عند 200 دورة في الدقيقة للحث على هطول الأمطار13. لزيادة جمع المنتج المترسب إلى أقصى حد ، ضع قضيبا أو ملعقة من الفولاذ المقاوم للصدأ كموقع نواة لتسهيل النقل.
  9. انقل المنتج من الدورق الأكبر إلى الدورق الأصغر واتركه لمدة 10 دقائق قبل الانتقال إلى خطوة التجفيف. يجب أن يظهر GelMA المترسب كألياف بيضاء.
  10. اجمع المنتج على ورق ماص ، وجففه في فرن مفرغ من الهواء في درجة حرارة الغرفة (RT) ، وقم بتخزينه في -20 درجة مئوية حتى استخدامه مرة أخرى.
    ملاحظة: يمكن العثور على تفاصيل إضافية حول التوصيف الكيميائي للمنتج عبر الرنين المغناطيسي النووي للبروتون (1H NMR) في عمل منشور مسبقا8.

2. تملح الزجاج

ملاحظة: يوفر توصيل الهلاميات المائية بالشرائح الزجاجية سطحا مستويا ومستويا ، مما يسهل المناولة ويضمن الاستقرار تحت ضغط القص المشتق من التدفق. يعد تشغيل الزجاج باستخدام ميثاكريلات البروبيل 3 (تريميثوكسي سيليل) ضروريا لتعزيز خصائص السطح وتمكين الارتباط التساهمي للهلاميات المائية أثناء عملية البلمرة.

  1. قطع شرائح المجهر العادي بدقة (سمك 1 مم) إلى قطع مماثلة لأبعاد الهيدروجيل النهائية باستخدام قاطع زجاجي. اغسل الشرائح المقطوعة بالصابون لإزالة الملوثات السطحية والحطام الذي قد يعيق معالجة السطح الزجاجي.
    ملاحظة: إذا لزم الأمر ، صوتنة الشرائح الزجاجية لمدة 5 دقائق في الإيثانول ، ثم جففها في الهواء.
  2. تحضير محلول 0.5 ٪ من 3- (تريميثوكسيسيليل) بروبيل ميثاكريلات في الإيثانول المطلق. تحضير محلول حمض الخليك الجليدي 10 ٪ في الماء DI. امزج المحاليل لتحقيق تركيز نهائي من حمض الخليك الجليدي بنسبة 3٪.
    ملاحظة: يمكن تحضير محلول حمض الأسيتيك الجليدي بكميات كبيرة وتخزينه.
  3. قم بتنظيم الشرائح الزجاجية في وعاء زجاجي لضمان عدم انسداد الأسطح الزجاجية. صب المحلول الناتج على الشرائح الزجاجية واحتفظ بها لمدة 5 دقائق تقريبا على الروك عند 80 دورة في الدقيقة حتى يكتمل التفاعل. تأكد من تعديل جانبي الشرائح الزجاجية عن طريق إزالة أي فقاعات هواء محاصرة.
  4. بعد اكتمال التفاعل ، استنشق المحلول واغسل الشرائح الزجاجية بالإيثانول 2x. جفف الشرائح في الهواء وقم بتخزينها في الظلام في RT.
    ملاحظة: تحتفظ الشرائح الزجاجية بتعديلها لمدة 1 شهر في ظل هذه الظروف.

