Модель in vitro, интегрирующая жесткость и текучесть субстрата для изучения реакций эндотелиальных клеток

Резюме

Мы синтезировали и охарактеризовали перестраиваемый субстрат на основе желатина для культивирования сосудистых эндотелиальных клеток (ЭК) в соответствующих условиях сосудистого кровотока. Эта биомиметическая поверхность воспроизводит как физиологические, так и патологические состояния, что позволяет изучать механические силы, влияющие на поведение ЭК, и углублять наше понимание здоровья сосудов и механизмов заболеваний.

Аннотация

Мы представляем инновационную модель in vitro , направленную на изучение комбинированного влияния ригидности тканей и напряжения сдвига на функцию эндотелиальных клеток (ЭК), которые имеют решающее значение для понимания здоровья сосудов и возникновения таких заболеваний, как атеросклероз. Традиционно в исследованиях изучалось влияние напряжения сдвига и жесткости основания на EC независимо друг от друга. Тем не менее, эта интегрированная система сочетает в себе эти факторы для обеспечения более точного моделирования механической среды сосудистой системы. Цель состоит в том, чтобы изучить механотрансдукцию ЭК при различных уровнях жесткости тканей и условиях течения с использованием ЭК человека. Мы подробно описываем протокол синтеза гидрогелей метакрилата желатина (GelMA) с настраиваемой жесткостью и их засеивания EC для достижения конфлюенции. Кроме того, мы описываем конструкцию и сборку экономичной проточной камеры, дополненную вычислительным моделированием гидродинамики, для создания физиологических условий потока, характеризующихся ламинарным потоком и соответствующими уровнями напряжения сдвига. Протокол также включает флуоресцентное мечение для конфокальной микроскопии, что позволяет оценить реакцию ЭК как на податливость тканей, так и на условия потока. Подвергая культивируемые ЭК воздействию нескольких интегрированных механических стимулов, эта модель позволяет всесторонне исследовать, как такие факторы, как гипертония и старение, могут влиять на функцию ЭК и ЭК-опосредованные сосудистые заболевания. Выводы, полученные в результате этих исследований, будут иметь важное значение для выяснения механизмов, лежащих в основе сосудистых заболеваний, и для разработки эффективных стратегий лечения.

Введение

Эндотелий, выстилающий внутреннюю поверхность кровеносных сосудов, играет ключевую роль в поддержании здоровья сосудов. Эндотелиальные клетки (ЭК) играют центральную роль в регуляции различных сердечно-сосудистых функций, включая контроль тонуса сосудов, селективную проницаемость, гемостаз и механотрансдукцию ^1,2. Исследования прочно связали дисфункцию ЭК с основной ролью в развитии атеросклероза. Примечательно, что ЭК сталкиваются с различными механическими силами на границах, где они взаимодействуют с кровотоком и тканями подлежащих сосудов ^3,4. В нескольких исследованиях дисфункция ЭК связана с аномальными изменениями механических факторов в сосудистой среде, таких как напряжение сдвига жидкости от кровотока и ригидность тканей ^5,6,7.

Тем не менее, предыдущим исследованиям уделялось ограниченное внимание в понимании комбинированного влияния жесткости тканей и напряжения сдвига на функцию EC. Чтобы повысить способность преобразовывать результаты исследований в эффективные методы лечения атеросклероза и других сердечно-сосудистых заболеваний, необходимо совершенствовать клеточные модели, используемые в полевых условиях. Значительный прогресс был достигнут в гуманизации клеточных моделей за счет использования человеческих ЭК и их воздействия либо на напряжение сдвига, либо на подложки с различными уровнями жесткости ^8,9,10. Тем не менее, принятие и совершенствование ячеистых моделей, которые интегрируют динамические среды течения с EC-подложками, обладающими регулируемыми свойствами жесткости, продвигается медленно. Сложность заключается в разработке ненабухающих EC-субстратов, чтобы предотвратить изменения параметров потока в проточном канале, а также облегчить выращивание неповрежденных и хорошо адгезивных монослоев. Модель in vitro, способная преодолеть эти препятствия, может способствовать более эффективным исследованиям того, как гипертония, старение и условия кровотока совместно влияют на механотрансдукцию ЭК, здоровье сосудов и, в конечном счете, на развитие атеросклероза. Были разработаны различные методы приложения напряжения сдвига к клеткам при контроле жесткости подложки, включая вращающиеся пластины и микрофлюидные устройства. При методе вращающихся пластин ячейки размещаются между двумя пластинами, а напряжение сдвига прикладывается за счет вращательного движения пластин. Этот метод менее сложен и обеспечивает быстрое моделирование; Тем не менее, он страдает от пространственного изменения напряжения сдвига, с нулевым напряжением сдвига в центре и максимальным напряжением сдвига на периферии¹¹.

