Modèle in vitro intégrant la rigidité et l’écoulement du substrat pour étudier les réponses des cellules endothéliales

Résumé

Nous avons synthétisé et caractérisé un substrat à base de gélatine accordable pour la culture de cellules endothéliales vasculaires (CE) dans des conditions de flux vasculaire pertinentes. Cette surface biomimétique reproduit à la fois des conditions physiologiques et pathologiques, permettant d’étudier les forces mécaniques sur le comportement des CE et de faire progresser notre compréhension de la santé vasculaire et des mécanismes de la maladie.

Résumé

Nous présentons un modèle in vitro innovant visant à étudier les effets combinés de la rigidité tissulaire et du stress de cisaillement sur la fonction des cellules endothéliales (CE), qui sont cruciales pour comprendre la santé vasculaire et l’apparition de maladies telles que l’athérosclérose. Traditionnellement, les études ont exploré les impacts de la contrainte de cisaillement et de la rigidité du substrat sur les CE, indépendamment. Cependant, ce système intégré combine ces facteurs pour fournir une simulation plus précise de l’environnement mécanique du système vasculaire. L’objectif est d’examiner la mécanotransduction des EC à travers divers niveaux de rigidité tissulaire et conditions d’écoulement à l’aide de CE humaines. Nous détaillons le protocole de synthèse d’hydrogels de méthacrylate de gélatine (GelMA) à rigidité réglable et leur ensemencement avec des EC pour obtenir une confluence. De plus, nous décrivons la conception et l’assemblage d’une chambre d’écoulement rentable, complétée par des simulations numériques de dynamique des fluides, pour générer des conditions d’écoulement physiologiques caractérisées par un écoulement laminaire et des niveaux de contrainte de cisaillement appropriés. Le protocole intègre également le marquage par fluorescence pour la microscopie confocale, ce qui permet d’évaluer les réponses EC à la fois à la compliance tissulaire et aux conditions d’écoulement. En soumettant des CE cultivées à de multiples stimuli mécaniques intégrés, ce modèle permet des études complètes sur la façon dont des facteurs tels que l’hypertension et le vieillissement peuvent affecter la fonction des CE et les maladies vasculaires médiées par les CE. Les connaissances acquises grâce à ces recherches seront déterminantes pour élucider les mécanismes sous-jacents aux maladies vasculaires et pour développer des stratégies de traitement efficaces.

Introduction

L’endothélium, qui tapisse la surface interne des vaisseaux sanguins, joue un rôle central dans le maintien de la santé vasculaire. Les cellules endothéliales (CE) sont essentielles à la régulation de diverses fonctions cardiovasculaires, notamment le contrôle du tonus des vaisseaux, la perméabilité sélective, l’hémostase et la mécanotransduction ^1,2. La recherche a fermement lié le dysfonctionnement de la CE à un rôle primordial dans le développement de l’athérosclérose. Notamment, les CE rencontrent diverses forces mécaniques aux interfaces où elles interagissent avec le flux sanguin et les tissus vasculaires sous-jacents ^3,4. Plusieurs études ont associé le dysfonctionnement de la CE à des changements anormaux dans les facteurs mécaniques de l’environnement vasculaire, tels que le stress de cisaillement des fluides dû au flux sanguin et la rigidité des tissus ^5,6,7.

Cependant, les recherches antérieures ont reçu peu d’attention pour comprendre les effets combinés de la rigidité des tissus et du stress de cisaillement sur la fonction EC. Pour améliorer la capacité de traduire les résultats de la recherche en traitements efficaces pour l’athérosclérose et d’autres maladies cardiovasculaires, il est essentiel d’améliorer les modèles cellulaires utilisés dans le domaine. Des progrès significatifs ont été réalisés dans l’humanisation des modèles cellulaires en utilisant des CE humains et en les soumettant soit à des contraintes de cisaillement, soit à des substrats avec des niveaux de rigidité variables ^8,9,10. Cependant, l’adoption et le perfectionnement de modèles cellulaires qui intègrent des environnements d’écoulement dynamiques avec des substrats EC possédant des propriétés de rigidité réglables ont progressé lentement. Le défi consiste à concevoir des substrats EC non gonflants pour empêcher les altérations des paramètres d’écoulement dans le canal d’écoulement tout en facilitant la culture de monocouches EC intactes et bien adhérentes. Un modèle in vitro capable de surmonter ces obstacles pourrait faciliter des investigations plus efficaces sur la façon dont l’hypertension, le vieillissement et les conditions de flux influencent en collaboration la mécanotransduction de la CE, la santé vasculaire et, en fin de compte, le développement de l’athérosclérose. Diverses méthodes ont été développées pour appliquer une contrainte de cisaillement sur les cellules tout en contrôlant la rigidité du substrat, y compris des plaques rotatives et des dispositifs microfluidiques. Dans la méthode des plaques rotatives, les cellules sont placées entre deux plaques et une contrainte de cisaillement est appliquée par le mouvement de rotation des plaques. Cette méthode est moins compliquée et fournit un modèle rapide ; Cependant, il souffre d’une variation spatiale des contraintes de cisaillement, avec une contrainte de cisaillement nulle au centre et une contrainte de cisaillement maximale à la périphérie¹¹.

