내피 세포 반응을 연구하기 위해 기질 강성과 흐름을 통합하는 시험관 내 모델

요약

우리는 관련 혈관 흐름 조건에서 혈관 내피 세포(EC)를 배양하기 위해 조정 가능한 젤라틴 기반 기질을 합성하고 특성화했습니다. 이 생체 모방 표면은 생리학적 및 병리학적 조건을 모두 복제하여 EC 행동에 대한 기계적 힘을 연구하고 혈관 건강 및 질병 메커니즘에 대한 이해를 증진합니다.

초록

우리는 혈관 건강과 죽상 동맥 경화증과 같은 질병의 발병을 이해하는 데 중요한 내피 세포(EC) 기능에 대한 조직 강성과 전단 응력의 결합된 효과를 조사하는 것을 목표로 하는 혁신적인 시험관 내 모델을 제시합니다. 전통적으로 연구는 전단 응력과 기판 강성이 EC에 미치는 영향을 독립적으로 탐구해 왔습니다. 그러나 이 통합 시스템은 이러한 요소를 결합하여 혈관 구조의 기계적 환경에 대한 보다 정확한 시뮬레이션을 제공합니다. 목표는 인간 EC를 사용하여 다양한 조직 강성 수준 및 흐름 조건에 걸쳐 EC 기계형질도입을 검사하는 것입니다. 우리는 조정 가능한 강성을 가진 젤라틴 메타크릴레이트(GelMA) 하이드로겔을 합성하고 밀도를 달성하기 위해 EC로 파종하기 위한 프로토콜을 자세히 설명합니다. 또한, 전산 유체 역학 시뮬레이션으로 보완된 비용 효율적인 유동 챔버의 설계 및 조립에 대해 설명하여 층류 및 적절한 전단 응력 수준을 특징으로 하는 생리학적 유동 조건을 생성합니다. 이 프로토콜은 또한 컨포칼 현미경 검사를 위한 형광 라벨링을 통합하여 조직 규정 준수 및 흐름 조건 모두에 대한 EC 반응을 평가할 수 있습니다. 이 모델은 배양된 EC를 여러 통합된 기계적 자극에 노출시킴으로써 고혈압 및 노화와 같은 요인이 EC 기능 및 EC 매개 혈관 질환에 어떤 영향을 미칠 수 있는지에 대한 포괄적인 조사를 가능하게 합니다. 이러한 연구에서 얻은 통찰력은 혈관 질환의 기저를 밝히고 효과적인 치료 전략을 개발하는 데 중요한 역할을 할 것입니다.

서문

혈관 내부 표면을 감싸고 있는 내피는 혈관 건강을 유지하는 데 중추적인 역할을 합니다. 내피 세포(EC)는 혈관 긴장도 조절, 선택적 투과성, 지혈 및 기계적 전달을 포함한 다양한 심혈관 기능을 조절하는 데 핵심적인 역할을 합니다 ^1,2. 연구는 EC 기능 장애를 죽상 동맥 경화증 발병의 주요 역할과 확고하게 연결했습니다. 특히, EC는 혈류 및 기저 혈관 조직과 상호 작용하는 계면에서 다양한 기계적 힘을 만납니다 ^3,4. 여러 연구에서 EC 기능 장애를 혈류 및 조직 강성으로 인한 유체 전단 응력과 같은 혈관 환경 내 기계적 요인의 비정상적인 변화와 연관시켰다 ^5,6,7.