С другой стороны, микрофлюидные устройства представляют собой новое поколение инструментов с возможностью контроля жесткости подложки и условий текучести. Эти системы подходят для имитации микроциркуляторного русла в условиях ламинарного потока. Однако изучать атеросклероз с помощью таких аппаратов нецелесообразно, так как атеросклероз возникает в крупных сосудах с нарушенным^{кровотоком 11}. Цель данной статьи – внести свой вклад в важнейшую область исследований EC путем представления экономически эффективной системы, способной изучать влияние различных уровней жесткости в EC-подложках при различных условиях текучести. Система объединяет субстраты с различной жесткостью для имитации патологических и физиологических кровеносных сосудов. В этом протоколе описан метод создания гидрогелей на основе желатина без уровней набухания и жесткости 5 кПа и 10 кПа, представляющих физиологическую и патологическую жесткость соответственно. Кроме того, подробно описана конструкция проточной камеры с параллельными пластинами, способной интегрировать эти подложки. Вычислительная гидродинамика (CFD) была использована для оценки напряжения сдвига и условий течения. Описывается приготовление гидрогелей для культивирования EC и проведение эксперимента с проточным потоком в течение 6 часов, после чего обсуждается вопрос об иммуноокрашивании после эксперимента.

протокол

1. Синтез GelMA

1. Приготовьте 0,2 М раствор безводного карбоната натрия и 0,2 М раствор гидрокарбоната натрия.
2. Смешайте 46 мл раствора бикарбоната натрия с 15 мл раствора карбоната натрия и добавьте 139 мл деионизированной (DI) воды. При необходимости отрегулируйте pH до 9,5, используя 0,1 М NaOH и HCl.
3. Добавьте 10 г желатина типа А, 300-цветкового из свиной кожи в 100 мл карбонатно-бикарбонатного буфера в концентрации 10% по массе.
4. Растворите желатин на водяной бане при температуре 55 °C, перемешивая раствор со скоростью 700 об/мин с помощью магнитной мешалки. После полного растворения отрегулируйте pH желатинового раствора до 9,5, используя 0,1 М NaOH.
5. Чтобы начать метакрилацию, добавьте в раствор по каплям 938 мкл метакрилового ангидрида (МАГ). Улучшите начальное распределение MAH в желатиновом растворе, вводя его в различных местах, включая разную глубину и радиальные расстояния от центра.
6. Оберните реакционный сосуд алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить воздействие света. Поддерживайте температуру на уровне 55 °C и перемешивайте раствор со скоростью 500 об/мин в течение 1 часа, чтобы завершить реакцию (Рисунок 1A)¹².
   ПРИМЕЧАНИЕ: Реакция прекращается при pH ниже 7,4.
7. Подготовьте один стакан объемом 2 л, содержащий 1,8 л ацетона, и один стакан объемом 0,6 л, содержащий 0,3 л ацетона.
8. Добавьте полученный раствор GelMA по каплям в стакан объемом 2 л, помешивая при 200 об/мин, чтобы вызвать выпадение осадка¹³. Чтобы максимально увеличить сбор осажденного продукта, поместите стержень или шпатель из нержавеющей стали в качестве места зарождения для более легкого переноса.
9. Переложите продукт из большого стакана в меньший и дайте ему постоять 10 минут, прежде чем приступить к этапу сушки. Осажденный GelMA должен выглядеть в виде белых волокон.
10. Соберите изделие на впитывающую бумагу, высушите в вакуумной печи при комнатной температуре (RT), и храните при температуре -20 °C до дальнейшего использования.
    Примечание: Дополнительные сведения о химической характеристике продукта с помощью протонного ядерного магнитного резонанса (¹Н ЯМР) можно найти в ранее опубликованной работе⁸.