3. إعداد هيدروجيل

  1. تصنيع الهلاميات المائية باستخدام طريقة بلمرة الجذور الحرة التي يسببها الأكسدة والاختزال.
    1. قم بتجميع قوالب Polytetrafluoroethylene (PTFE) المكونة من قطعتين بعمق مناسب وفتح نوافذ 10 مم2 لتشكيل الركيزة النهائية. ضع في اعتبارك انكماشا بنسبة 25٪ في ارتفاع الهيدروجيل بعد البلمرة أثناء عملية التصميم. تأكد من أن القوالب مسطحة ومثبتة بإحكام في الألواح السفلية والعلوية لمنع التسرب.
      ملاحظة: أبعاد القالب المصممة أكبر بنسبة 10٪ عن قصد من حجم الهيدروجيل المقصود. يخدم هذا التصميم أغراضا متعددة: فهو يمنع تلف الجوانب عند فصل القالب ، ويعزز تساوي سطح الهيدروجيل عن طريق دفع الشوائب أو الفقاعات إلى الجوانب ، ويعوض الانكماش المتوقع بنسبة 25٪ بعد التوازن بسبب تأثير syneresis ، حيث تقوم الهلاميات المائية المتشابكة للغاية بصد الماء بعد التوازن ، مما يتسبب في الانكماش. يتم تحديد مقدار الانكماش في البروتوكول8.
    2. لضمان أن يكون للهلاميات المائية سطح متساو وارتفاع ثابت ، قم بتعليق الشرائح الزجاجية المعدلة من اللوحة العلوية للقالب ، مما يسمح بفتحة ضيقة لحقن محلول البوليمر. استخدم غطاء زجاجي لتعليق الشرائح الزجاجية المعدلة (الشكل 1 ب).
    3. لإنشاء زجاج الغطاء ، قم بقطع الزجاج المجهري العادي بنسبة 20٪ أكبر من القالب. نعلق اثنين من الفواصل إلى الجانبين أقصر. احسب سمك الفاصل على النحو التالي:
      سمك الفاصل = 1.33 × سمك الجل النهائي + 1 (سمك الزجاج المعدل) - عمق القالب
    4. ضع طبقة رقيقة من شحم مانع للتسرب متوافق مع الخلايا على الجوانب الأطول من زجاج الغطاء ، على نفس الوجه حيث يتم توصيل الفواصل.
    5. قم بتوصيل الشريحة الزجاجية المعدلة بزجاج الغطاء بين الفواصل.
    6. ضع زجاج الغطاء على القالب بحيث تجلس الفواصل على القالب ويمتد الزجاج المعدل إلى القالب. يوفر هذا الإعداد خلوصا يبلغ 1.33 من ارتفاع الهيدروجيل النهائي بين الزجاج المعدل وأسفل القالب.
    7. قم بإذابة GelMA في ماء DI عند 4٪ و 10٪ وزن / وزن لمدة 5 كيلو باسكال و 10 كيلو باسكال ، على التوالي ، وضعه في حمام مائي 45 درجة مئوية.
      ملاحظة: GelMA عبارة عن بوليمر حساس للحرارة والحفاظ على درجة حرارة المحلول عند 45 درجة مئوية يمنع التصلب قبل البلمرة ويقلل من لزوجة المحلول ، وهو أمر بالغ الأهمية لتصنيع الهلاميات المائية المسطحة.
    8. أضف TEMED (24 mM لهيدروجيل 5 kPa ، 6.25 mM ل 10 kPa hydrogel) إلى محلول البوليمر واخلطه جيدا.
      ملاحظة: لا يبدأ TEMED وحده في البلمرة ، لذا تأكد من تحضير القوالب والماصات والمحاليل قبل المتابعة.
    9. أضف APS (24 مللي متر لهيدروجيل 5 كيلو باسكال ، 24.5 مللي متر لهيدروجيل 10 كيلو باسكال) إلى محلول GelMA واخلطه جيدا.
      ملاحظة: إضافة APS يبدأ البلمرة ، وقد تتشكل الهلاميات المائية بسرعة ، مما يتطلب اتخاذ إجراء فوري لمنع الهلاميات المائية المعيبة. يمكن العثور على مزيد من التفاصيل حول قياسات الصلابة في العملالمنشور سابقا 8.
    10. ماصة بعناية الحل الناتج للفتحة بين الشريحة الزجاجية المعلقة والقالب في RT والسماح لها بالتشابك. تدفع القوة الشعرية محلول البوليمر إلى القالب. تجنب إضافة فقاعات إلى المواد الهلامية وتوقف عن السحب عندما تبقى كمية صغيرة من المحلول في طرف الماصة.
      ملاحظة: أثناء البلمرة ، تتفاعل مجموعات الميثاكريلات من GelMA مع بقايا الميثاكريلات على الشرائح الزجاجية المعدلة ، مما يؤدي إلى الارتباط الكيميائي للهيدروجيل بالزجاج.
    11. بعد 15 دقيقة ، يكتمل التفاعل. افصل الركيزة عن القالب باستخدام أداة حادة ، مثل الإبرة ، وحرك الركيزة بعيدا عن زجاج الغطاء لفصلها.
    12. انقل الهلاميات المائية إلى 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) في طبق بتري 100 مم مختوم بغشاء بلاستيكي واتوازن عند 37 درجة مئوية لإزالة المواد المتفاعلة والمنتجات الثانوية المتبقية.
    13. نظرا لأن الهيدروجيل أكبر قليلا من الأبعاد النهائية ، قم بقص أي هلام زائد على الجانبين لمطابقة الأبعاد المطلوبة لنافذة غرفة التدفق.
    14. استخدم غرفة التدفق للتحقق من أبعاد الهيدروجيل. تأكد من أن الهيدروجيل يتناسب بشكل صحيح مع غرفة التدفق دون وجود فجوات بين الهيدروجيل والقالب أو أي عيوب قد تؤثر على أنماط التدفق. إذا كانت هناك مخالفات في الشكل قد تؤثر على نمط التدفق في غرفة التدفق ، مما يؤدي إلى سلوك الخلية الضار ، فاحفظ الهيدروجيل للظروف الثابتة.
    15. نقل أربعة الهلاميات المائية إلى طبق بتري يحتوي على 1x PBS للتعقيم.
  2. تعقيم هيدروجيل كما هو موضح أدناه باستخدام 70 ٪ من الإيثانول.
    1. تحضير 25 ٪ ، 50 ٪ ، و 70 ٪ حلول الكحول للجفاف هيدروجيل التدريجي.
      ملاحظة: إذا لم يتم إجراء الجفاف التدريجي ، فقد تتقلص الهلاميات المائية الأكثر صلابة وتتكسر ، بينما قد تتشكل التجاعيد على سطح الهلاميات المائية الأكثر نعومة.
    2. نضح محلول 1x PBS من طبق بتري الذي يحتوي على الهلاميات المائية. أضف محلول إيثانول بنسبة 25٪ إلى كل طبق بتري لغمر الهلاميات المائية 5 كيلو باسكال و 10 كيلو باسكال لمدة 15 دقيقة.
    3. نضح محلول الكحول 25 ٪. أضف محلول كحول بنسبة 50٪ إلى كل طبق بتري لغمر الهلاميات المائية 5 كيلو باسكال و 10 كيلو باسكال لمدة 15 دقيقة.
    4. نضح محلول الكحول 50 ٪. أضف محلول كحول بنسبة 70٪ إلى كل طبق بتري ، مع غمر الهلاميات المائية 5 كيلو باسكال و 10 كيلو باسكال لمدة 5 دقائق. ضع طبق بتري على شاكر عند 100 دورة في الدقيقة.
    5. اترك الهلاميات المائية 5 كيلو باسكال مغمورة لمدة 40 دقيقة والهلاميات المائية 10 كيلو باسكال لمدة 20 دقيقة.
      ملاحظة: لوحظ أن الهلاميات المائية 5 كيلو باسكال أكثر عرضة للتلوث مقارنة بالهلاميات المائية 10 كيلو باسكال.
    6. انقل العينات إلى صفيحة ذات 6 آبار في خزانة السلامة البيولوجية واغسل الهلاميات المائية 2x-3x باستخدام برنامج تلفزيوني معقم.