D’autre part, les dispositifs microfluidiques représentent la nouvelle génération d’outils capables de contrôler la rigidité du substrat et les conditions d’écoulement. Ces systèmes sont adaptés pour imiter les microvascularisations dans des conditions d’écoulement laminaire. Cependant, il n’est pas pratique d’étudier l’athérosclérose avec de tels appareils, car l’athérosclérose se produit dans de gros vaisseaux dont le flux est perturbé¹¹. Cet article vise à contribuer au domaine de recherche critique des études EC en présentant un système rentable capable d’examiner les effets de différents niveaux de rigidité dans des substrats EC dans différentes conditions d’écoulement. Le système intègre des substrats de différentes rigidités pour émuler les vaisseaux sanguins pathologiques et physiologiques. Ce protocole décrit la méthode de création d’hydrogels à base de gélatine sans gonflement et avec des niveaux de rigidité de 5 kPa et 10 kPa, représentant respectivement une rigidité physiologique et pathologique. De plus, la construction d’une chambre d’écoulement à plaques parallèles capable d’intégrer ces substrats est détaillée. La dynamique des fluides numérique (CFD) a été utilisée pour évaluer les contraintes de cisaillement et les conditions d’écoulement. La préparation d’hydrogels pour la culture EC et l’exécution d’une expérience d’écoulement de 6 h sont décrites, suivies d’une discussion sur l’immunocoloration post-expérience.

Protocole

1. Synthèse de GelMA

1. Préparez une solution 0,2 M de carbonate de sodium anhydre et une solution 0,2 M de bicarbonate de sodium.
2. Mélanger 46 mL de solution de bicarbonate de sodium avec 15 mL de solution de carbonate de sodium et ajouter 139 mL d’eau désionisée (DI). Ajustez le pH à 9,5 en utilisant 0,1 M de NaOH et de HCl si nécessaire.
3. Ajouter 10 g de gélatine de type A, à 300 blooms de peau de porc à 100 mL de tampon carbonate-bicarbonate à une concentration de 10 % p/v.
4. Dissoudre la gélatine à l’aide d’un bain-marie à 55 °C en agitant la solution à 700 tr/min à l’aide d’un agitateur magnétique. Une fois complètement dissoute, ajustez le pH de la solution de gélatine à 9,5 en utilisant 0,1 M de NaOH.
5. Pour amorcer la méthacrylation, ajoutez 938 μL d’anhydride méthacrylique (MAH) goutte à goutte à la solution. Améliorez la distribution initiale de la MAH dans la solution de gélatine en l’injectant à divers endroits, y compris à différentes profondeurs et distances radiales du centre.
6. Enveloppez le récipient de réaction dans du papier d’aluminium pour éviter l’exposition à la lumière. Maintenir la température à 55 °C et agiter la solution à 500 tr/min pendant 1 h pour terminer la réaction (Figure 1A)¹².
   REMARQUE : La réaction s’arrête à un pH inférieur à 7,4.
7. Préparez un bécher de 2 L contenant 1,8 L d’acétone et un bécher de 0,6 L contenant 0,3 L d’acétone.
8. Ajouter la solution GelMA obtenue goutte à goutte dans le bécher de 2 L tout en agitant à 200 tr/min pour induire la précipitation¹³. Pour maximiser la collecte du produit précipité, placez une tige ou une spatule en acier inoxydable comme site de nucléation pour faciliter le transfert.
9. Transférez le produit du plus grand bécher au plus petit et laissez-le reposer pendant 10 minutes avant de passer à l’étape de séchage. Le GelMA précipité doit apparaître sous forme de fibres blanches.
10. Récupérez le produit sur du papier absorbant, séchez-le dans un four sous vide à température ambiante (RT) et conservez-le à -20 °C jusqu’à une nouvelle utilisation.
    REMARQUE : Des détails supplémentaires sur la caractérisation chimique du produit par résonance magnétique nucléaire des protons (RMN ¹H) peuvent être trouvés dans un travail publié antérieurement⁸.