2. Засоление стекла

ПРИМЕЧАНИЕ: Прикрепление гидрогелей к стеклянным предметным стеклам обеспечивает плоскую и ровную поверхность, облегчая обращение и обеспечивая устойчивость при напряжении сдвига, вызванном потоком. Функционализация стекла 3-(триметоксисилил)пропилметакрилатом необходима для улучшения поверхностных свойств и обеспечения ковалентного присоединения гидрогелей в процессе полимеризации.

1. С помощью стеклореза вы точно вырежьте предметные стекла обычного микроскопа (толщиной 1 мм) на части, аналогичные конечным размерам гидрогеля. Промойте порез предметного стекла с мылом, чтобы удалить поверхностные загрязнения и мусор, которые могут препятствовать обработке стеклянной поверхности.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости обработайте стекла ультразвуком в течение 5 минут в этаноле, затем высушите на воздухе.
2. Приготовьте 0,5% раствор 3-(триметоксисилил)пропилметакрилата в абсолютном этаноле. Приготовьте 10% раствор ледяной уксусной кислоты в деионизированной воде. Смешайте растворы до достижения конечной концентрации 3% ледяной уксусной кислоты.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор ледяной уксусной кислоты можно готовить в больших количествах и хранить.
3. Организуйте стеклянные предметные стекла в стеклянном контейнере, чтобы стеклянные поверхности не загораживались. Вылейте полученный раствор на предметные стекла и подержите их примерно 5 минут на коромысле при 80 оборотах в минуту, чтобы реакция завершилась. Убедитесь, что обе стороны стеклянных стекол модифицированы, удалив все захваченные пузырьки воздуха.
4. После завершения реакции отсадите раствор и промойте стекла этанолом в 2 раза. Высушите предметные стекла на воздухе и храните их в темноте при RT.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При таких условиях стеклянные стекла сохраняют свою модификацию в течение 1 месяца.