그러나 선행 연구는 조직 강성과 전단 응력이 EC 기능에 미치는 복합적인 영향을 이해하는 데 제한적인 관심을 받았습니다. 연구 결과를 죽상동맥경화증 및 기타 심혈관 질환에 대한 효과적인 치료법으로 전환하는 능력을 향상시키기 위해서는 해당 분야에서 사용되는 세포 모델을 개선하는 것이 필수적입니다. 인간 EC를 사용하고 다양한 강성 수준 ^8,9,10을 가진 전단 응력 또는 기판에 적용함으로써 세포 모델을 인간화하는 데 상당한 진전이 이루어졌습니다. 그러나 동적 유동 환경을 조정 가능한 강성 특성을 가진 EC 기판과 통합하는 셀룰러 모델의 채택 및 개선은 천천히 진행되었습니다. 문제는 유로 내 유동 매개변수의 변경을 방지하는 동시에 온전하고 잘 접착된 EC 단층의 배양을 용이하게 하기 위해 팽창하지 않는 EC 기판을 고안하는 것입니다. 이러한 장애물을 극복할 수 있는 체외 모델은 고혈압, 노화 및 흐름 조건이 EC 기계전달, 혈관 건강, 그리고 궁극적으로 죽상동맥경화증의 발병에 어떻게 협력적으로 영향을 미치는지에 대한 보다 효과적인 연구를 촉진할 수 있습니다. 기판 강성을 제어하면서 셀에 전단 응력을 가하기 위해 회전판 및 미세유체 장치를 포함한 다양한 방법이 개발되었습니다. 회전판 방법에서는 셀이 두 판 사이에 배치되고 판의 회전 운동을 통해 전단 응력이 가해집니다. 이 방법은 덜 복잡하고 빠른 모델을 제공합니다. 그러나 공간 전단 응력 변동이 발생하며, 중심에서 전단 응력이 0이고 주변부(¹¹)에서 최대 전단 응력이 있습니다.

반면에, 미세유체 장치는 기판 강성과 흐름 조건을 제어할 수 있는 기능을 갖춘 차세대 공구를 대표합니다. 이 시스템은 층류 조건에서 미세혈관을 모방하는 데 적합합니다. 그러나, 이러한 장치로 죽상동맥경화증을 연구하는 것은 비실용적인데, 그 이유는 죽상동맥경화증이 흐름이 방해받은 큰 혈관에서 발생하기 때문이다¹¹. 이 논문은 다양한 유동 조건에서 EC 기판의 다양한 강성 수준의 영향을 조사할 수 있는 비용 효율적인 시스템을 제시함으로써 EC 연구의 중요한 연구 영역에 기여하는 것을 목표로 합니다. 이 시스템은 병리학적 및 생리학적 혈관을 모방하기 위해 다양한 강성을 가진 기판을 통합합니다. 이 프로토콜은 각각 생리학적 및 병리학적 강성을 나타내는 5kPa 및 10kPa의 팽창 및 강성 수준으로 젤라틴 기반 하이드로겔을 만드는 방법을 설명합니다. 또한, 이러한 기판을 통합할 수 있는 parallel-plate flow chamber의 구성이 상세합니다. 전산 유체 역학(CFD)을 사용하여 전단 응력과 유동 조건을 평가했습니다. EC 배양을 위한 하이드로겔 준비 및 6시간 흐름 실험 실행에 대해 설명한 후 실험 후 면역염색에 대해 논의합니다.

프로토콜

1. GelMA의 합성

1. 무수 탄산나트륨 0.2M 용액과 중탄산나트륨 0.2M 용액을 준비합니다.
2. 중탄산나트륨 용액 46mL와 탄산나트륨 용액 15mL를 섞고 탈이온수 139mL를 추가합니다. 필요한 경우 0.1M NaOH 및 HCl을 사용하여 pH를 9.5로 조정합니다.
3. 돼지 껍질에서 추출한 A형 300-블룸 젤라틴 10g을 100mL의 탄산염-중탄산염 완충액에 10% w/v 농도로 추가합니다.
4. 자기 교반기를 사용하여 700rpm에서 용액을 저어주면서 55°C 수조를 사용하여 젤라틴을 용해시킵니다. 완전히 용해되면 0.1M NaOH를 사용하여 젤라틴 용액의 pH를 9.5로 조정합니다.
5. 메타크릴화를 시작하려면 938μL의 무수메타크릴산(MAH)을 용액에 적가합니다. 젤라틴 용액에서 MAH의 초기 분포를 개선하여 중심에서 다양한 깊이와 반경 방향 거리를 포함한 다양한 위치에 주입합니다.
6. 빛에 노출되지 않도록 반응 용기를 알루미늄 호일로 감쌉니다. 온도를 55°C로 유지하고 용액을 500rpm에서 1시간 동안 교반하여 반응을 완료합니다(그림 1A)¹².
   참고: 반응은 pH 7.4 미만에서 멈춥니다.
7. 1.8L의 아세톤이 들어있는 2L 비커 1개와 0.3L의 아세톤이 들어있는 0.6L 비커 1개를 준비합니다.
8. 생성된 GelMA 용액을 200RPM으로 교반하면서 2L 비커에 적가하여 침전¹³을 유도합니다. 침전된 생성물의 수집을 최대화하려면 스테인리스강 막대 또는 주걱을 핵 형성 부위로 배치하여 더 쉽게 전달할 수 있습니다.
9. 큰 비커에서 작은 비커로 제품을 옮기고 건조 단계를 진행하기 전에 10분 동안 그대로 두십시오. 침전된 GelMA는 흰색 섬유로 나타나야 합니다.
10. 흡수지에 제품을 모아 실온(RT)의 진공 오븐에서 건조시킨 후 -20°C에서 보관하여 나중에 사용하십시오.
    참고: 양성자 핵 자기 공명(¹H NMR)을 통한 생성물의 화학적 특성화에 대한 추가 세부 사항은 이전에 발표된 연구⁸에서 찾을 수 있습니다.