2. Salinisation du verre

REMARQUE : La fixation d’hydrogels sur des lames de verre fournit une surface plane et uniforme, facilitant la manipulation et assurant la stabilité sous contrainte de cisaillement dérivée de l’écoulement. La fonctionnalisation du verre avec du méthacrylate de 3-(triméthoxysilyl)propyle est nécessaire pour améliorer les propriétés de surface et permettre la fixation covalente des hydrogels pendant le processus de polymérisation.

1. Découpez avec précision des lames de microscope simples (1 mm d’épaisseur) en morceaux similaires aux dimensions finales de l’hydrogel à l’aide d’un coupe-verre. Lavez les lames coupées avec du savon pour éliminer les contaminants de surface et les débris qui pourraient obstruer le traitement de la surface du verre.
   REMARQUE : Si nécessaire, sonicez les lames de verre pendant 5 min dans de l’éthanol, puis séchez-les à l’air.
2. Préparez une solution à 0,5 % de méthacrylate de 3-(triméthoxysilyl)propyle dans de l’éthanol absolu. Préparez une solution glaciaire d’acide acétique à 10 % dans de l’eau DI. Mélangez les solutions pour obtenir une concentration finale de 3 % d’acide acétique glacial.
   REMARQUE : La solution glaciale d’acide acétique peut être préparée en grande quantité et stockée.
3. Organisez les lames de verre dans un récipient en verre pour vous assurer que les surfaces en verre ne sont pas obstruées. Versez la solution obtenue sur les lames de verre et conservez-les pendant environ 5 minutes sur une bascule à 80 tr/min pour que la réaction soit complète. Assurez-vous que les deux côtés des lames de verre sont modifiés en éliminant les bulles d’air emprisonnées.
4. Une fois la réaction terminée, aspirez la solution et lavez les lames de verre avec de l’éthanol 2x. Faites sécher les lames à l’air libre et rangez-les dans l’obscurité à RT.
   REMARQUE : Les lames de verre conservent leur modification pendant 1 mois dans ces conditions.