3. Приготовление гидрогеля

1. Изготовьте гидрогели с использованием метода окислительно-восстановительной полимеризации, вызванной свободными радикалами.
   1. Соберите двухкомпонентные формы из политетрафторэтилена (ПТФЭ) с подходящей глубиной и открывающимися окнами 10^мм2 для придания формы окончательной подложке. Учитывайте 25% усадку высоты гидрогеля после полимеризации в процессе проектирования. Убедитесь, что формы плоские и плотно закреплены на нижней и верхней пластинах, чтобы предотвратить утечку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Расчетные размеры пресс-формы намеренно на 10% больше предполагаемого размера гидрогеля. Эта конструкция служит нескольким целям: она предотвращает повреждение боковых сторон при разделении формы, повышает ровность поверхности гидрогеля, выталкивая примеси или пузырьки в стороны, и компенсирует ожидаемую 25% усадку после уравновешивания из-за эффекта синерезиса, когда сильно сшитые гидрогели отталкивают воду после уравновешивания, вызывая усадку. Размер усадки указан в протоколе⁸.
   2. Чтобы гидрогели имели ровную поверхность и постоянную высоту, подвесьте модифицированные стеклянные стекла к верхней пластине формы, обеспечивая узкое отверстие для впрыска полимерного раствора. Используйте покровное стекло для подвешивания предметных стекол с модифицированным стеклом (Рисунок 1B).
   3. Чтобы создать покровное стекло, разрежьте обычное микроскопическое стекло на 20% больше формы. Прикрепите две проставки к более коротким сторонам. Рассчитайте толщину дистанционной рамки следующим образом:
      Толщина распорки = 1,33 х конечная толщина геля + 1 (толщина модифицированного стекла) - глубина формы
   4. Нанесите тонкий слой герметизирующей смазки, совместимой с ячейками, на более длинные стороны покровного стекла, на той же поверхности, где прикреплены распорки.
   5. Прикрепите предметное стекло модифицированного стекла к покровному стеклу между двумя распорками.
   6. Поместите покровное стекло на форму так, чтобы распорки сидели на форме, а модифицированное стекло выдвигалось внутрь формы. Эта установка обеспечивает зазор в 1,33 от конечной высоты гидрогеля между модифицированным стеклом и дном формы.
   7. Растворите GelMA в деионизионной воде при концентрации 4% и 10% по массе для гидрогелей с концентрацией 5 кПа и 10 кПа соответственно и поместите его на водяную баню при температуре 45 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: GelMA является термочувствительным полимером, и поддержание температуры раствора на уровне 45 °C предотвращает затвердевание перед полимеризацией и снижает вязкость раствора, что имеет решающее значение для изготовления плоских гидрогелей.
   8. Добавьте в раствор полимера ТЕМЕД (24 мМ для гидрогеля 5 кПа, 6,25 мМ для гидрогеля 10 кПа) и тщательно перемешайте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: TEMED сам по себе не инициирует полимеризацию, поэтому перед тем, как продолжить, убедитесь, что формы, пипетки и растворы подготовлены.
   9. Добавьте APS (24 мМ для гидрогеля 5 кПа, 24,5 мМ для гидрогеля 10 кПа) в раствор GelMA и тщательно перемешайте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление APS инициирует полимеризацию, и гидрогели могут образовываться быстро, что требует быстрых действий для предотвращения дефектных гидрогелей. Более подробную информацию об измерениях жесткости можно найти в ранее опубликованной работе⁸.
   10. Тщательно пипеткой нанесите полученный раствор в отверстие между подвешенным стеклостеком и формой в точке RT и дайте ему сшить. Капиллярная сила загоняет полимерный раствор в форму. Избегайте добавления пузырьков в гели и прекратите пипетирование, когда в наконечнике пипетки остается небольшое количество раствора.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Во время полимеризации метакрилатные группы GelMA вступают в реакцию с остатками метакрилата на модифицированных предметных стеклах, что приводит к химическому прикреплению гидрогеля к стеклу.
   11. Через 15 минут реакция завершена. Отсоедините подложку от формы с помощью острого предмета, например иглы, и отодвиньте подложку от покровного стекла, чтобы отделить ее.
   12. Перенесите гидрогели в 1x фосфатно-солевой буфер (PBS) в чашку Петри диаметром 100 мм, закрытую пластиковой пленкой, и уравновесьте при 37 °C, чтобы удалить оставшиеся реагенты и побочные продукты.
   13. Поскольку гидрогель немного больше окончательных размеров, обрежьте все излишки геля по бокам, чтобы они соответствовали размерам, необходимым для окна проточной камеры.
   14. Используйте проточную камеру для проверки размеров гидрогеля. Убедитесь, что гидрогель правильно помещается в проточную камеру без зазоров между гидрогелем и формой или каких-либо дефектов, которые могут повлиять на характер потока. Если есть неровности формы, которые могут повлиять на характер потока в проточной камере, что приведет к неблагоприятному поведению клеток, сохраните гидрогель для статических условий.
   15. Перелейте четыре гидрогеля в чашку Петри, содержащую 1x PBS для стерилизации.
2. Простерилизуйте гидрогель, как описано ниже, используя 70% этанол.
   1. Приготовьте 25%, 50% и 70% спиртовые растворы для постепенной дегидратации гидрогеля.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если не проводить постепенное обезвоживание, более жесткие гидрогели могут сжиматься и ломаться, в то время как на поверхности более мягких гидрогелей могут образовываться складки.
   2. Аспирируйте 1x PBS раствор из чашки Петри, содержащей гидрогели. Добавьте 25% раствор этанола в каждую чашку Петри, чтобы погрузить гидрогели 5 кПа и 10 кПа на 15 минут.
   3. Отсадите 25% спиртовой раствор. Добавьте 50% спиртовой раствор в каждую чашку Петри, чтобы погрузить гидрогели 5 кПа и 10 кПа на 15 минут.
   4. Отсадите 50% спиртовым раствором. Добавьте 70% спиртовой раствор в каждую чашку Петри, погрузив гидрогели 5 кПа и 10 кПа на 5 минут. Поставьте чашку Петри на шейкер при 100 оборотах в минуту.
   5. Оставьте гидрогели 5 кПа погруженными в воду на 40 минут, а гидрогели 10 кПа на 20 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Было замечено, что гидрогели с массой 5 кПа более склонны к загрязнению по сравнению с гидрогелями с массой 10 кПа.
   6. Переложите образцы в 6-луночный планшет в шкафу биобезопасности и промойте гидрогели в 2-3 раза с помощью стерильного PBS.