2. 유리 염류화

참고: 하이드로겔을 유리 슬라이드에 부착하면 평평하고 균일한 표면이 제공되어 취급이 용이하고 유동 유래 전단 응력에서 안정성이 보장됩니다. 3-(트리메톡시실릴)프로필 메타크릴레이트로 유리를 기능화하는 것은 표면 특성을 향상시키고 중합 과정에서 하이드로겔의 공유 결합을 가능하게 하는 데 필요합니다.

1. 유리 절단기를 사용하여 일반 현미경 슬라이드(1mm 두께)를 최종 하이드로겔 치수와 유사한 조각으로 정밀하게 자릅니다. 절단된 슬라이드를 비누로 세척하여 유리 표면의 처리를 방해할 수 있는 표면 오염 물질과 부스러기를 제거합니다.
   알림: 필요한 경우 유리 슬라이드를 에탄올에서 5분 동안 초음파 처리한 다음 자연 건조합니다.
2. 절대 에탄올에 3-(트리메톡시실릴)프로필 메타크릴레이트의 0.5% 용액을 준비합니다. 탈이온수에 10% 빙초산 용액을 준비합니다. 용액을 혼합하여 3% 빙초산의 최종 농도를 얻습니다.
   참고: 빙초산 용액은 대량으로 준비하고 저장할 수 있습니다.
3. 유리 표면이 막히지 않도록 유리 용기에 유리 슬라이드를 정리합니다. 생성된 용액을 유리 슬라이드 위에 붓고 반응이 완료될 때까지 5rpm의 로커에서 약 80분 동안 유지합니다. 갇힌 기포를 제거하여 유리 슬라이드의 양쪽이 수정되었는지 확인합니다.
4. 반응이 완료된 후 용액을 흡인하고 유리 슬라이드를 에탄올 2배로 세척합니다. 슬라이드를 자연 건조하고 RT의 어두운 곳에 보관하십시오.
   알림: 유리 슬라이드는 이러한 조건에서 1개월 동안 수정 사항을 유지합니다.

3. 하이드로겔 제조

1. 산화 환원 유도 자유 라디칼 중합 방법을 사용하여 하이드로겔을 제작합니다.
   1. 적절한 깊이와 10mm2의 개방 창을 가진 2피스 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 금형을 조립하여 최종 기판을 형성합니다. 설계 과정에서 중합 후 하이드로겔 높이의 25% 수축을 설명합니다. 누출을 방지하기 위해 금형이 평평하고 하단과 상단 플레이트에 단단히 고정되어 있는지 확인하십시오.
      알림: 설계된 금형 치수는 의도적으로 의도한 하이드로겔 크기보다 10% 더 큽니다. 이 설계는 금형 분리 시 측면의 손상을 방지하고, 불순물이나 기포를 측면으로 밀어내어 하이드로겔의 표면 균일성을 향상시키고, 고도로 가교된 하이드로겔이 평형 후 물을 밀어내어 수축을 일으키는 시너렉시스 효과로 인해 평형 후 예상되는 25% 수축을 보상하는 등 다양한 용도로 사용됩니다. 수축량은 프로토콜 8에 명시되어^있습니다.
   2. 하이드로겔이 균일한 표면과 일정한 높이를 갖도록 하려면 금형의 상판에서 수정된 유리 슬라이드를 매달아 폴리머 용액을 주입하기 위한 좁은 개구부를 허용합니다. 커버 유리를 사용하여 수정된 유리 슬라이드를 매달아 놓습니다(그림 1B).
   3. 커버 유리를 만들려면 금형보다 20% 더 큰 일반 현미경 유리를 절단합니다. 짧은 면에 두 개의 스페이서를 부착합니다. 다음과 같이 스페이서 두께를 계산합니다.
      스페이서 두께 = 1.33 x 최종 겔 두께 + 1(개질 유리의 두께) - 금형 깊이
   4. 스페이서가 부착된 동일한 면에 커버 유리의 긴 면에 셀 호환 밀봉 그리스를 얇게 바릅니다.
   5. 수정된 유리 슬라이드를 두 스페이서 사이의 커버 유리에 부착합니다.
   6. 스페이서가 금형에 놓이고 수정된 유리가 금형 안으로 확장되도록 덮개 유리를 금형에 놓습니다. 이 설정은 개질된 유리와 금형 바닥 사이의 최종 하이드로겔 높이의 1.33의 간격을 제공합니다.
   7. 5kPa 및 10kPa 하이드로겔에 대해 각각 4% 및 10% w/v의 DI 물에 GelMA를 용해시키고 45°C 수조에 넣습니다.
      참고: GelMA는 감열성 폴리머이며 용액 온도를 45°C로 유지하면 중합 전 응고를 방지하고 플랫 하이드로겔 제조에 중요한 용액 점도를 줄일 수 있습니다.
   8. TEMED(5kPA 하이드로겔의 경우 24mM, 10kPa 하이드로겔의 경우 6.25mM)를 폴리머 용액에 넣고 잘 섞습니다.
      알림: TEMED 단독으로는 중합이 시작되지 않으므로 진행하기 전에 금형, 피펫 및 용액이 준비되었는지 확인하십시오.
   9. APS(5kPA 하이드로겔의 경우 24mM, 10kPa 하이드로겔의 경우 24.5mM)를 GelMA 용액에 넣고 잘 섞습니다.
      알림: APS를 추가하면 중합이 시작되고 하이드로겔이 빠르게 형성될 수 있으므로 결함이 있는 하이드로겔을 방지하기 위해 즉각적인 조치가 필요합니다. 강성 측정에 대한 자세한 내용은 이전에 발표된 연구^{자료 8}에서 확인할 수 있다.
   10. 생성된 용액을 매달린 유리 슬라이드와 RT의 금형 사이의 개구부에 조심스럽게 피펫팅하고 가교할 수 있도록 합니다. 모세관력은 폴리머 용액을 금형으로 밀어 넣습니다. 겔에 기포를 추가하지 말고 피펫 팁에 소량의 용액이 남아 있으면 피펫팅을 중지하십시오.
       참고: 중합 중에 GelMA의 메타크릴레이트 그룹은 변형된 유리 슬라이드에서 메타크릴레이트 잔기와 반응하여 하이드로겔이 유리에 화학적으로 부착됩니다.
   11. 15분 후 반응이 완료됩니다. 바늘과 같은 날카로운 물체를 사용하여 금형에서 기판을 분리하고 기판을 커버 유리에서 밀어서 분리합니다.
   12. 플라스틱 필름으로 밀봉된 100mm 페트리 접시에서 하이드로겔을 1x 인산염 완충 식염수(PBS)로 옮기고 37°C에서 평형을 이루어 남아 있는 반응물과 부산물을 제거합니다.
   13. 하이드로겔이 최종 치수보다 약간 크기 때문에 플로우 챔버 창에 필요한 치수와 일치하도록 측면의 여분의 겔을 트리밍합니다.
   14. 플로우 챔버를 사용하여 하이드로겔 치수를 확인합니다. 하이드로겔이 하이드로겔과 금형 사이의 틈이나 흐름 패턴에 영향을 줄 수 있는 결함 없이 흐름 챔버에 제대로 맞는지 확인하십시오. 플로우 챔버의 흐름 패턴에 영향을 줄 수 있는 불규칙한 모양이 있어 세포 거동에 불리한 영향을 미칠 수 있는 경우, 정적 조건을 위해 하이드로겔을 절약하십시오.
   15. 멸균을 위해 4개의 하이드로겔을 1x PBS가 들어 있는 페트리 접시에 옮깁니다.
2. 70% 에탄올을 사용하여 아래 설명과 같이 하이드로겔을 멸균합니다.
   1. 점진적인 하이드로겔 탈수를 위해 25%, 50% 및 70% 알코올 용액을 준비합니다.
      알림: 점진적인 탈수를 수행하지 않으면 더 뻣뻣한 하이드로겔이 수축되어 부서질 수 있으며 더 부드러운 하이드로겔 표면에 주름이 생길 수 있습니다.
   2. 하이드로겔이 포함된 페트리 접시에서 1x PBS 용액을 흡입합니다. 각 페트리 접시에 25% 에탄올 용액을 추가하여 5kPa 및 10kPa 하이드로겔을 15분 동안 담그십시오.
   3. 25% 알코올 용액을 흡입합니다. 각 페트리 접시에 50% 알코올 용액을 추가하여 5kPa 및 10kPa 하이드로겔을 15분 동안 담그십시오.
   4. 50% 알코올 용액을 흡인합니다. 각 페트리 접시에 70% 알코올 용액을 추가하고 5kPa 및 10kPa 하이드로겔을 5분 동안 담그십시오. 페트리 접시를 100rpm의 셰이커에 놓습니다.
   5. 5kPa 하이드로겔을 40분 동안 담가두고 10kPa 하이드로겔을 20분 동안 물에 담근 둡니다.
      참고: 5kPa 하이드로겔은 10kPa 하이드로겔에 비해 오염에 더 취약한 것으로 관찰되었습니다.
   6. 샘플을 생물 안전 캐비닛의 6-웰 플레이트로 옮기고 멸균 PBS를 사용하여 하이드로겔을 2x-3x 세척합니다.

4. 하이드로겔 코팅

1. 60mL의 멸균 PBS 50mL(마그네슘 및 칼슘 염 1x)에 젤라틴 3mg을 용해시켜 젤라틴 용액을 준비합니다. 용액을 37°C의 수조에서 30분 동안 또는 모든 젤라틴이 완전히 용해될 때까지 가열합니다.
2. 0.2μm 주사기 필터를 사용하여 코팅 용액을 멸균 여과합니다. 각 웰 플레이트에서 1x PBS 용액을 흡입하고 각 웰에 젤라틴 용액을 추가하여 각 하이드로겔이 완전히 커버되도록 합니다. 오염 위험을 최소화하려면 코팅 용액에 페니실린 40단위/mL와 스트렙토마이신 10μg/mL를 첨가합니다.
3. 각 웰 플레이트를 37°C, 5% CO₂ 인큐베이터에서 45분 동안 배양합니다. 1x PBS 용액으로 하이드로겔을 세척합니다.
4. PBS를 흡입하고 세포 배양 배지를 추가합니다.
5. 하이드로겔을 세포 배양 배지에 2일 이상 보관하지 않고 세포 파종까지 37°C, 5%_CO2 인큐베이터에서 배양합니다.
   참고: 피브로넥틴의 우수한 세포 부착 특성에도 불구하고, EC가 죽상동맥경화성 상태에서 내인성 피브로넥틴을 침착시키기 때문에 사용에 대한 우려가 있습니다. 이는 전염증 반응을 유발할 수 있습니다. 화학적으로 자극된 세포 반응을 피하기 위해 피브로넥틴의 사용을 자제합니다. 또한, Orr et al.은 피브로넥틴 코팅이 콜라겐 I 코팅에 비해 죽상생성 유전자를 상향 조절한다는 것을 입증했습니다. 구체적으로, 그들은 세포간 접착 분자 1(ICAM-1), 혈관 세포 접착 분자 1(VCAM-1) 및 핵 인자-κB(NF-κB)¹⁴의 발현 수준이 증가하는 것을 관찰했습니다.

5. 기판에 세포 파종

1. 사용 가능한 분리 프로토콜에 따라 세포 현탁액을 준비하고 혈구계⁸을 사용하여 세포를 계수합니다.
2. 하이드로겔에서 매체를 완전히 흡인합니다. 각 샘플에 50,000 cells/cm2를 추가합니다. 세포 넘침을 방지하기 위해 각 샘플에 적절한 양의 세포 현탁액을 추가합니다.
   참고: 더 뻣뻣한 기판은 더 소수성입니다. 따라서 기판 표면의 습윤성과 세포 현탁액 분산을 개선하기 위해 단계 사이의 시간을 최소화하십시오.
3. 세포 씨를 뿌린 하이드로겔을 37°C, 5% CO₂ 인큐베이터에서 2시간 동안 배양합니다. 세포가 겔에 부착되면 샘플에 세포 배양 배지를 추가합니다.

6. 플로우 챔버 제작

참고: 플로우 챔버를 설계하는 접근 방식은 비용 효율적이며 제조 및 활용을 위한 최소한의 전문 지식이 필요합니다.

1. 챔버 제작에 폴리(메틸 메타크릴레이트)를 사용하여 유동 품질, 전단 응력 하에서의 하이드로겔 무결성 및 유동 실험 중 잠재적인 실시간 바이오마커 연구를 시각적으로 평가할 수 있습니다. 챔버 설계는 CAD(Computer-Aided Design) 소프트웨어를 사용하여 생성되었습니다. 유동 챔버는 특허를 출원하고 있으며, 이 장치에 대한 자세한 내용은 본 프로토콜에서 공개할 수 없습니다.
2. flow chamber의 흐름 조건에 대한 전산 평가
   1. 설계된 플로우 챔버(flow chamber)의 개별 구성 요소를 조립합니다(. SLDPRT 파일)을 사용하여 최종 챔버 설정을 만들 수 있습니다.
   2. 하이드로겔 표면에 접하는 유동의 중심선을 따라 선을 그려 전단 응력을 분석합니다. 입구와 출구 개구부를 닫아 닫힌 제어 볼륨을 정의합니다.
   3. CAD 소프트웨어의 애드인(Add-Ins) 탭에서 Flow Simulation을 엽니다. Flow Simulation 탭에서 마법사 기능을 열어 속성을 입력합니다. 단위계를 지정하고 압력과 응력 단위를 dyne/cm²로 조정합니다.
   4. 물리적 특징에서 유체 흐름 과 중력 을 확인합니다. Z 구성 요소에서 중력을 -9.8로 설정합니다. X 및 Y 구성 요소는 0이어야 합니다.
   5. 형상 처리(Geometry Handling)에서 해석 유형으로 내부(Internal )를 선택합니다. 물을 기본 유체로 선택합니다.
      참고: 매체가 물처럼 동작한다고 가정합니다.
   6. 흐름 유형으로 Laminar(층류)와 Turbulent(터뷸런스 )를 선택합니다. 벽을 단열 벽으로 정의하고 벽 조건(Wall Condition)에 표면 거칠기를 입력합니다.
   7. 초기 조건에서 온도를 37.5°C(310.65K)로 설정합니다. Flow Simulation 프로젝트에서 계산 도메인을 정의하여 전체 제어 볼륨을 포함하도록 합니다.
   8. 유체와 접하는 모든 벽을 선택하여 유체 하위 도메인을 정의합니다. 경계 조건(Boundary Condition)에서 입구 덮개의 내부 표면을 입구 체적 흐름(Inlet Volume Flow)으로 지정하고 유속(Q) 및 균일 흐름을 지정합니다. 그런 다음 출구 덮개 밀봉의 내부 표면을 정압으로 지정합니다.
   9. 사용 가능한 계산 리소스를 기반으로 Global Mesh Size를 결정합니다. 실행 을 눌러 시뮬레이션을 시작합니다.
   10. 완료되면 전단 응력 플롯 및 유동 시뮬레이션을 포함하여 원하는 결과를 검토합니다.
   11. 다양한 유량으로 6.2.8-6.2.10단계를 반복하여 다양한 유량으로 적용된 전단 응력을 계산합니다. 회귀 분석을 사용하여 유속-전단 응력 관계를 설정합니다.
   12. 하이드로겔 치수의 변동에 대한 시스템의 허용 오차를 평가하여 시뮬레이션의 사실성을 향상시킵니다.

7. 균일 한 층류를 실행하십시오.

1. 5kPa 및 10kPa 하이드로겔에서 세포를 배양한 후 37°C, 5%_CO2 인큐베이터에서 세포 단층이 합류하는지 확인합니다. 각 하이드로겔에 세포의 단층을 달성해야 합니다.
2. 평행판 흐름 챔버 시스템의 오토클레이브 가능한 구성 요소(스테인리스강 나사, 주걱, 집게, 개스킷 및 미디어 저장소)를 30분 중력 오토클레이브 주기로 멸균합니다. 다른 부품(아크릴 구성 요소 및 저장소 밀봉기/dampers)을 UV 광선 노출로 사용합니다.
3. 플로우 챔버 장치를 생물 안전 캐비닛에 조립합니다. 하이드로겔 샘플을 장치에 고정하여 균일성을 보장합니다. 흐름에 사용할 수 있는 샘플 수가 충분하지 않은 경우 하이드로겔과 동일한 크기의 충전기를 사용하십시오.
4. 챔버의 내부 표면과 하이드로겔 표면을 미리 적셔 기포 형성을 최소화하고 조립 중 셀 건조를 방지합니다.
5. 입구 저장소에 충분한 미디어를 추가하여 조립 시 미디어의 20%-30%가 출구 저장소로 흐르도록 합니다. d를 사용하여 입구 저장소를 밀폐하십시오.amp어/실러.
   알림: 입구 저장소의 압력 상승은 흐름을 주도하고 공기 누출은 유량을 변경합니다. 외부 튜브에 기포가 형성되면 씰러 결함이 있는지 확인하십시오.
6. 출구 d를 설정amper을 대기압으로 설정하여 압력 차이를 설정합니다. 장치와 저장소를 37°C, 5% CO₂ 인큐베이터에 넣습니다. 장치 튜브를 인큐베이터 외부에 배치된 연동 펌프에 연결합니다(그림 1C).
7. 펌프를 켜서 3.6 dyne/cm²를 적용하기 시작합니다. 약 8 dyne/cm²를 적용할 때까지 유속을 2mL/분 단위로 점차적으로 증가시킵니다(예: 10분 후 65mL/분에서 85mL/분에 도달).
8. 전단 응력의 12 dyne/cm² 에 도달할 때까지 유속을 2.5mL/분 단위로 더 증가시킵니다.
   알림: 빠른 유속 증가는 세포를 분리하고 단층을 손상시킬 수 있으므로 세포가 동적 조건에 적응할 시간을 허용하십시오.
9. 6시간 후 흐름을 중지하고 인큐베이터에서 장치를 제거한 다음 흐름 챔버를 분해합니다. 그 후, 하이드로겔 샘플을 6웰 플레이트로 옮깁니다.
10. 얼음처럼 차가운 PBS로 샘플을 세척하고 면역염색을 위해 세포를 고정하거나 단백질 분리를 위해 용해합니다.

8. 고배율 공초점 현미경 검사를 위한 면역염색 설정

참고: 연구 효율성을 높이기 위해 하이드로겔의 소량을 면역염색하는 방법이 개발되어 단일 샘플에서 여러 생물학적 표적을 검사할 수 있습니다.

1. 직경이 3mm 또는 4mm인 생검 펀치 또는 선호하는 절삭 공구를 준비합니다.
2. 피펫 팁 상자를 염색 챔버로 사용하십시오. 장시간 배양 중에 염색 용액 증발을 제어하기 위해 챔버를 가습하여 피펫 팁 상자 바닥에 젖은 종이 타월을 놓습니다.
3. 개별 샘플에 대한 작은 용액 풀을 만들어 항체 소비를 줄입니다. 팁 박스 랙을 투명 필름으로 덮고 손가락 끝으로 필름을 랙 구멍에 대고 부드럽게 눌러 보조개를 만듭니다. 딤플에 70μL의 PBS를 채웁니다.
4. 개별 하이드로겔을 빈 페트리 접시에 옮기고 생검 펀치 또는 선호하는 절단 도구를 사용하여 절단합니다. 현미경을 사용하여 대표적인 샘플 영역을 절단합니다. 컨포칼 현미경 문제를 피하기 위해 전체 겔 실린더를 절단합니다.
5. 절단된 하이드로겔 샘플을 8.3단계에서 생성된 딤플에 넣습니다. 표준 프로토콜¹⁵에 따라 염색을 수행합니다. 최종 염색 세척 후 하이드로겔 두께에 맞는 실리콘 고무 시트를 얻습니다.
   알림: 가급적이면 밀봉 향상을 위해 한쪽 끈적한 면이 있는 시트를 사용하십시오. 이 연구에서는 1:20으로 희석하여 Phalloidin에 접합된 형광 2차 항체를 사용하여 액틴 섬유를 염색했습니다.
6. 고무 시트를 15mm x 15mm 정사각형으로 자릅니다. 생검 펀치 또는 선호하는 절단 도구를 사용하여 6mm 구멍을 뚫습니다.
7. 현미경 커버슬립(no. 1.5)에 고무를 부착하여 샘플 용기를 만듭니다. 샘플이 아직 존재하는 동안 10μL의 습식 장착 매체를 딤플에 추가하고 10-15분 동안 어두운 곳에서 배양합니다.
   참고: 이 연구를 위해 장착 매체에는 염색 프로토콜을 줄이기 위해 0.9μg/mL의 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)이 포함되었습니다.
8. 염색 챔버에서 샘플을 제거하고 8.7단계에서 만든 용기에 넣습니다. 시료 위에 1-2 μL의 장착 매체를 도포합니다.
   참고: 마운팅 미디어의 양은 고배율에서 이미지 품질에 영향을 미칩니다. 과도하거나 불충분한 장착 미디어는 이미지 선명도를 손상시킬 수 있습니다.
9. 다른 커버슬립을 위에 놓고 샘플이 유리에 닿도록 부드럽게 누릅니다. 현미경 이미징을 할 때까지 샘플을 4 °C의 어두운 곳에 보관하십시오.

결과

그림 1 은 메타크릴화 반응을 통한 GelMA 합성 과정을 개략적으로 보여주는 실험 설정을 보여줍니다. 그런 다음 생성된 생성물을 사용하여 하이드로겔 기판을 제조하고 그 위에 EC를 파종했습니다. 그 후, 세포를 12 dyne/^cm2에서 6시간 흐름 실험을 위해 흐름 챔버에 도입했습니다.

¹ 개H NMR 분광법을 사용하여 메타크릴레이화 반응의 성공을 평...

토론

혈관계는 다양한 힘이 세포 행동에 큰 영향을 미치는 역동적인 환경입니다. 이러한 힘을 고려하지 않고 심혈관 질환의 생물학적 현상을 연구하는 것은 부정확합니다. 따라서 혈관의 기계적 환경을 모방할 수 있는 세포 모델이 중요합니다. 연구자들은 이미 이러한 힘이 세포 행동에 미치는 영향을 강조하는 데 상당한 진전을 이루었습니다¹¹. 그러나 인체의 병리학적 및 생리학적 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
(trimethoxysilyl)propyl methacrylate, tetramethylethylenediamine (TEMED)	Invitrogen	15524-010	Hydrogel Fabrication
3-(Trimethoxysilyl)Propyl Methacrylate	Sigma-Aldrich	440159	Glass Salinization
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)-containing mounting media	Vector Laboratories	H-1200	Immunostaining
Acetone	Thermo Fisher Scientifics	A18-4	GelMA Synthesis
Alexa Fluor 555 Phalloidin	Cell Signaling Technology	8953S	Immunostaining
Ammonium Persulfate (APS)	Bio-Rad	1610700	Hydrogel Fabrication
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet (45/64'')	McMaster-CARR	8560K165	Flow Chamber Fabrication
Confocal Microscope	Carl Zeiss Meditex AG	Zeiss LSM 800	Immunostaining
Covidien Monoject Rigid Pack 60 mL Syringes without Needles	Fisher	22-031-375	Flow Experiment
EC growth kit	American Type Culture Collection (ATCC)	PCS-100-041	Cell Culture
Ethanol 200 Proof	Decon Labs	2701	Glass Salinization
Gelatin Type A (300 bloom) from porcine skin	Sigma-Aldrich	G1890	GelMA Synthesis
Glacial Acetic Acid	Thermo Fisher Scientifics	9526-33	Glass Salinization
High-Purity High-Temperature Silicone Rubber Sheet	McMaster-Carr	87315K74	Flow Chamber Fabrication
Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)	American Type Culture Collection (ATCC)	PSC-100-010	Cell Culture
M3x30mm Machine Screws Hex Socket Round Head Screw 304 Stainless Steel Fasteners Bolts 20pcs	Uxcell	B07Q5RM2TP	Flow Chamber Fabrication
Masterflex L/S Digital Drive with Easy-Load® 3 Pump Head for Precision Tubing; 115/230 VAC	VWR	#MFLX77921-65	Flow Experiment
Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Puri-Flex, L/S 25; 25 ft	VWR	#MFLX96419-25	Flow Experiment
Methacrylic Anhydride (MAH)	Sigma-Aldrich	276685	GelMA Synthesis
Paraformaldehyde	Thermo Fisher Scientifics	043368.9M	Cell Culture
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Gibco	14080-055	General
Sodium Bicarbonate	Fisher Chemical	S233-3	GelMA Synthesis
Sodium Carbonate	Fisher Chemical	S263-500	GelMA Synthesis
SOLIDWORKS educational version
SOLIDWORKS Student Edition Desktop, 2023	SolidWorks	N/A	Flow Chamber Design
Vascular Basal Medium	American Type Culture Collection (ATCC)	PCS-100-030	Cell Culture