3. Préparation de l’hydrogel

1. Fabriquer des hydrogels à l’aide d’une méthode de polymérisation radicalaire induite par l’oxydoréduction.
   1. Assemblez des moules en polytétrafluoroéthylène (PTFE) en deux parties avec une profondeur appropriée et des fenêtres ouvrantes de 10^mm2 pour façonner le substrat final. Tenir compte d’un retrait de 25 % de la hauteur de l’hydrogel après polymérisation pendant le processus de conception. Assurez-vous que les moules sont plats et solidement fixés aux plaques inférieure et supérieure pour éviter les fuites.
      REMARQUE : Les dimensions du moule conçues sont intentionnellement 10% plus grandes que la taille d’hydrogel prévue. Cette conception a plusieurs objectifs : elle empêche d’endommager les côtés lors de la séparation du moule, améliore la régularité de la surface de l’hydrogel en poussant les impuretés ou les bulles sur les côtés, et compense le retrait prévu de 25 % après l’équilibrage en raison de l’effet de synérèse, où les hydrogels hautement réticulés repoussent l’eau après l’équilibre, provoquant un retrait. La quantité de retrait est spécifiée dans le protocole⁸.
   2. Pour garantir que les hydrogels ont une surface uniforme et une hauteur constante, suspendez les lames de verre modifiées à la plaque supérieure du moule, permettant une ouverture étroite pour l’injection de la solution polymère. À l’aide d’une vitre de protection, suspendez les lames de verre modifiées (Figure 1B).
   3. Pour créer le verre de couverture, coupez du verre microscopique ordinaire 20% plus grand que le moule. Fixez deux entretoises sur les côtés les plus courts. Calculez l’épaisseur de l’entretoise comme suit :
      Épaisseur de l’entretoise = 1,33 x épaisseur finale du gel + 1 (épaisseur du verre modifié) - profondeur du moule
   4. Appliquez une fine couche de graisse d’étanchéité compatible avec les cellules sur les côtés les plus longs du verre de protection, sur la même face où les entretoises sont fixées.
   5. Fixez la glissière de verre modifiée au verre de protection entre les deux entretoises.
   6. Placez le verre de couverture sur le moule de sorte que les entretoises reposent sur le moule et que le verre modifié s’étende dans le moule. Cette configuration offre un dégagement de 1,33 de la hauteur finale de l’hydrogel entre le verre modifié et le fond du moule.
   7. Dissoudre GelMA dans de l’eau DI à 4 % et 10 % p/v pour des hydrogels de 5 kPa et 10 kPa, respectivement, et le placer dans un bain-marie à 45 °C.
      REMARQUE : GelMA est un polymère thermosensible et le maintien de la température de la solution à 45 °C empêche la solidification avant la polymérisation et réduit la viscosité de la solution, ce qui est crucial pour la fabrication d’hydrogels plats.
   8. Ajouter TEMED (24 mM pour un hydrogel de 5 kPA, 6,25 mM pour un hydrogel de 10 kPa) à la solution de polymère et bien mélanger.
      REMARQUE : TEMED seul n’initie pas la polymérisation, alors assurez-vous que les moules, les pipettes et les solutions sont préparés avant de procéder.
   9. Ajoutez de l’APS (24 mM pour un hydrogel de 5 kPA, 24,5 mM pour un hydrogel de 10 kPa) à la solution de GelMA et mélangez soigneusement.
      REMARQUE : L’ajout d’APS initie la polymérisation, et les hydrogels peuvent se former rapidement, nécessitant une action rapide pour éviter les hydrogels défectueux. De plus amples détails sur les mesures de rigidité peuvent être trouvés dans un travail précédemment publié⁸.
   10. Pipetez soigneusement la solution obtenue jusqu’à l’ouverture entre la lame de verre suspendue et le moule à RT et laissez-la se réticuler. La force capillaire entraîne la solution polymère dans le moule. Évitez d’ajouter des bulles aux gels et arrêtez le pipetage lorsqu’il reste une petite quantité de solution dans la pointe de la pipette.
       REMARQUE : Pendant la polymérisation, les groupes méthacrylate de GelMA réagissent avec les résidus de méthacrylate sur les lames de verre modifiées, ce qui entraîne la fixation chimique de l’hydrogel au verre.
   11. Au bout de 15 min, la réaction est complète. Détachez le substrat du moule à l’aide d’un objet pointu, tel qu’une aiguille, et faites glisser le substrat loin du verre de protection pour le séparer.
   12. Transférez les hydrogels dans 1 solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans une boîte de Pétri de 100 mm scellée avec un film plastique et équilibrez à 37 °C pour éliminer les réactifs et sous-produits restants.
   13. Comme l’hydrogel est légèrement plus grand que les dimensions finales, coupez tout excès de gel sur les côtés pour correspondre aux dimensions requises pour la fenêtre de la chambre d’écoulement.
   14. Utilisez la chambre d’écoulement pour vérifier les dimensions de l’hydrogel. Assurez-vous que l’hydrogel s’insère correctement dans la chambre d’écoulement, sans espace entre l’hydrogel et le moule ni aucun défaut qui pourrait affecter les modèles d’écoulement. S’il y a des irrégularités de forme qui peuvent affecter le modèle d’écoulement dans la chambre d’écoulement, entraînant un comportement cellulaire défavorable, conservez l’hydrogel pour les conditions statiques.
   15. Transférez quatre hydrogels dans une boîte de Pétri contenant 1x PBS pour la stérilisation.
2. Stérilisez l’hydrogel comme décrit ci-dessous avec de l’éthanol à 70 %.
   1. Préparez des solutions d’alcool à 25 %, 50 % et 70 % pour une déshydratation progressive de l’hydrogel.
      REMARQUE : Si une déshydratation progressive n’est pas effectuée, les hydrogels plus rigides peuvent rétrécir et se briser, tandis que des rides peuvent se former à la surface des hydrogels plus mous.
   2. Aspirez la solution 1x PBS de la boîte de Pétri contenant des hydrogels. Ajoutez une solution d’éthanol à 25 % dans chaque boîte de Pétri pour immerger les hydrogels de 5 kPa et 10 kPa pendant 15 min.
   3. Aspirez la solution d’alcool à 25 %. Ajoutez une solution d’alcool à 50 % dans chaque boîte de Pétri pour immerger les hydrogels de 5 kPa et 10 kPa pendant 15 min.
   4. Aspirez la solution d’alcool à 50 %. Ajoutez une solution d’alcool à 70 % dans chaque boîte de Pétri, en immergeant les hydrogels de 5 kPa et 10 kPa pendant 5 min. Placez la boîte de Pétri sur un shaker à 100 tr/min.
   5. Laissez les hydrogels de 5 kPa immergés pendant 40 min et les hydrogels de 10 kPa pendant 20 min.
      REMARQUE : On a observé que les hydrogels de 5 kPa étaient plus sujets à la contamination que les hydrogels de 10 kPa.
   6. Transférez les échantillons dans une plaque à 6 puits dans une enceinte de biosécurité et lavez les hydrogels 2x-3x avec du PBS stérile.