4. Покрытие гидрогелями

1. Приготовьте раствор желатина с концентрацией 60 мкг/мл, растворив 3 мг желатина в 50 мл стерильного PBS (1 мл с солью магния и кальция). Нагрейте раствор на водяной бане при температуре 37 °C в течение 30 минут или до полного растворения всего желатина.
2. Стерильно отфильтровать раствор покрытия с помощью шприцевого фильтра 0,2 мкм. Отсадите 1x раствор PBS из каждой луночной пластины и добавьте раствор желатина в каждую лунку, обеспечивая полное покрытие каждого гидрогеля. Чтобы свести к минимуму риск загрязнения, добавьте в раствор покрытия 40 единиц/мл пенициллина и 10 μг/мл стрептомицина.
3. Инкубируйте каждую лунку в инкубаторе с температурой 37 °C и 5%_CO2 в течение 45 минут. Промойте гидрогели 1x раствором PBS.
4. Аспиратуйте PBS и добавьте среды для клеточных культур.
5. Не более двух суток выдерживайте гидрогели в питательных средах для клеточных культур и инкубируйте их в инкубаторе с температурой 37 °C и 5%_CO2 до посева клеток.
   Примечание: Несмотря на отличные свойства фибронектина по прикреплению клеток, существует обеспокоенность по поводу его использования из-за того, что ЭК откладывают эндогенный фибронектин в атеросклеротических условиях, что может привести к провоспалительной реакции. Чтобы избежать химически стимулированных клеточных реакций, мы воздерживаемся от использования фибронектина. Кроме того, Orr et al. продемонстрировали, что фибронектиновое покрытие, по сравнению с коллагеновым покрытием I, усиливает атерогенные гены. В частности, они наблюдали повышенные уровни экспрессии молекулы межклеточной адгезии 1 (ICAM-1), молекулы адгезии сосудистых клеток 1 (VCAM-1) и ядерного фактора-κB (NF-κB)¹⁴.

5. Затравка ячеек на субстраты

1. Приготовьте клеточную суспензию в соответствии с доступными протоколами отслойки и подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра⁸.
2. Тщательно отсасывайте среду из гидрогелей. Добавьте 50 000 клеток/см2 к каждому образцу. Добавьте необходимый объем клеточной суспензии в каждый образец, чтобы предотвратить переполнение клеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Более жесткие субстраты более гидрофобны; Поэтому сведите к минимуму время между этапами для улучшения смачиваемости и диспергирования клеточной суспензии на поверхности субстрата.
3. Инкубировать гидрогели с клеточным семенем в инкубаторе с температурой 37 °C и 5%_CO2 в течение 2 ч. Добавляйте в образцы среды для клеточных культур после того, как клетки прикрепятся к гелям.