4. طلاء الهلاميات المائية

  1. تحضير محلول جيلاتين 60 ميكروغرام / مل عن طريق إذابة 3 ملغ من الجيلاتين في 50 مل من PBS المعقم (1x مع المغنيسيوم وملح الكالسيوم). سخني المحلول في حمام مائي على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة أو حتى يذوب الجيلاتين بالكامل.
  2. مرشح معقم محلول الطلاء باستخدام مرشح حقنة 0.2 ميكرومتر. نضح محلول 1x PBS من كل لوحة بئر وأضف محلول الجيلاتين إلى كل بئر ، مما يضمن تغطية كاملة لكل هيدروجيل. لتقليل مخاطر التلوث ، أضف 40 وحدة / مل من البنسلين و 10 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين إلى محلول الطلاء.
  3. احتضان كل لوحة بئر في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة 45 دقيقة. اغسل الهلاميات المائية بمحلول 1x PBS.
  4. نضح برنامج تلفزيوني وإضافة وسائط زراعة الخلايا.
  5. لمدة لا تزيد عن يومين ، احتفظ بالهلاميات المائية في وسط زراعة الخلايا واحتضانها في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 حتى بذر الخلايا.
    ملاحظة: على الرغم من خصائص ارتباط الخلايا الممتازة للفيبرونيكتين ، إلا أن هناك قلقا بشأن استخدامه بسبب إيداع ECs للفيبرونيكتين الداخلي في حالات تصلب الشرايين ، مما قد يؤدي إلى استجابة التهابية. لتجنب استجابات الخلايا المحفزة كيميائيا ، نمتنع عن استخدام الفبرونيكتين. بالإضافة إلى ذلك ، أظهر Orr et al. أن طلاء الفبرونيكتين ، مقارنة بطلاء الكولاجين I ، ينظم جينات تصلب الشرايين. على وجه التحديد ، لاحظوا زيادة مستويات التعبير لجزيء الالتصاق بين الخلايا 1 (ICAM-1) ، وجزيء التصاق الخلايا الوعائية 1 (VCAM-1) ، والعامل النووي-κB (NF-κB) 14.