4. Revêtement des hydrogels

1. Préparez une solution de gélatine de 60 μg/mL en dissolvant 3 mg de gélatine dans 50 mL de PBS stérile (1x avec du sel de magnésium et de calcium). Faites chauffer la solution au bain-marie à 37 °C pendant 30 minutes ou jusqu’à ce que toute la gélatine soit complètement dissoute.
2. Filtrez stérilement la solution d’enrobage à l’aide d’un filtre à seringue de 0,2 μm. Aspirez la solution 1x PBS de chaque plaque de puits et ajoutez la solution de gélatine dans chaque puits, assurant une couverture complète de chaque hydrogel. Pour minimiser le risque de contamination, ajouter 40 unités/ml de pénicilline et 10 μg/mL de streptomycine à la solution d’enrobage.
3. Incuber chaque plaque de puits dans un incubateur à 37 °C à 5 % de CO₂ pendant 45 min. Lavez les hydrogels avec 1x solution PBS.
4. Aspirez le PBS et ajoutez des milieux de culture cellulaire.
5. Pendant deux jours au maximum, conservez les hydrogels dans un milieu de culture cellulaire et incubez-les dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO₂ jusqu’à l’ensemencement cellulaire.
   REMARQUE : Malgré les excellentes propriétés d’attachement cellulaire de la fibronectine, son utilisation est préoccupante en raison du dépôt de fibronectine endogène dans les conditions athérosclérotiques, ce qui peut entraîner une réponse pro-inflammatoire. Pour éviter les réponses cellulaires stimulées chimiquement, nous renonçons à utiliser la fibronectine. De plus, Orr et al. ont démontré que l’enrobage de fibronectine, par rapport à l’enrobage de collagène I, régulait à la hausse les gènes athérogènes. Plus précisément, ils ont observé une augmentation des niveaux d’expression de la molécule d’adhésion intercellulaire 1 (ICAM-1), de la molécule d’adhésion cellulaire vasculaire 1 (VCAM-1) et du facteur nucléaire-κB (NF-κB)¹⁴.

5. Ensemencement des cellules sur les substrats

1. Préparez la suspension cellulaire en suivant les protocoles de détachement disponibles et comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre⁸.
2. Aspirez soigneusement le média des hydrogels. Ajouter 50 000 cellules/cm2 à chaque échantillon. Ajoutez un volume approprié de suspension cellulaire à chaque échantillon pour éviter le débordement de la cellule.
   REMARQUE : Les substrats plus rigides sont plus hydrophobes ; Par conséquent, minimisez le temps entre les étapes pour améliorer la mouillabilité et la dispersion de la suspension cellulaire à la surface du substrat.
3. Incuber des hydrogels ensemencés en cellules dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO₂ pendant 2 h. Ajoutez des milieux de culture cellulaire aux échantillons une fois que les cellules sont fixées aux gels.

6. Fabrication de la chambre d’écoulement

REMARQUE : L’approche de conception de la chambre d’écoulement est rentable et nécessite une expertise minimale pour la fabrication et l’utilisation.

