整合基质刚度和流动性的体外模型以研究内皮细胞反应

摘要

我们合成并表征了一种可调节的基于明胶的底物，用于在相关血管流动条件下培养血管内皮细胞 （EC）。这种仿生表面复制了生理和病理条件，从而能够研究机械力对 EC 行为的影响，并促进我们对血管健康和疾病机制的理解。

摘要

我们提出了一种创新的 体外 模型，旨在研究组织刚度和剪切应力对内皮细胞 （EC） 功能的综合影响，这对于了解血管健康和动脉粥样硬化等疾病的发作至关重要。传统上，研究独立探讨了剪切应力和基材刚度对 EC 的影响。然而，这个集成系统结合了这些因素，以提供对脉管系统的机械环境的更精确模拟。目的是使用人类 EC 检查各种组织硬度水平和流动条件下的 EC 机械转导。我们详细介绍了合成具有可调刚度的甲基丙烯酸明胶 （GelMA） 水凝胶并用 EC 接种它们以实现汇合的方案。此外，我们还描述了经济高效的流动室的设计和组装，并辅以计算流体动力学模拟，以生成以层流和适当剪切应力水平为特征的生理流动条件。该方案还结合了用于共聚焦显微镜的荧光标记，能够评估 EC 对组织顺应性和流动条件的反应。通过让培养的 EC 接受多种综合机械刺激，该模型能够全面研究高血压和衰老等因素如何影响 EC 功能和 EC 介导的血管疾病。从这些研究中获得的见解将有助于阐明血管疾病的潜在机制和制定有效的治疗策略。

引言

内皮细胞位于血管内表面，在维持血管健康方面起着关键作用。内皮细胞 （EC） 是调节各种心血管功能的核心，包括血管张力控制、选择性通透性、止血和机械转导 ^1,2。研究已将 EC 功能障碍与动脉粥样硬化发展的主要作用紧密联系起来。值得注意的是，内皮细胞在与血流和底层血管组织相互作用的界面处遇到不同的机械力 ^3,4。几项研究将 EC 功能障碍与血管环境中机械因素的异常变化联系起来，例如血流产生的流体剪切应力和组织僵化 ^5,6,7。

然而，在理解组织硬度和剪切应力对 EC 功能的综合影响方面，先前的研究受到的关注有限。为了提高将研究成果转化为动脉粥样硬化和其他心血管疾病有效治疗的能力，必须改进该领域使用的细胞模型。通过使用人类 EC 并使其承受剪切应力或具有不同刚度水平的基材，在使细胞模型人性化方面取得了重大进展 ^8,9,10。然而，将动态流动环境与具有可调节刚度特性的 EC 基材集成的蜂窝模型的采用和改进进展缓慢。挑战在于设计不溶胀的 EC 底物，以防止流道内流动参数的变化，同时促进完整和粘附良好的 EC 单层的培养。能够克服这些障碍的体外模型可以促进更有效地研究高血压、衰老和血流条件如何协同影响 EC 机械转导、血管健康，并最终影响动脉粥样硬化的发展。已经开发了各种方法，可以在控制基材刚度的同时对细胞施加剪切应力，包括旋转板和微流体装置。在旋转板法中，将单元放置在两个板之间，并通过板的旋转运动施加剪切应力。此方法不太复杂，并且提供了一个快速的模型;然而，它受到空间剪切应力变化的影响，中心剪切应力为零，外围剪切应力最大¹¹。

另一方面，微流体器件代表了新一代工具，能够控制基板刚度和流动条件。这些系统适用于模拟层流条件下的微血管系统。然而，用这种设备研究动脉粥样硬化是不切实际的，因为动脉粥样硬化发生在血流受阻的大血管中¹¹。本文旨在通过提出一种经济高效的系统来为 EC 研究的关键研究领域做出贡献，该系统能够检查不同流动条件下 EC 基材中不同刚度水平的影响。该系统整合了具有不同刚度的基质，以模拟病理和生理血管。该协议概述了创建无膨胀和刚度水平为 5 kPa 和 10 kPa 的明胶基水凝胶的方法，分别代表生理和病理刚度。此外，还详细介绍了能够集成这些基材的平行板流动室的结构。采用计算流体动力学 （CFD） 来评估剪切应力和流动条件。描述了用于 EC 培养的水凝胶的制备和 6 小时流动实验的执行，然后讨论了实验后免疫染色。