5. خلايا البذر على الركائز

  1. قم بإعداد تعليق الخلية باتباع بروتوكولات الانفصال المتاحة وعد الخلايا باستخدام مقياس الدم8.
  2. استنشاق الوسائط تماما من الهلاميات المائية. أضف 50000 خلية / سم 2 لكل عينة. أضف حجما مناسبا من تعليق الخلية إلى كل عينة لمنع تجاوز سعة الخلية.
    ملاحظة: الركائز الأكثر صلابة أكثر كارهة للماء. لذلك ، قلل الوقت بين الخطوات لتحسين قابلية البلل وتشتت تعليق الخلية على سطح الركيزة.
  3. احتضان الهلاميات المائية المصنفة بالخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة ساعتين. أضف وسائط زراعة الخلايا إلى العينات بمجرد ربط الخلايا بالمواد الهلامية.

6. تصنيع غرفة التدفق

ملاحظة: نهج تصميم غرفة التدفق فعال من حيث التكلفة ويتطلب الحد الأدنى من الخبرة للتصنيع والاستخدام.

  1. استخدم بولي (ميثيل ميثاكريلات) لتصنيع الغرفة لتقييم جودة التدفق بصريا ، وسلامة الهيدروجيل تحت ضغط القص ، ودراسات العلامات الحيوية المحتملة في الوقت الفعلي أثناء تجارب التدفق. تم إنشاء تصميم الغرفة باستخدام برنامج التصميم بمساعدة الكمبيوتر (CAD). تم تقديم غرفة التدفق للحصول على براءة اختراع ، ولا يمكن الكشف عن تفاصيل حول هذا الجهاز في البروتوكول الحالي.
  2. التقييم الحسابي لظروف التدفق في غرفة التدفق
    1. قم بتجميع المكونات الفردية لغرفة التدفق المصممة (. SLDPRT) لإنشاء إعداد الغرفة النهائي.
    2. ارسم خطا على طول الخط المركزي للتدفق عرضيا لسطح الهيدروجيل لتحليل إجهاد القص. أغلق فتحات المدخل والمخرج لتحديد حجم التحكم المغلق.
    3. افتح محاكاة التدفق من علامة التبويب الوظائف الإضافية في برنامج CAD. في علامة التبويب محاكاة التدفق ، افتح ميزة المعالج لإدخال الخصائص. حدد نظام الوحدة واضبط الضغط ووحدات الضغط على داين / سم2.
    4. تحقق من تدفق السوائل والجاذبية في الميزات المادية. ضبط الجاذبية على -9.8 في مكون Z ؛ يجب أن تكون مكونات X و Y صفرا.
    5. اختر داخلي لنوع التحليل في المعالجة الهندسية. حدد الماء كسائل افتراضي.
      ملاحظة: افترض أن الوسط يتصرف مثل الماء.
    6. اختر رقائقي ومضطرب لنوع التدفق. حدد الجدار على أنه جدار ثابت الحرارة وخشونة سطح الإدخال في حالة الجدار.
    7. اضبط درجة الحرارة على 37.5 درجة مئوية (310.65 كلفن) في الظروف الأولية. حدد المجال الحسابي في مشاريع محاكاة التدفق، مع التأكد من أنه يغطي حجم التحكم بالكامل.
    8. حدد جميع الجدران التي تتفاعل مع السائل لتحديد المجال الفرعي للسائل. في حالة الحدود، قم بتعيين السطح الداخلي لغطاء المدخل كتدفق حجم المدخل وحدد معدل التدفق (Q) والتدفق المنتظم. بعد ذلك ، قم بتعيين السطح الداخلي لختم غطاء المخرج كضغط ثابت.
    9. تحديد حجم الشبكة العالمية استنادا إلى الموارد الحسابية المتاحة. اضغط على تشغيل لبدء المحاكاة.
    10. عند الانتهاء ، راجع النتائج المرجوة ، بما في ذلك مخططات إجهاد القص ومحاكاة التدفق.
    11. كرر الخطوات من 6.2.8 إلى 6.2.10 بمعدلات تدفق مختلفة لحساب إجهاد القص المطبق بمعدلات مختلفة. استخدم تحليل الانحدار لإنشاء علاقة إجهاد معدل التدفق والقص.
    12. تقييم تحمل النظام للتغيرات في أبعاد الهيدروجيل لتعزيز واقعية المحاكاة.