6. Изготовление проточной камеры

ПРИМЕЧАНИЕ: Подход к проектированию проточной камеры является экономически эффективным и требует минимальных знаний для изготовления и использования.

1. Используйте полиметилметакрилат для изготовления камер для визуальной оценки качества потока, целостности гидрогеля при напряжении сдвига и потенциальных исследований биомаркеров в режиме реального времени во время экспериментов с потоком. Конструкция камеры была создана с использованием программного обеспечения системы автоматизированного проектирования (САПР). Проточная камера была подана на патент, и подробности об этом устройстве не могут быть раскрыты в настоящем протоколе.
2. Вычислительная оценка условий течения в проточной камере
   1. Соберите отдельные компоненты спроектированной проточной камеры (. SLDPRT) для создания окончательной конфигурации камеры.
   2. Проведите линию вдоль осевой линии потока, касательную к поверхности гидрогеля, чтобы проанализировать напряжение сдвига. Закройте входное и выходное отверстия, чтобы определить закрытый контрольный объем.
   3. Откройте Flow Simulation на вкладке Надстройки в программном обеспечении САПР. На вкладке Моделирование потока откройте функцию Мастер, чтобы ввести свойства. Укажите систему единиц измерения и отрегулируйте давление и единицы измерения напряжения с точностью до дин/см².
   4. Проверьте расход жидкости и гравитацию в физических элементах. Установите гравитацию на -9,8 в компоненте Z; Компоненты X и Y должны быть равны нулю.
   5. Выберите Внутренний для типа анализа в окне Обработка геометрии. Выберите Вода в качестве жидкости по умолчанию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предположим, что среда ведет себя как вода.
   6. Выберите Ламинарный и Турбулентный для типа потока. Определите стену как адиабатическую стену и введите шероховатость поверхности в поле Состояние стены.
   7. Установите температуру на 37,5 °C (310,65 K) в начальных условиях. Определите вычислительную область в проектах моделирования потоков, убедившись, что она охватывает весь объем управления.
   8. Выберите все стенки, взаимодействующие с жидкостью, чтобы определить подобласть жидкости. В поле «Граничное условие» укажите внутреннюю поверхность впускной крышки как «Объемный расход на входе» и укажите расход (Q) и равномерный расход. Затем назначьте внутреннюю поверхность уплотнения выпускной крышки как статическое давление.
   9. Определите глобальный размер сетки на основе доступных вычислительных ресурсов. Нажмите кнопку «Выполнить », чтобы запустить симуляцию.
   10. По завершении просмотрите желаемые результаты, включая графики напряжений сдвига и моделирование потока.
   11. Повторите шаги с 6.2.8 по 6.2.10 с различными скоростями потока, чтобы рассчитать приложенное напряжение сдвига при разных скоростях. Используйте регрессионный анализ для установления взаимосвязи скорости потока и напряжения сдвига.
   12. Оцените устойчивость системы к изменениям размеров гидрогеля для повышения реалистичности моделирования.