研究方案

1. GelMA 的合成

1. 制备 0.2 M 无水碳酸钠溶液和 0.2 M 碳酸氢钠溶液。
2. 将 46 mL 碳酸氢钠溶液与 15 mL 碳酸钠溶液混合，并加入 139 mL 去离子 （DI） 水。如有必要，使用 0.1 M NaOH 和 HCl 将 pH 值调节至 9.5。
3. 将 10 g A 型 300 开花明胶从猪皮中加入到 100 mL 浓度为 10% w/v 的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液中。
4. 使用 55 °C 水浴溶解明胶，同时使用磁力搅拌器以 700 rpm 搅拌溶液。完全溶解后，使用 0.1 M NaOH 将明胶溶液的 pH 值调节至 9.5。
5. 要启动甲基丙烯酸化，请向溶液中滴加 938 μL 甲基丙烯酸酐 （MAH）。通过将 MAH 注射到不同的位置（包括不同的深度和距中心的径向距离）来改善明胶溶液中 MAH 的初始分布。
6. 用铝箔包裹反应容器以防止暴露在光线下。将温度保持在 55 °C，并以 500 rpm 搅拌溶液 1 小时以完成反应（图 1A）¹²。
   注：反应在 pH 值低于 7.4 时停止。
7. 准备一个装有 1.8 L 丙酮的 2 L 烧杯和一个装有 0.3 L 丙酮的 0.6 L 烧杯。
8. 将所得 GelMA 溶液滴加到 2 L 烧杯中，同时以 200 RPM 搅拌以诱导沉淀¹³。为了最大限度地收集沉淀产物，将不锈钢棒或刮刀作为成核部位，以便于转移。
9. 将产品从较大的烧杯转移到较小的烧杯中，静置 10 分钟，然后进行干燥步骤。沉淀的 GelMA 应显示为白色纤维。
10. 将产品收集在吸水纸上，在室温 （RT） 的真空烘箱中干燥，并储存在 -20 °C 直至进一步使用。
    注：有关通过质子核磁共振 （¹H NMR） 对产品进行化学表征的更多详细信息，请参阅先前发表的工作⁸。

2. 玻璃盐化

注：将水凝胶连接到载玻片上可提供平坦均匀的表面，便于处理并确保在流动衍生剪切应力下的稳定性。用 3-（三甲氧基甲硅烷基）甲基丙烯酸丙酯对玻璃进行功能化对于增强表面性能并在聚合过程中实现水凝胶的共价连接是必要的。

1. 使用玻璃切割机将普通显微镜载玻片（1 mm 厚）精确切割成与最终水凝胶尺寸相似的碎片。用肥皂清洗切割好的载玻片，以去除可能阻碍玻璃表面处理的表面污染物和碎屑。
   注：如有必要，在乙醇中对载玻片超声处理 5 分钟，然后风干。
2. 在无水乙醇中制备 0.5% 的 3-（三甲氧基甲硅烷基）甲基丙烯酸丙酯溶液。在 DI 水中制备 10% 冰醋酸溶液。混合溶液以达到 3% 冰醋酸的最终浓度。
   注意：冰醋酸溶液可以大量制备并储存。
3. 将载玻片整理在玻璃容器中，以确保玻璃表面不受阻碍。将所得溶液倒在载玻片上，并在摇杆上以 80 rpm 的速度保持约 5 分钟以完成反应。通过去除任何残留的气泡，确保对载玻片的两侧进行改性。
4. 反应完成后，吸出溶液并用乙醇洗涤载玻片 2 次。风干载玻片并在室温下避光储存。
   注意：在这些条件下，载玻片将其修饰保留 1 个月。