1. Utilisez du poly(méthacrylate de méthyle) pour la fabrication en chambre afin d’évaluer visuellement la qualité de l’écoulement, l’intégrité de l’hydrogel sous contrainte de cisaillement et les études potentielles de biomarqueurs en temps réel pendant les expériences d’écoulement. La conception de la chambre a été créée à l’aide d’un logiciel de conception assistée par ordinateur (CAO). La chambre d’écoulement a fait l’objet d’un dépôt de brevet, et les détails de ce dispositif ne peuvent pas être divulgués dans le protocole actuel.
2. Évaluation informatique des conditions d’écoulement dans la chambre d’écoulement
   1. Assemblez les différents composants de la chambre d’écoulement conçue (. SLDPRT) pour créer la configuration finale de la chambre.
   2. Tracez une ligne le long de la ligne médiane de l’écoulement tangentielle à la surface de l’hydrogel pour analyser la contrainte de cisaillement. Fermez les ouvertures d’entrée et de sortie pour définir un volume de commande fermé.
   3. Ouvrez Flow Simulation à partir de l’onglet Compléments du logiciel de CAO. Dans l’onglet Simulation d’écoulement, ouvrez la fonction Assistant pour saisir les propriétés. Spécifiez le système d’unités et ajustez la pression et les unités de contrainte sur dyne/cm².
   4. Vérifiez l’écoulement du fluide et la gravité dans les caractéristiques physiques. Réglez la gravité à -9,8 dans la composante Z ; Les composantes X et Y doivent être égales à zéro.
   5. Choisissez Interne pour le type d’analyse dans Gestion de la géométrie. Sélectionnez Eau comme fluide par défaut.
      REMARQUE : Supposez que le milieu se comporte comme de l’eau.
   6. Choisissez Laminaire et Turbulent pour le type d’écoulement. Définissez le mur comme un mur adiabatique et entrez la rugosité de surface dans l’état du mur.
   7. Réglez la température à 37.5 °C (310.65 K) dans les conditions initiales. Définissez le domaine de calcul dans les projets de simulation d’écoulement, en vous assurant qu’il couvre l’ensemble du volume de contrôle.
   8. Sélectionnez toutes les parois qui s’interfacent avec le fluide pour définir le sous-domaine du fluide. Dans Condition aux limites, désignez la surface intérieure du couvercle d’entrée comme Débit volumique d’entrée et spécifiez le débit (Q) et l’écoulement uniforme. Ensuite, attribuez la surface intérieure de l’étanchéité du couvercle de sortie à la pression statique.
   9. Déterminez la taille de maillage globale en fonction des ressources de calcul disponibles. Appuyez sur Exécuter pour lancer la simulation.
   10. Une fois l’opération terminée, examinez les résultats souhaités, y compris les tracés des contraintes de cisaillement et les simulations d’écoulement.
   11. Répétez les étapes 6.2.8 à 6.2.10 avec différents débits pour calculer la contrainte de cisaillement appliquée à différentes vitesses. Utilisez l’analyse de régression pour établir la relation entre le débit et la contrainte de cisaillement.
   12. Évaluez la tolérance du système aux variations des dimensions de l’hydrogel afin d’améliorer le réalisme de la simulation.