7. تشغيل تدفق رقائقي موحد

  1. بعد زراعة الخلايا على الهلاميات المائية 5 كيلو باسكال و 10 كيلو باسكال ، تأكد من التقاء الطبقة الأحادية للخلية في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 . يجب تحقيق طبقة أحادية من الخلايا على كل هيدروجيل.
  2. تعقيم المكونات القابلة للتعقيم لنظام غرفة تدفق اللوحة المتوازية (مسامير الفولاذ المقاوم للصدأ ، والملعقة ، والملقط ، والحشية ، وخزان الوسائط) بدورة الأوتوكلاف بالجاذبية لمدة 30 دقيقة. تعقيم الأجزاء الأخرى (مكونات الأكريليك وسدادة / مخمدات الخزان) مع التعرض للأشعة فوق البنفسجية.
  3. قم بتجميع جهاز غرفة التدفق في خزانة السلامة البيولوجية. تأمين عينات هيدروجيل في الجهاز ، وضمان التوحيد. استخدم حشوا متساويا في الحجم مع الهلاميات المائية في حالة توفر عدد غير كاف من العينات للتدفق.
  4. بلل السطح الداخلي للغرفة وأسطح الهيدروجيل مسبقا لتقليل تكوين الفقاعات ومنع جفاف الخلايا أثناء التجميع.
  5. أضف وسائط كافية إلى خزان المدخل ، مما يسمح بتدفق 20٪ -30٪ من الوسائط إلى خزان المخرج عند التجميع. أغلق خزان المدخل بإحكام باستخدام مخمد / مانع تسرب.
    ملاحظة: يؤدي تراكم الضغط في خزان المدخل إلى تدفق التدفق، وأي تسرب للهواء يغير معدلات التدفق. تحقق من وجود عيوب مانعة للتسرب إذا تشكلت فقاعات في الأنبوب الخارجي.
  6. اضبط مخمد المخرج على الضغط الجوي لتحديد فرق الضغط. ضع الجهاز والخزاناتفي حاضنة CO 2 37 درجة مئوية ، 5٪. قم بتوصيل أنبوب الجهاز بمضخة تمعجية موضوعة خارج الحاضنة (الشكل 1C).
  7. قم بتشغيل المضخة لبدء تطبيق 3.6 داين / سم2. قم بزيادة معدل التدفق تدريجيا بمقدار 2 مل / دقيقة (على سبيل المثال ، الوصول إلى 85 مل / دقيقة من 65 مل / دقيقة بعد 10 دقائق) حتى تطبيق حوالي 8 داين / سم2.
  8. زيادة معدل التدفق بمقدار 2.5 مل / دقيقة حتى تصل إلى 12 داين / سم2 من إجهاد القص.
    ملاحظة: اترك وقتا للخلايا للتكيف مع الحالة الديناميكية ، حيث قد تؤدي الزيادات السريعة في معدل التدفق إلى فصل الخلايا وتلف الطبقة الأحادية.
  9. بعد 6 ساعات ، أوقف التدفق ، وأخرج الجهاز من الحاضنة ، وقم بتفكيك غرفة التدفق. بعد ذلك ، نقل عينات هيدروجيل إلى لوحة ستة آبار.
  10. اغسل العينات باستخدام برنامج تلفزيوني بارد وإما أن تصلح الخلايا للتلطيخ المناعي أو تحللها لعزل البروتين.

8. إعداد Immunostaining للفحص المجهري متحد البؤر مع تكبير عالي

ملاحظة: لزيادة كفاءة الدراسة ، تم تطوير طريقة لتلطيخ أجزاء صغيرة من الهلاميات المائية ، مما يتيح فحص أهداف بيولوجية متعددة في عينة واحدة.