3. 水凝胶制备

1. 使用氧化还原诱导的自由基聚合法制备水凝胶。
   1. 组装具有适当深度和 10 mm² 开口窗口的两件式聚四氟乙烯 （PTFE） 模具，以塑造最终基材。在设计过程中，水凝胶在聚合后的高度收缩了 25%。确保模具平整，并紧固在底板和顶板上，以防止泄漏。
      注意：设计的模具尺寸故意比预期的水凝胶尺寸大 10%。这种设计有多种用途：它可以防止模具分离时损坏侧面，通过将杂质或气泡推到侧面来提高水凝胶的表面均匀度，并补偿由于脱水收缩效应而导致的平衡后预期的 25% 收缩，其中高度交联的水凝胶在平衡后排斥水，导致收缩。收缩量在协议⁸ 中指定。
   2. 为确保水凝胶具有均匀的表面和恒定的高度，将改性的载玻片悬挂在模具的顶板上，留出一个狭窄的开口用于注射聚合物溶液。使用盖玻片悬浮改性的载玻片（图 1B）。
   3. 要制作盖板玻璃，请切割比模具大 20% 的普通微观玻璃。将两个垫片连接到较短的一侧。按如下方式计算垫片厚度：
      垫片厚度 = 1.33 x 最终凝胶厚度 + 1（改性玻璃的厚度）- 模具深度
   4. 在盖玻片的较长侧面上涂上一层薄薄的与电池兼容的密封脂，位于垫片连接的同一面上。
   5. 将改性的载玻片连接到两个垫片之间的盖玻片上。
   6. 将盖玻片放在模具上，使垫片位于模具上，并且改性后的玻璃延伸到模具中。这种设置在改性玻璃和模具底部之间提供了最终水凝胶高度的 1.33 个间隙。
   7. 将 GelMA 分别溶解在 4% 和 10% w/v 的去离子水中，用于 5 kPa 和 10 kPa 水凝胶，并将其置于 45 °C 水浴中。
      注：GelMA 是一种热敏聚合物，将溶液温度保持在 45 °C 可防止聚合前凝固并降低溶液粘度，这对于制造扁平水凝胶至关重要。
   8. 将 TEMED（5 kPA 水凝胶为 24 mM，10 kPa 水凝胶为 6.25 mM）添加到聚合物溶液中并充分混合。
      注意：单独的 TEMED 不会引发聚合，因此请确保在继续之前准备好模具、移液器和溶液。
   9. 将 APS（5 kPA 水凝胶为 24 mM，10 kPa 水凝胶为 24.5 mM）添加到 GelMA 溶液中并充分混合。
      注意：添加 APS 会引发聚合，水凝胶可能会迅速形成，需要立即采取行动以防止水凝胶有缺陷。有关刚度测量的更多详细信息，请参阅以前发表的著作⁸。
   10. 在 RT 上小心地将所得溶液移液到悬浮的载玻片和模具之间的开口处，并使其交联。毛细管力将聚合物溶液驱动到模具中。避免在凝胶中添加气泡，并在移液器吸头中残留少量溶液时停止移液。
       注：在聚合过程中，GelMA 的甲基丙烯酸酯基团与改性载玻片上的甲基丙烯酸酯残基反应，导致水凝胶化学附着在玻璃上。
   11. 15 分钟后，反应完成。使用针等尖锐物体将基板从模具上拆下，然后将基板从盖玻片上滑开以将其分离。
   12. 将水凝胶转移到用塑料薄膜密封的 100 mm 培养皿中的 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中，并在 37 °C 下平衡以去除剩余的反应物和副产物。
   13. 由于水凝胶略大于最终尺寸，因此修剪侧面多余的凝胶以匹配流动室窗口所需的尺寸。
   14. 使用流动室验证水凝胶尺寸。确保水凝胶正确安装在流动室中，水凝胶和模具之间没有间隙，也没有任何可能影响流型的缺陷。如果存在可能影响流动室中流型的形状不规则性，从而导致不良的细胞行为，请保存水凝胶以用于静态条件。
   15. 将四颗水凝胶转移到含有 1x PBS 的培养皿中进行灭菌。
2. 如下所述使用 70% 乙醇对水凝胶进行消毒。
   1. 准备 25%、50% 和 70% 的酒精溶液，用于水凝胶逐渐脱水。
      注意：如果不进行逐渐脱水，较硬的水凝胶可能会收缩和破裂，而较软的水凝胶表面可能会形成皱纹。
   2. 从含有水凝胶的培养皿中吸出 1x PBS 溶液。向每个培养皿中加入 25% 乙醇溶液，将 5 kPa 和 10 kPa 水凝胶浸没 15 分钟。
   3. 吸出 25% 酒精溶液。向每个培养皿中加入 50% 酒精溶液，将 5 kPa 和 10 kPa 水凝胶浸入水中 15 分钟。
   4. 吸出 50% 酒精溶液。向每个培养皿中加入 70% 酒精溶液，将 5 kPa 和 10 kPa 水凝胶浸入水中 5 分钟。将培养皿以 100 rpm 的速度放在摇床上。
   5. 将 5 kPa 水凝胶浸没 40 分钟，将 10 kPa 水凝胶浸没 20 分钟。
      注：观察到 5 kPa 水凝胶比 10 kPa 水凝胶更容易受到污染。
   6. 将样品转移到生物安全柜中的 6 孔板中，并使用无菌 PBS 洗涤水凝胶 2 次-3 次。