7. Запустите равномерный ламинарный поток

1. После культивирования клеток на гидрогелях с концентрацией 5 кПа и 10 кПа обеспечьте слияние монослоя клеток в инкубаторе с температурой 37 °C, 5% CO₂ . Следует добиться монослоя клеток на каждом гидрогеле.
2. Стерилизуйте автоклавируемые компоненты системы параллельных пластинчатых камер (винты из нержавеющей стали, шпатель, щипцы, прокладка и резервуар для фильтрующего материала) с помощью 30-минутного цикла гравитационного автоклава. Стерилизуйте другие детали (акриловые компоненты и герметик/демпферы резервуара) под воздействием ультрафиолетового излучения.
3. Соберите устройство проточной камеры в шкафу биобезопасности. Закрепите образцы гидрогеля в приборе, обеспечив однородность. Используйте наполнитель того же размера, что и гидрогели, если для потока доступно недостаточное количество образцов.
4. Предварительно намочите внутреннюю поверхность камеры и гидрогелевые поверхности, чтобы свести к минимуму образование пузырьков и предотвратить высыхание клеток во время сборки.
5. Добавьте достаточное количество фильтрующего материала во входной резервуар, чтобы 20–30% фильтрующего материала поступало в выпускной резервуар после сборки. Герметично загерметизируйте впускной бачок с помощью демпфера/герметика.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Повышение давления во входном бачке приводит к движению потока, а любые утечки воздуха изменяют скорость потока. Проверьте герметичность на наличие дефектов герметика, если на наружной трубке образуются пузыри.
6. Установите выпускную заслонку на атмосферное давление, чтобы установить перепад давления. Поместите устройство и резервуары в инкубатор с температурой 37 °C, 5% CO₂ . Подсоедините трубку устройства к перистальтическому насосу, расположенному снаружи инкубатора (рисунок 1С).
7. Включите насос, чтобы начать вносить 3,6 дин/см² . Постепенно увеличивайте расход с шагом 2 мл/мин (например, достигните 85 мл/мин с 65 мл/мин через 10 мин) до нанесения примерно 8 дин/^см2.
8. Далее увеличивайте расход с шагом 2,5 мл/мин до достижения 12 дин/^см2 напряжения сдвига.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Дайте клеткам время адаптироваться к динамическим условиям, так как быстрое увеличение скорости потока может привести к отрыву клеток и повреждению монослоя.
9. Через 6 ч остановите поток, извлеките устройство из инкубатора, и разберите проточную камеру. Затем перенесите образцы гидрогеля на шестилуночный планшет.
10. Промойте образцы ледяным PBS и либо зафиксируйте клетки для иммуноокрашивания, либо лизируйте их для выделения белка.

8. Установка иммуноокрашивания для конфокальной микроскопии с большим увеличением

Примечание: Для повышения эффективности исследования был разработан метод иммуноокрашивания небольших порций гидрогелей, позволяющий исследовать несколько биологических мишеней в одном образце.

1. Подготовьте пуансоны для биопсии или предпочтительные режущие инструменты диаметром 3 или 4 мм.
2. Используйте коробку с наконечником для пипетки в качестве камеры для окрашивания. Увлажните камеру, чтобы контролировать испарение красящего раствора во время длительной инкубации, положив влажное бумажное полотенце на дно коробки с наконечником для дозатора.
3. Сокращение потребления антител за счет создания небольших пулов растворов для отдельных образцов. Накройте стеллаж коробки для наконечников прозрачной пленкой, аккуратно прижимая пленку к отверстиям стойки кончиком пальца, чтобы сделать ямочки. Заполните ямочки 70 мкл PBS.
4. Перенесите отдельный гидрогель в пустую чашку Петри и разрежьте его с помощью пробойника для биопсии или предпочитаемого режущего инструмента. Используйте микроскоп, чтобы вырезать репрезентативную область образца. Разрежьте полный гелевый цилиндр, чтобы избежать проблем с конфокальной микроскопией.
5. Поместите вырезанные образцы гидрогеля в ямочки, созданные на шаге 8.3. Выполняйте окрашивание в соответствии со стандартным протоколом¹⁵. После окончательной промывки для окрашивания получите лист силиконовой резины, соответствующий толщине гидрогеля.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Предпочтительно использовать лист с одной липкой стороной для лучшей герметизации. В этом исследовании актиновые волокна окрашивали с использованием флуоресцентного вторичного антитела, конъюгированного с фаллоидином в разведении 1:20.
6. Разрежьте резиновый лист на квадраты размером 15 мм х 15 мм. Проделайте отверстие диаметром 6 мм с помощью пуансона для биопсии или предпочитаемого режущего инструмента.
7. Создайте контейнер для образцов, прикрепив резину к покровному стеклу для микроскопии (No 1.5). Добавьте 10 мкл влажной монтажной среды в углубления, пока образец еще присутствует, и инкубируйте его в темноте в течение 10-15 минут.
   Примечание: Для данного исследования монтажная среда содержала 0,9 мкг/мл 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) для сокращения протокола окрашивания.
8. Извлеките образец из камеры окрашивания и поместите его в контейнер, созданный на шаге 8.7. Нанесите 1-2 мкл монтажной среды поверх образца.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Количество монтажных носителей влияет на качество изображения при большом увеличении. Чрезмерное или недостаточное количество монтажных носителей может ухудшить четкость изображения.
9. Поместите сверху еще одну защитную крышку и осторожно нажмите, чтобы образец соприкоснулся со стеклом. Храните образцы при температуре 4 °C в темноте до получения микроскопической визуализации.