  1. تحضير لكمات الخزعة أو أدوات القطع المفضلة بأقطار 3 أو 4 مم.
  2. استخدم صندوق طرف ماصة كغرفة تلطيخ. رطب الحجرة للتحكم في تبخر محلول التلوين أثناء الحضانة الممتدة عن طريق وضع منشفة ورقية مبللة في الجزء السفلي من صندوق طرف الماصة.
  3. تقليل استهلاك الأجسام المضادة عن طريق إنشاء تجمعات حلول صغيرة للعينات الفردية. قم بتغطية رف صندوق الأطراف بغشاء شفاف ، واضغط برفق على الفيلم مقابل فتحات الحامل بطرف الإصبع لعمل الدمامل. املأ الدمامل ب 70 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
  4. انقل هيدروجيل فردي إلى طبق بتري فارغ وقم بقصه باستخدام لكمة خزعة أو أداة قطع مفضلة. استخدم المجهر لقطع مساحة عينة تمثيلية. قطع اسطوانة هلام كاملة لتجنب مشاكل الفحص المجهري متحد البؤر.
  5. ضع عينات الهيدروجيل المقطوعة في الدمامل التي تم إنشاؤها في الخطوة 8.3. أداء تلطيخ اتباع البروتوكولالقياسي 15. بعد غسل التلوين النهائي ، احصل على ورقة مطاط السيليكون التي تتناسب مع سمك الهيدروجيل.
    ملاحظة: يفضل استخدام ورقة ذات جانب لاصق واحد لتحسين الختم. في هذه الدراسة ، تم تلطيخ ألياف الأكتين باستخدام جسم مضاد ثانوي فلوري مترافق مع Phalloidin عند تخفيف 1:20.
  6. قطع ورقة المطاط إلى مربعات 15 مم × 15 مم. قم بثقب ثقب 6 مم باستخدام لكمة الخزعة أو أداة القطع المفضلة.
  7. قم بإنشاء حاوية عينة عن طريق ربط المطاط بغطاء مجهري (رقم 1.5). أضف 10 ميكرولتر من وسائط التركيب الرطبة إلى الدمامل بينما لا تزال العينة موجودة واحتضانها في الظلام لمدة 10-15 دقيقة.
    ملاحظة: بالنسبة لهذه الدراسة ، احتوت وسائط التركيب على 0.9 ميكروغرام / مل من 4 '، 6-دياميدينو -2-فينيليندول (DAPI) لتقصير بروتوكول التلطيخ.
  8. أخرج العينة من حجرة التلوين وضعها في الحاوية التي تم إنشاؤها في الخطوة 8.7. ضع 1-2 ميكرولتر من وسائط التركيب أعلى العينة.
    ملاحظة: تؤثر كمية وسائط التركيب على جودة الصورة عند التكبير العالي. يمكن أن تؤدي وسائط التركيب الزائدة أو غير الكافية إلى الإضرار بوضوح الصورة.
  9. ضع غطاء آخر في الأعلى واضغط برفق للتأكد من ملامسة العينة للزجاج. قم بتخزين العينات في درجة حرارة 4 درجات مئوية في الظلام حتى التصوير المجهري.

النتائج

يوضح الشكل 1 الإعداد التجريبي ، ويحدد عملية تخليق GelMA من خلال تفاعل ميثاكريل. ثم تم استخدام المنتج الناتج لتصنيع ركيزة الهيدروجيل ، التي تم زرع ECs عليها. بعد ذلك ، تم إدخال الخلايا في غرفة التدفق لتجربة تدفق 6 ساعات عند 12 داين / سم2.

1تم استخدام التحلي...

Discussion

نظام الأوعية الدموية هو بيئة ديناميكية حيث تؤثر القوى المختلفة بشكل كبير على السلوك الخلوي. دراسة الأحداث البيولوجية في أمراض القلب والأوعية الدموية دون النظر في هذه القوى ستكون غير دقيقة. وبالتالي ، فإن النماذج الخلوية القادرة على محاكاة البيئة الميكانيكية الوعائية أمر بالغ الأهمية. لق...

Disclosures

يعلن المؤلفون أن طلب براءة اختراع مؤقت (رقم 63/634,853) قد تم تقديمه بعنوان غرفة التدفق مع ركيزة قابلة للضبط ميكانيكيا ، وأنه لا توجد مصالح منافسة أخرى.