4. 涂覆水凝胶

1. 通过将 3 mg 明胶溶解在 50 mL 无菌 PBS（1x 镁和钙盐）中来制备 60 μg/mL 明胶溶液。在 37 °C 的水浴中加热溶液 30 分钟或直到所有明胶完全溶解。
2. 使用 0.2 μm 注射器过滤器对涂层溶液进行无菌过滤。从每个孔板中吸出 1x PBS 溶液，并向每个孔中加入明胶溶液，确保完全覆盖每个水凝胶。为了最大限度地降低污染风险，向包被溶液中加入 40 单位/mL 的青霉素和 10 μg/mL 的链霉素。
3. 将每个孔板在 37 °C、5% CO₂ 培养箱中孵育 45 分钟。用 1x PBS 溶液洗涤水凝胶。
4. 吸出 PBS 并添加细胞培养基。
5. 将水凝胶保存在细胞培养基中不超过两天，并在 37 °C、5% CO₂ 培养箱中孵育直至细胞接种。
   注意：尽管纤连蛋白具有出色的细胞附着特性，但由于 EC 在动脉粥样硬化条件下沉积内源性纤连蛋白，这可能导致促炎反应，因此对其使用存在担忧。为避免化学刺激的细胞反应，我们避免使用纤连蛋白。此外，Orr 等人证明，与胶原蛋白 I 涂层相比，纤连蛋白涂层上调了动脉粥样硬化基因。具体来说，他们观察到细胞间粘附分子 1 （ICAM-1） 、血管细胞粘附分子 1 （VCAM-1） 和核因子-κB （NF-κB） 的表达水平增加¹⁴。

5. 在底物上接种细胞

1. 按照可用的分离方案制备细胞悬液，并使用血细胞计数器⁸ 对细胞进行计数。
2. 从水凝胶中彻底吸出培养基。向每个样品中加入 50,000 个细胞/cm2。向每个样品中加入适当体积的细胞悬液，以防止细胞溢出。
   注意：较硬的基材更疏水性;因此，最大限度地减少步骤之间的时间，以提高基底表面的润湿性和细胞悬浮液分散。
3. 将细胞接种的水凝胶在 37 °C、5% CO₂ 培养箱中孵育 2 小时。一旦细胞附着到凝胶上，就向样品中添加细胞培养基。

6. 流动室制造

注意：设计流通室的方法具有成本效益，并且需要最少的制造和使用专业知识。

1. 使用聚甲基丙烯酸甲酯进行腔室制造，以直观地评估流动质量、剪切应力下的水凝胶完整性，以及流动实验期间潜在的实时生物标志物研究。腔室设计是使用计算机辅助设计 （CAD） 软件创建的。流动室已申请专利，有关该装置的详细信息不能在本方案中披露。
2. 流动室中流动条件的计算评估
   1. 组装设计的流通室的各个组件 （.SLDPRT 文件）创建最终的 Chamber 设置。
   2. 沿与水凝胶表面相切的流动中心线画一条线，以分析剪切应力。关闭入口和出口开口以定义闭合的控制体积。
   3. 从 CAD 软件的 Add-Ins 选项卡中打开 Flow Simulation。在 Flow Simulation 选项卡中，打开 Wizard 功能以输入属性。指定单位制并将压力和应力单位调整为 dyne/cm²。
   4. 检查 Physical 特征中的 Fluid Flow 和 Gravity 。在 Z 分量中将重力设置为 -9.8;X 和 Y 分量应为零。
   5. 在 Geometry Handling 中为分析类型选择 Internal 。选择 Water （水 ） 作为默认流体。
      注意：假设介质的行为与水类似。
   6. 选择 Laminar （层流） 和 Turbulent （湍流 ） 作为流类型。将壁定义为绝热壁，并在 Wall Condition 中输入表面粗糙度。
   7. 在初始条件下，将温度设置为 37.5 °C （310.65 K）。在 Flow Simulation 项目中定义计算域，确保它涵盖整个控制体积。
   8. 选择与流体接口的所有壁以定义流体子域。在边界条件中，将入口盖的内表面指定为入口体积流量，并指定流速 （Q） 和均匀流量。然后，将出口盖密封的内表面指定为静压。
   9. 根据可用的计算资源确定 Global Mesh Size。点击 Run 启动模拟。
   10. 完成后，查看所需的结果，包括剪切应力图解和流动模拟。
   11. 以不同的流速重复步骤 6.2.8 到 6.2.10，以计算不同速率下施加的剪应力。使用回归分析建立流速-剪切应力关系。
   12. 评估系统对水凝胶尺寸变化的容忍度，以增强模拟的真实感。