Результаты

На рисунке 1 изображена экспериментальная установка, описывающая процесс синтеза GelMA с помощью реакции метакрилирования. Полученный продукт затем использовался для изготовления гидрогелевой подложки, на которую засеивались ЭК. Впоследствии клетки были введены в прот?...

Обсуждение

Сосудистая система представляет собой динамичную среду, в которой различные силы существенно влияют на поведение клеток. Изучение биологических событий в сердечно-сосудистых заболеваниях без учета этих сил было бы неточным. Таким образом, решающее значение имеют клеточные модели, сп?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
(trimethoxysilyl)propyl methacrylate, tetramethylethylenediamine (TEMED)	Invitrogen	15524-010	Hydrogel Fabrication
3-(Trimethoxysilyl)Propyl Methacrylate	Sigma-Aldrich	440159	Glass Salinization
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)-containing mounting media	Vector Laboratories	H-1200	Immunostaining
Acetone	Thermo Fisher Scientifics	A18-4	GelMA Synthesis
Alexa Fluor 555 Phalloidin	Cell Signaling Technology	8953S	Immunostaining
Ammonium Persulfate (APS)	Bio-Rad	1610700	Hydrogel Fabrication
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet (45/64'')	McMaster-CARR	8560K165	Flow Chamber Fabrication
Confocal Microscope	Carl Zeiss Meditex AG	Zeiss LSM 800	Immunostaining
Covidien Monoject Rigid Pack 60 mL Syringes without Needles	Fisher	22-031-375	Flow Experiment
EC growth kit	American Type Culture Collection (ATCC)	PCS-100-041	Cell Culture
Ethanol 200 Proof	Decon Labs	2701	Glass Salinization
Gelatin Type A (300 bloom) from porcine skin	Sigma-Aldrich	G1890	GelMA Synthesis
Glacial Acetic Acid	Thermo Fisher Scientifics	9526-33	Glass Salinization
High-Purity High-Temperature Silicone Rubber Sheet	McMaster-Carr	87315K74	Flow Chamber Fabrication
Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)	American Type Culture Collection (ATCC)	PSC-100-010	Cell Culture
M3x30mm Machine Screws Hex Socket Round Head Screw 304 Stainless Steel Fasteners Bolts 20pcs	Uxcell	B07Q5RM2TP	Flow Chamber Fabrication
Masterflex L/S Digital Drive with Easy-Load® 3 Pump Head for Precision Tubing; 115/230 VAC	VWR	#MFLX77921-65	Flow Experiment
Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Puri-Flex, L/S 25; 25 ft	VWR	#MFLX96419-25	Flow Experiment
Methacrylic Anhydride (MAH)	Sigma-Aldrich	276685	GelMA Synthesis
Paraformaldehyde	Thermo Fisher Scientifics	043368.9M	Cell Culture
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Gibco	14080-055	General
Sodium Bicarbonate	Fisher Chemical	S233-3	GelMA Synthesis
Sodium Carbonate	Fisher Chemical	S263-500	GelMA Synthesis
SOLIDWORKS educational version
SOLIDWORKS Student Edition Desktop, 2023	SolidWorks	N/A	Flow Chamber Design
Vascular Basal Medium	American Type Culture Collection (ATCC)	PCS-100-030	Cell Culture