Acknowledgements

يعرب المؤلفون عن امتنانهم لروبرت إيغان لمساعدته في تصنيع غرفة التدفق. يشكر المؤلفون لوكاس ماكولي على مساعدته أثناء التجارب. بالإضافة إلى ذلك ، يرغبون في الاعتراف بالمرافق الأساسية لمعهد التصوير الكيميائي للأنظمة الحية (CILS) بجامعة نورث إيسترن لمنح الوصول إلى المجاهر متحدة البؤر. يقر المؤلفون بدعم التمويل المقدم من المعاهد الوطنية للصحة (NIH 1R01EB027705 الممنوحة ل SB) والمؤسسة الوطنية للعلوم (جوائز NSF CAREER: DMR 1847843 إلى SB و CMMI 1846962 إلى EE).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
(trimethoxysilyl)propyl methacrylate, tetramethylethylenediamine (TEMED)Invitrogen15524-010Hydrogel Fabrication
3-(Trimethoxysilyl)Propyl MethacrylateSigma-Aldrich440159Glass Salinization
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)-containing mounting mediaVector LaboratoriesH-1200Immunostaining
AcetoneThermo Fisher ScientificsA18-4GelMA Synthesis
Alexa Fluor 555 Phalloidin Cell Signaling Technology8953SImmunostaining
Ammonium Persulfate (APS)Bio-Rad1610700Hydrogel Fabrication
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet (45/64'')McMaster-CARR8560K165Flow Chamber Fabrication
Confocal MicroscopeCarl Zeiss Meditex AGZeiss LSM 800Immunostaining
Covidien Monoject Rigid Pack 60 mL Syringes without NeedlesFisher  22-031-375Flow Experiment
EC growth kit American Type Culture Collection (ATCC)PCS-100-041Cell Culture
Ethanol 200 ProofDecon Labs2701Glass Salinization
Gelatin Type A (300 bloom) from porcine skinSigma-AldrichG1890GelMA Synthesis
Glacial Acetic AcidThermo Fisher Scientifics9526-33Glass Salinization
High-Purity High-Temperature Silicone Rubber SheetMcMaster-Carr87315K74Flow Chamber Fabrication
Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)American Type Culture Collection (ATCC)PSC-100-010Cell Culture
M3x30mm Machine Screws Hex Socket Round Head Screw 304 Stainless Steel Fasteners Bolts 20pcsUxcellB07Q5RM2TPFlow Chamber Fabrication
Masterflex L/S Digital Drive with Easy-Load® 3 Pump Head for Precision Tubing; 115/230 VACVWR#MFLX77921-65Flow Experiment 
Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Puri-Flex, L/S 25; 25 ftVWR#MFLX96419-25Flow Experiment 
Methacrylic Anhydride (MAH)Sigma-Aldrich276685GelMA Synthesis
ParaformaldehydeThermo Fisher Scientifics043368.9MCell Culture
Phosphate-Buffered Saline (PBS)Gibco14080-055General
Sodium BicarbonateFisher ChemicalS233-3GelMA Synthesis
Sodium CarbonateFisher ChemicalS263-500GelMA Synthesis
SOLIDWORKS educational version
SOLIDWORKS Student Edition Desktop, 2023SolidWorksN/AFlow Chamber Design
Vascular Basal MediumAmerican Type Culture Collection (ATCC)PCS-100-030Cell Culture