7. 运行均匀的层流

1. 在 5 kPa 和 10 kPa 水凝胶上培养细胞后，确保细胞单层在 37 °C、5% CO₂ 培养箱中汇合。应在每个水凝胶上实现单层细胞。
2. 用 30 分钟的重力高压灭菌器循环对平行板流通室系统的可高压灭菌组件（不锈钢螺钉、抹刀、镊子、垫圈和培养基储液器）进行消毒。用紫外线照射对其他部件（丙烯酸组件和储液罐密封剂/阻尼器）进行消毒。
3. 将流通室装置组装在生物安全柜中。将水凝胶样品固定在设备中，确保均匀性。如果可用于流动的样品数量不足，请使用与水凝胶相同大小的填料。
4. 预润湿腔室内表面和水凝胶表面，以最大限度地减少气泡形成并防止组装过程中细胞干燥。
5. 向入口储液槽中添加足够的介质，使 20%-30% 的介质在组装时流向出口储液槽。使用阻尼器/密封器密封入口储液罐。
   注意：入口储液罐中的压力积聚会驱动流量，任何空气泄漏都会改变流速。如果外管中形成气泡，请检查密封剂是否有缺陷。
6. 将出口风门设置为大气压，以建立压差。将设备和储液槽置于 37 °C、5% CO₂ 培养箱中。将设备管连接到放置在培养箱外部的蠕动泵（图 1C）。
7. 打开泵开始施加 3.6 dyne/cm²。以 2 mL/min 的增量逐渐增加流速（例如，10 分钟后从 65 mL/min 增加到 85 mL/min），直到施加大约 8 dyne/cm²。
8. 以 2.5 mL/min 的增量进一步增加流速，直到达到 12 dyne/cm² 的剪切应力。
   注：让细胞有时间适应动态条件，因为快速增加的流速可能会使细胞分离并损坏单层。
9. 6 小时后，停止流动，从培养箱中取出设备，然后拆卸流动室。随后，将水凝胶样品转移到六孔板中。
10. 用冰冷的 PBS 洗涤样品，固定细胞进行免疫染色或裂解细胞进行蛋白质分离。

8. 用于高放大倍率共聚焦显微镜的免疫染色设置

注：为了提高研究效率，开发了一种对小部分水凝胶进行免疫染色的方法，能够检查单个样品中的多个生物靶标。

1. 准备直径为 3 或 4 mm 的活检打孔器或首选切割工具。
2. 使用移液器吸头盒作为染色室。在移液器吸头盒底部放置湿纸巾，加湿腔室以控制长时间孵育期间染色液的蒸发。
3. 通过为单个样品创建小型溶液池来减少抗体消耗。用透明薄膜盖住吸头盒盒架，用指尖轻轻将薄膜压在吸头盒孔上，以形成凹痕。用 70 μL 的 PBS 填充酒窝。
4. 将单个水凝胶转移到空培养皿中，并使用活检打孔器或首选切割工具进行切割。使用显微镜切割具有代表性的样品区域。切下完整的凝胶圆柱体以避免共聚焦显微镜问题。
5. 将切割的水凝胶样品放入步骤 8.3 中创建的凹坑中。按照标准方案¹⁵ 进行染色。最后一次染色洗涤后，获得与水凝胶厚度相匹配的硅橡胶片。
   注意：最好使用具有一个粘性面的板材，以改善密封性。在这项研究中，使用与 Phalloidin 偶联的荧光二抗以 1：20 的稀释度对肌动蛋白纤维进行染色。
6. 将橡胶板切成 15 毫米 x 15 毫米的正方形。使用活检打孔器或首选切割工具打一个 6 mm 的孔。
7. 通过将橡胶连接到显微镜盖玻片（编号 1.5）上来创建样品容器。在样品仍然存在的情况下，向凹坑中加入 10 μL 湿封固剂，并在黑暗中孵育 10-15 分钟。
   注：在本研究中，封固剂含有 0.9 μg/mL 的 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚 （DAPI），以缩短染色方案。
8. 从染色室中取出样品，并将其放入步骤 8.7 中创建的容器中。在样品顶部涂抹 1-2 μL 封固剂。
   注意：封固介质的数量会影响高放大倍率下的图像质量。过多或不足的封固剂会影响图像清晰度。
9. 将另一个盖玻片放在顶部并轻轻按压以确保样品接触玻璃。将样品在 4 °C 下避光储存，直到显微镜成像。

结果

图 1 描述了实验装置，概述了通过甲基丙烯酸化反应合成 GelMA 的过程。然后使用所得产品制造水凝胶底物，将 EC 接种到该底物上。随后，将细胞引入流动室中，以 12 dyne/cm² 进行 6 h 的流动实验。

¹H NMR 波谱用于评估甲基丙烯酸化反应的成功（图 2A）。GelMA 中存在 1.9 ppm 的甲基和 5.4-5.6 ppm 之间的乙烯基?...

讨论

血管系统是一个动态环境，其中各种力会显着影响细胞行为。在不考虑这些力的情况下研究心血管疾病中的生物事件是不准确的。因此，能够模拟血管机械环境的细胞模型至关重要。研究人员在强调这些力量对细胞行为的影响方面已经取得了重大进展¹¹。然而，要了解人体病理和生理条件下的细胞行为，必须开发更接近血管环境的更精确模型。因此，我们的目标是开发一种系统?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
(trimethoxysilyl)propyl methacrylate, tetramethylethylenediamine (TEMED)	Invitrogen	15524-010	Hydrogel Fabrication
3-(Trimethoxysilyl)Propyl Methacrylate	Sigma-Aldrich	440159	Glass Salinization
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)-containing mounting media	Vector Laboratories	H-1200	Immunostaining
Acetone	Thermo Fisher Scientifics	A18-4	GelMA Synthesis
Alexa Fluor 555 Phalloidin	Cell Signaling Technology	8953S	Immunostaining
Ammonium Persulfate (APS)	Bio-Rad	1610700	Hydrogel Fabrication
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet (45/64'')	McMaster-CARR	8560K165	Flow Chamber Fabrication
Confocal Microscope	Carl Zeiss Meditex AG	Zeiss LSM 800	Immunostaining
Covidien Monoject Rigid Pack 60 mL Syringes without Needles	Fisher	22-031-375	Flow Experiment
EC growth kit	American Type Culture Collection (ATCC)	PCS-100-041	Cell Culture
Ethanol 200 Proof	Decon Labs	2701	Glass Salinization
Gelatin Type A (300 bloom) from porcine skin	Sigma-Aldrich	G1890	GelMA Synthesis
Glacial Acetic Acid	Thermo Fisher Scientifics	9526-33	Glass Salinization
High-Purity High-Temperature Silicone Rubber Sheet	McMaster-Carr	87315K74	Flow Chamber Fabrication
Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)	American Type Culture Collection (ATCC)	PSC-100-010	Cell Culture
M3x30mm Machine Screws Hex Socket Round Head Screw 304 Stainless Steel Fasteners Bolts 20pcs	Uxcell	B07Q5RM2TP	Flow Chamber Fabrication
Masterflex L/S Digital Drive with Easy-Load® 3 Pump Head for Precision Tubing; 115/230 VAC	VWR	#MFLX77921-65	Flow Experiment
Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Puri-Flex, L/S 25; 25 ft	VWR	#MFLX96419-25	Flow Experiment
Methacrylic Anhydride (MAH)	Sigma-Aldrich	276685	GelMA Synthesis
Paraformaldehyde	Thermo Fisher Scientifics	043368.9M	Cell Culture
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Gibco	14080-055	General
Sodium Bicarbonate	Fisher Chemical	S233-3	GelMA Synthesis
Sodium Carbonate	Fisher Chemical	S263-500	GelMA Synthesis
SOLIDWORKS educational version
SOLIDWORKS Student Edition Desktop, 2023	SolidWorks	N/A	Flow Chamber Design
Vascular Basal Medium	American Type Culture Collection (ATCC)	PCS-100-030	Cell Culture