7. Exécutez un flux laminaire uniforme

1. Après la culture des cellules sur les hydrogels de 5 kPa et 10 kPa, assurez-vous de la confluence de la monocouche cellulaire dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO₂ . Une monocouche de cellules sur chaque hydrogel doit être obtenue.
2. Stérilisez les composants autoclavables du système de chambre d’écoulement à plaques parallèles (vis en acier inoxydable, spatule, pinces, joint et réservoir de média) avec un cycle d’autoclave par gravité de 30 minutes. Stérilisez les autres pièces (composants acryliques et scelleur/amortisseurs de réservoir) avec une exposition à la lumière UV.
3. Assemblez le dispositif de chambre d’écoulement dans une enceinte de biosécurité. Fixez les échantillons d’hydrogel dans l’appareil, en assurant l’uniformité. Utiliser une charge de taille égale à celle des hydrogels si le nombre d’échantillons disponibles pour l’écoulement est insuffisant.
4. Pré-mouillez la surface intérieure de la chambre et les surfaces de l’hydrogel pour minimiser la formation de bulles et empêcher le dessèchement des cellules pendant l’assemblage.
5. Ajoutez suffisamment de fluide dans le réservoir d’entrée, permettant à 20 à 30 % du fluide de s’écouler vers le réservoir de sortie lors de l’assemblage. Scellez hermétiquement le réservoir d’entrée à l’aide d’un registre/scelleur.
   REMARQUE : L’accumulation de pression dans le réservoir d’entrée entraîne le débit et toute fuite d’air modifie les débits. Vérifiez s’il y a des défauts d’étanchéité si des bulles se forment dans le tube extérieur.
6. Réglez le registre de sortie sur la pression atmosphérique pour établir la différence de pression. Placez l’appareil et les réservoirs dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO₂ . Connectez la tubulure de l’appareil à une pompe péristaltique placée à l’extérieur de l’incubateur (Figure 1C).
7. Allumez la pompe pour commencer à appliquer 3,6 dyne/cm². Augmentez graduellement le débit par incréments de 2 ml/min (par exemple, atteindre 85 ml/min à partir de 65 ml/min après 10 min) jusqu’à appliquer environ 8 dyne/cm².
8. Augmentez encore le débit par incréments de 2,5 ml/min jusqu’à atteindre 12 dyne/cm² de contrainte de cisaillement.
   REMARQUE : Laissez le temps aux cellules de s’adapter à la condition dynamique, car des augmentations rapides du débit peuvent détacher les cellules et endommager la monocouche.
9. Après 6 h, arrêtez l’écoulement, retirez l’appareil de l’incubateur et démontez la chambre d’écoulement. Ensuite, transférez des échantillons d’hydrogel sur une plaque à six puits.
10. Lavez les échantillons avec du PBS glacé et fixez les cellules pour l’immunocoloration ou lysez-les pour l’isolement des protéines.

8. Configuration d’immunomarquage pour la microscopie confocale à fort grossissement

REMARQUE : Pour augmenter l’efficacité de l’étude, une méthode a été mise au point pour l’immunomarquage de petites portions d’hydrogels, ce qui permet d’examiner plusieurs cibles biologiques dans un seul échantillon.

1. Préparez des poinçons de biopsie ou des outils de coupe préférés d’un diamètre de 3 ou 4 mm.
2. Utilisez une boîte à pointes de pipette comme chambre de coloration. Humidifiez la chambre pour contrôler l’évaporation de la solution de coloration pendant une incubation prolongée en plaçant une serviette en papier humide au fond de la boîte de pointe de la pipette.
3. Réduisez la consommation d’anticorps en créant de petits pools de solutions pour des échantillons individuels. Couvrez la grille de la boîte à pointes avec un film transparent, en appuyant doucement le film contre les trous de la grille du bout du doigt pour faire des fossettes. Remplissez les alvéoles avec 70 μL de PBS.
4. Transférez un hydrogel individuel dans une boîte de Pétri vide et coupez-le à l’aide d’un poinçon de biopsie ou de l’outil de coupe de votre choix. Utilisez un microscope pour découper une zone d’échantillon représentative. Coupez un cylindre de gel plein pour éviter les problèmes de microscopie confocale.
5. Placez les échantillons d’hydrogel coupés dans les fossettes créées à l’étape 8.3. Effectuer la coloration selon le protocole standard¹⁵. Après le dernier lavage de coloration, obtenez une feuille de caoutchouc de silicone qui correspond à l’épaisseur de l’hydrogel.
   REMARQUE : De préférence, utilisez une feuille avec un côté collant pour une meilleure étanchéité. Dans cette étude, les fibres d’actine ont été colorées à l’aide d’un anticorps secondaire fluorescent conjugué à la phalloïdine à une dilution de 1:20.
6. Coupez la feuille de caoutchouc en carrés de 15 mm x 15 mm. Percez un trou de 6 mm à l’aide d’un poinçon à biopsie ou de l’outil de coupe de votre choix.
7. Créez un récipient d’échantillon en fixant le caoutchouc à une lamelle de microscopie (n° 1.5). Ajoutez 10 μL de support de montage humide dans les fossettes pendant que l’échantillon est encore présent et incubez-le dans l’obscurité pendant 10 à 15 min.
   REMARQUE : Pour cette étude, le milieu de montage contenait 0,9 μg/mL de 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) afin de raccourcir le protocole de coloration.
8. Retirez l’échantillon de la chambre de coloration et placez-le dans le récipient créé à l’étape 8.7. Appliquez 1 à 2 μL de média de montage sur l’échantillon.
   REMARQUE : la quantité de supports de montage a un impact sur la qualité de l’image à des grossissements élevés. Un support de montage excessif ou insuffisant peut compromettre la clarté de l’image.
9. Placez une autre lamelle sur le dessus et appuyez doucement pour vous assurer que l’échantillon entre en contact avec le verre. Conservez les échantillons à 4 °C dans l’obscurité jusqu’à l’imagerie microscopique.

Résultats

La figure 1 représente le dispositif expérimental, décrivant le processus de synthèse de GelMA par une réaction de méthacrylation. Le produit résultant a ensuite été utilisé pour fabriquer le substrat d’hydrogel, sur lequel les CE ont été ensemencés. Par la suite, les cellules ont été introduites dans la chambre d’écoulement pour une expérience d’écoulement de 6 h à 12 dyne/cm².

¹La spectroscopie RMN H a été utilis?...

Discussion

Le système vasculaire est un environnement dynamique où diverses forces influencent considérablement le comportement cellulaire. Il serait inexact d’étudier les événements biologiques dans les maladies cardiovasculaires sans tenir compte de ces forces. Ainsi, les modèles cellulaires capables d’émuler l’environnement mécanique vasculaire sont cruciaux. Les chercheurs ont déjà fait des progrès significatifs dans la mise en évidence de l’effet de ces forces sur le comportement cellulaire

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
(trimethoxysilyl)propyl methacrylate, tetramethylethylenediamine (TEMED)	Invitrogen	15524-010	Hydrogel Fabrication
3-(Trimethoxysilyl)Propyl Methacrylate	Sigma-Aldrich	440159	Glass Salinization
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)-containing mounting media	Vector Laboratories	H-1200	Immunostaining
Acetone	Thermo Fisher Scientifics	A18-4	GelMA Synthesis
Alexa Fluor 555 Phalloidin	Cell Signaling Technology	8953S	Immunostaining
Ammonium Persulfate (APS)	Bio-Rad	1610700	Hydrogel Fabrication
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet (45/64'')	McMaster-CARR	8560K165	Flow Chamber Fabrication
Confocal Microscope	Carl Zeiss Meditex AG	Zeiss LSM 800	Immunostaining
Covidien Monoject Rigid Pack 60 mL Syringes without Needles	Fisher	22-031-375	Flow Experiment
EC growth kit	American Type Culture Collection (ATCC)	PCS-100-041	Cell Culture
Ethanol 200 Proof	Decon Labs	2701	Glass Salinization
Gelatin Type A (300 bloom) from porcine skin	Sigma-Aldrich	G1890	GelMA Synthesis
Glacial Acetic Acid	Thermo Fisher Scientifics	9526-33	Glass Salinization
High-Purity High-Temperature Silicone Rubber Sheet	McMaster-Carr	87315K74	Flow Chamber Fabrication
Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)	American Type Culture Collection (ATCC)	PSC-100-010	Cell Culture
M3x30mm Machine Screws Hex Socket Round Head Screw 304 Stainless Steel Fasteners Bolts 20pcs	Uxcell	B07Q5RM2TP	Flow Chamber Fabrication
Masterflex L/S Digital Drive with Easy-Load® 3 Pump Head for Precision Tubing; 115/230 VAC	VWR	#MFLX77921-65	Flow Experiment
Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Puri-Flex, L/S 25; 25 ft	VWR	#MFLX96419-25	Flow Experiment
Methacrylic Anhydride (MAH)	Sigma-Aldrich	276685	GelMA Synthesis
Paraformaldehyde	Thermo Fisher Scientifics	043368.9M	Cell Culture
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Gibco	14080-055	General
Sodium Bicarbonate	Fisher Chemical	S233-3	GelMA Synthesis
Sodium Carbonate	Fisher Chemical	S263-500	GelMA Synthesis
SOLIDWORKS educational version
SOLIDWORKS Student Edition Desktop, 2023	SolidWorks	N/A	Flow Chamber Design
Vascular Basal Medium	American Type Culture Collection (ATCC)	PCS-100-030	Cell Culture