References

  1. Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
  2. Suowen, X., et al. Endothelial dysfunction in atherosclerotic cardiovascular diseases and beyond: From mechanism to oharmacotherapies. Pharmacol Rev. 73 (3), 924 (2021).
  3. Jansen, K. A., Atherton, P., Ballestrem, C. Mechanotransduction at the cell-matrix interface. Sem Cel Dev Biol. 71, 75-83 (2017).
  4. Tarbell, J. M., Pahakis, M. Y. Mechanotransduction and the glycocalyx. J Int Med. 259 (4), 339-350 (2006).
  5. Topper, J. N., Cai, J., Falb, D., Gimbrone, M. A. Identification of vascular endothelial genes differentially responsive to fluid mechanical stimuli: cyclooxygenase-2, manganese superoxide dismutase, and endothelial cell nitric oxide synthase are selectively up-regulated by steady laminar shear stress. Proc Natl Acad Sci. 93 (19), 10417-10422 (1996).
  6. Mitchell, G. F., et al. Arterial stiffness and cardiovascular events. Circulation. 121 (4), 505-511 (2010).
  7. Bonetti, P. O., Lerman, L. O., Lerman, A. Endothelial dysfunction. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 23 (2), 168-175 (2003).
  8. Hamrangsekachaee, M., et al. Endothelial glycocalyx sensitivity to chemical and mechanical sub-endothelial substrate properties. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1250348 (2023).
  9. Mensah, S. A., et al. Flow-regulated endothelial glycocalyx determines metastatic cancer cell activity. FASEB J. 34 (5), 6166-6184 (2020).
  10. Russell-Puleri, S., et al. Fluid shear stress induces upregulation of COX-2 and PGI2 release in endothelial cells via a pathway involving PECAM-1, PI3K, FAK, and p38. Am J Physiol-Heart Cir Physiol. 312 (3), H485-H500 (2016).
  11. Hamrangsekachaee, M., Wen, K., Bencherif, S. A., Ebong, E. E. Atherosclerosis and endothelial mechanotransduction: current knowledge and models for future research. Am J Physiol-Cell Physiol. 324 (2), C488-C504 (2022).
  12. Zhu, M., et al. Gelatin methacryloyl and its hydrogels with an exceptional degree of controllability and batch-to-batch consistency. Sci Rep. 9 (1), 6863 (2019).
  13. Kim, J., Bencherif, S. A., Li, W. A., Mooney, D. J. Cell-friendly inverse opal-like hydrogels for a spatially separated co-culture system. Macromol Rapid Comm. 35 (18), 1578-1586 (2014).
  14. Orr, A. W., et al. The subendothelial extracellular matrix modulates NF-kappaB activation by flow: a potential role in atherosclerosis. J Cell Biol. 169 (1), 191-202 (2005).
  15. Hamrangsekachaee, M., Baumann, H. J., Pukale, D. D., Shriver, L. P., Leipzig, N. D. Investigating mechanisms of subcutaneous preconditioning incubation for neural stem cell embedded hydrogels. ACS Appl Bio Mater. 5 (5), 2176-2184 (2022).
  16. Rezaeeyazdi, M., Colombani, T., Memic, A., Bencherif, S. A. Injectable hyaluronic acid-co-gelatin cryogels for tissue-engineering applications. Materials. 11 (8), 1374 (2018).
  17. Belvitch, P., Htwe, Y. M., Brown, M. E., Dudek, S. Cortical actin dynamics in endothelial permeability. Curr Top Membr. 82, 141-195 (2018).
  18. Krishnamoorthy, S., Noorani, B., Xu, C. Effects of encapsulated cells on the physical-mechanical properties and microstructure of gelatin methacrylate hydrogels. Int J Mol Sci. 20 (20), 5061 (2019).
  19. Jin, Q., et al. Bioprinting small-diameter vascular vessel with endothelium and smooth muscle by the approach of two-step crosslinking process. Biotechnol Bioeng. 119 (6), 1673-1684 (2022).
  20. Villard, P., et al. Autoclavable and injectable cryogels for biomedical applications. Adv Healthcare Mater. 8 (17), 1900679 (2019).
  21. Bencherif, S. A., et al. Influence of cross-linker chemistry on release kinetics of PEG-co-PGA hydrogels. J Biomed Mater Res A. 90 (1), 142-153 (2009).
  22. Rogers, Z. J., Zeevi, M. P., Koppes, R., Bencherif, S. A. Electroconductive hydrogels for tissue engineering: Current status and future perspectives. Bioelectricity. 2 (3), 279-292 (2020).
  23. James, B. D., Allen, J. B. Vascular endothelial cell behavior in complex mechanical microenvironments. ACS Biomater Sci Eng. 4 (11), 3818-3842 (2018).
  24. Yeh, Y. T., et al. Matrix stiffness regulates endothelial cell proliferation through septin 9. PLoS One. 7 (10), e4688 (2012).
  25. Fioretta, E. S., Fledderus, J. O., Baaijens, F. P. T., Bouten, C. V. C. Influence of substrate stiffness on circulating progenitor cell fate. J Biomech. 45 (5), 736-744 (2012).
  26. Geemen, D. v., et al. F-Actin-anchored focal adhesions distinguish endothelial phenotypes of human arteries and veins. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (9), 2059-2067 (2014).
  27. Dessalles, C. A., Leclech, C., Castagnino, A., Barakat, A. I. Integration of substrate- and flow-derived stresses in endothelial cell mechanobiology. Comm Biol. 4 (1), 764 (2021).
  28. Estrada, R., Giridharan, G. A., Nguyen, M. D., Prabhu, S. D., Sethu, P. Microfluidic endothelial cell culture model to replicate disturbed flow conditions seen in atherosclerosis susceptible regions. Biomicrofluidics. 5 (3), 32006 (2011).
  29. Inglebert, M., et al. The effect of shear stress reduction on endothelial cells: A microfluidic study of the actin cytoskeleton. Biomicrofluidics. 14 (2), 024115 (2020).
  30. Noria, S., et al. Assembly and reorientation of stress fibers drives morphological changes to endothelial cells exposed to shear stress. Am J Pathol. 164 (4), 1211-1223 (2004).
  31. Amer, M., Shi, L., Wolfenson, H. The 'Yin and Yang' of cancer cell growth and mechanosensing. Cancers (Basel). 13 (19), 4754 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

209

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved