JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تعتمد وظائف بروتينات عائلة الدينامين الفائقة على التغيرات التوافقية إلى جانب التحلل المائي GTP. يتم وصف النظام باستخدام تقنية FRET أحادية الجزيء (smFRET) لمراقبة الديناميكيات التوافقية ل GTPase atlastin الشبيه بالديناميات في حالات تحميل النيوكليوتيدات المختلفة.

Abstract

يعد دوران الجسم الصلب للمجال الأوسط ثلاثي الحلزونات (3HB) بالنسبة إلى مجال GTPase لبروتين أتلاستين شبيه بالدينامين (ATL) محركا حاسما لاندماج الغشاء المتماثل داخل الشبكة الإندوبلازمية (ER). ارتبطت الاضطرابات في هذه العملية بالشلل النصفي التشنجي الوراثي (HSP) ، وهو اضطراب تنكسي عصبي. تشير الدراسات الهيكلية والكيميائية الحيوية إلى أن التغييرات التوافقية في ATL مرتبطة بالتحلل المائي GTP ، لكن التصور في الوقت الفعلي لهذه الديناميكيات التوافقية خلال دورة التحلل المائي GTP لا يزال يمثل تحديا. لفهم الآليات الميكانيكية الكامنة وراء وظيفة ATL بشكل أفضل ، تم استخدام نقل طاقة الرنين Förster أحادي الجزيء (smFRET). تم استخدام ثلاث استراتيجيات محددة لشل حركة المنطقة العصارية الخلوية الطرفية N من ATL1 البشري (ATL1cyto) في غرفة ميكروفلويدية مطلية بالستربتافيدين ، مما يسهل تطبيق التصوير داخل الجزيئات وبين الجزيئات smFRET. سمح ذلك بالمراقبة الدقيقة لمطابقات البروتين في حالات تحميل النيوكليوتيدات المختلفة ، مما يوفر رؤى مباشرة للسلوكيات الجزيئية الفردية. يمكن تطبيق هذه الطريقة لدراسة البروتينات الكيميائية الميكانيكية الأخرى أيضا.

Introduction

في الخلايا حقيقية النواة ، تتوسط بروتينات عائلة الدينامين الفائقة في إعادة تشكيل الأغشية البيولوجية ، بما في ذلك الأنابيب الغشائية ، والانشطار ، والاندماج1،2،3. تؤدي الطفرات في هذه البروتينات إلى مجموعة متنوعة من الأمراض البشرية ، مثل الأمراض التنكسية العصبية. عادة ما تحتوي أعضاء عائلة الديناميات الفائقة على مجال GTPase ، ومجال متوسط يتكون من حزم حلزونية ، وحزاف لربط الغشاء ، ومجال مستجيب GTPase (GED). أحد هذه GTPase الشبيهة بالدينامين هو atlastin (ATL) ، الذي يحفز اندماج الغشاء المتماثل للشبكة الإندوبلازمية (ER) لتشكيل شبكة4،5،6،7،8،9،10. هناك ثلاثة ATLs (ATL1-3) في الثدييات. يتكون جزيء ATL من منطقة العصارة الخلوية الطرفية N (خلوية ATL) ، بما في ذلك مجال GTPase ومجال متوسط ثلاثي الحلزونات (3HB) ، متبوعا بمنطقتين عبر الغشاء ، ولكنه يفتقر إلى GED النموذجي. بدلا من ذلك ، يحتوي ATL على ذيل طرفي C يلعب دورا مهما في اندماج الغشاء11،12،13.

تم الإبلاغ عن أن الاندماج الغشائي الفعال يعتمد على إعادة ترتيب المجال المعتمد على التحلل المائي GTP في ATLcyto14،15،16،17،18،19،20. ومع ذلك ، بالمقارنة مع مجمع SNARE ، الذي يستخدم طاقة قابلة للطي من التغييرات التوافقية لدفع اندماج الغشاء غير المتجانس21 ، فإن عملية اندماج الغشاء المتماثل بوساطة ATL والبروتينات الأخرى الشبيهة بالدينامين الخاصة بالاندماج22 لا تزال بعيدة المنال. تم تحديد ثلاثة هياكل بلورية ل ATL1cyto البشري في ظروف تحميل النيوكليوتيداتالمختلفة 14،15،16،23. في الهياكل ، يشير الاثنان 3HBs في الثنائي في اتجاهات مختلفة ، ولكن لا يزال نموذجا شاملا يشرح كيفية اقتران الديناميكيات التوافقية ل ATLcyto ونشاط GTPase الخاص به مفقودا.

في النموذج السابق ، تشكل جزيئات ATL الأحادية ثنائيات عبر أغشية مختلفة بطريقة تعتمد على GTP لدفع اندماج الغشاء. هنا ، يتم وصف ثلاث استراتيجيات لتطبيق نقل طاقة رنين فورستر أحادي الجزيء (smFRET) لمراقبة سلوك جزيئاتATL1 cyto الفردية واكتشافها بدقة. smFRET هي تقنية قوية تستخدم على نطاق واسع للتحقيق في الديناميكيات التوافقية والتفاعلات للجزيئات الحيوية الفردية في الوقت الفعلي ، مثل تنشيط β-arrestin بوساطة GPCR24 ، وإعادة تشكيل الكروماتين بواسطة Snf225 ، وإعادة ترتيب المجال للبروتين الشبيه بالدينامين MxA إلى جانب دورات التحلل المائي GTP26. نظرا لأن smFRET يمكنه فقط اكتشاف التغيرات في المسافة من ~ 3 نانومتر إلى ~ 8 نانومتر بشكل فعال ، فإن كل من تجارب smFRET بين الجزيئات وداخل الجزيئات مطلوبة لتحليل شامل لمطابقات ATL1cyto لكل حالة تحميل النيوكليوتيدات. لقد أنشأنا ثلاثة تركيبات من ATL1cyto مع استبدال جميع السيستين الأصليين بالألانين و K400 (ATL1cyto-K) أو زوج T51 / K400 (ATL1cyto-TK) المتحور إلى السيستين لوضع العلامات على الفلوروفور. يتم عرض استراتيجيات تثبيت ثنائي أو مونومر ATL1cyto في غرفة الموائع الدقيقة المطلية بالستربتافيدين (الشكل 1 أ) لتجارب smFRET بين الجزيئات أو داخل الجزيئات في الشكل 1B-D. توفر هذه الطريقة مزيدا من التفاصيل حول الديناميكيات التوافقية للبروتينات الشبيهة بالدينامين في كل خطوة من خطوات التحلل المائي GTP27.

Protocol

تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد.

1. إعداد غطاء معدل لغرفة تثبيت البروتين

  1. اعداد
    1. قم بإعداد 50 مل من محلول سمكة المفترسة (يتكون من حمض الكبريتيك المركز وبيروكسيد الهيدروجين بنسبة 3: 1) عن طريق إضافة بيروكسيد الهيدروجين ببطء إلى حامض الكبريتيك المركز لمنع درجات الحرارة الزائدة. ضعه بعناية في غطاء الدخان.
    2. تحضير محلول إيثوكسيد الصوديوم. قم بإذابة 2 جم من هيدروكسيد الصوديوم في 15 مل من ddH2O ، وأضف 35 مل من الإيثانول المطلق ، واخلطه تماما. اتركيه في درجة حرارة الغرفة.
    3. تحضير محلول عالي الملح (0.1 متر من NaHCO3 و 0.6 م من K2SO4). تذوب تماما وتؤخذ 500 ميكرولتر / أنبوب. يحفظ في -20 درجة مئوية.
    4. Aliquot SVA-mPEG و SVA-mPEG-biotin في حوالي 30 مجم لكل أنبوب و 3 ملغ لكل أنبوب. يحفظ في -20 درجة مئوية.
    5. قم بتخصيص شرائح المجهر (75 مم × 26 مم × 1 مم) مع 6 أزواج من الثقوب بقطر 1.2 مم.
  2. تنظيف سطح الغطاء
    1. استخدم الملقط لالتقاط ثمانية أغطية ووضعها في وعاء تلطيخ. أضف الأسيتون (~ 50 مل) لتغطية الغطاء ، ضع برطمان التلوين في منظف بالموجات فوق الصوتية لمدة 30 دقيقة ، ثم اشطف الغطاء ثلاث مرات باستخدام ddH2O.
    2. اغسل الغطاء بالميثانول كما في الخطوة 1.2.1.
    3. أضف محلول سمكة البيرانا (الخطوة 1.1.1) إلى برطمان التلوين وقم بتسخينه في غلاية حمام مائي 95 درجة مئوية لمدة ساعتين. بعد أن يبرد برطمان التلوين إلى درجة حرارة الغرفة ، اشطف الغطاء ست مرات على الأقل باستخدام ddH2O.
    4. أضف محلول إيثوكسيد الصوديوم في جرة التلوين ، ضعه في منظف بالموجات فوق الصوتية لمدة 15 دقيقة ، ثم اشطفه ثلاث مرات باستخدام ddH2O.
    5. أضف ddH2O إلى برطمان التلوين لتغطية أغطية الغطاء ، ضعه في منظف بالموجات فوق الصوتية لمدة 15 دقيقة ، ثم اشطفه 3 مرات باستخدام ddH2O.
  3. تعديل Aminosilanization لسطح الغطاء.
    1. قم بتثبيت الأغطية في جرة التلوين على مقعد نظيف ، وجففها بالنيتروجين ، وضعها في وعاء تلطيخ آخر (مجفف مسبقا).
    2. تخبز برطمان التلوين في فرن تجفيف على حرارة 120 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، ثم تبرد إلى درجة حرارة الغرفة في مجفف.
    3. أضف 47.5 مل من الميثانول ، و 2.5 مل من حمض الأسيتيك ، و 0.5 مل من 3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES) إلى الدورق (المجفف مسبقا) ، واخلطه بالتساوي ، وأضفه إلى برطمان التلوين ، واحتضنه لمدة 10 دقائق.
    4. اشطف الأغطية في جرة التلوين باستخدام ddH2O ثلاث مرات على الأقل وصوتنة لمدة 5 دقائق.
    5. أخرج الأغطية واحدة تلو الأخرى ، واشطفها ب ddH2O ، وجففها بالنيتروجين ، وضعها في طبق بتري بقطر 10 سم للتحضير لتعديل PEG.
      ملاحظة: يجب إجراء تعديل APTES في بيئة جافة.
  4. تعديل سطح الغطاء باستخدام SVA-mPEG-Biotin و SVA-mPEG
    ملاحظة: يساعد تعديل البيوتين لسطح الغطاء على الاحتفاظ بالبروتينات الحيوية (أو البروتينات المرتبطة بالبيوتين المضاد له) عبر الستربتافيدين.
    1. قم بإذابة SVA-mPEG و SVA-mPEG-Biotin المعبأة في محلول عالي الملح (1 مجم يعادل 10 ميكرولتر محلول عالي الملح) تماما. أضف محلول SVA-mPEG-Biotin إلى محلول SVA-mPEG بنسبة 1:100.
      ملاحظة: استخدم دوامة لهز المحلول للتأكد من إذابة SVA-mPEG أو SVA-mPEG-Biotin تماما. يجب تحضير المحلول المائي SVA-mPEG أو SVA-mPEG-Biotin قبل الاستخدام.
    2. قم بإسقاط محلول المزيج المحضر على غطاء وقم بتغطيته بغطاء آخر. يجب أن تمنع هذه العملية تكوين الفقاعات. احتضان الغطاء بالكامل مع الرطوبة المناسبة لأكثر من 2 ساعة أو بين عشية وضحاها.
    3. افصل الغطاء بعد اكتمال التعديل ، واشطفه باستخدام ddH2O ، وجففه بالنيتروجين. ضع علامة على سطح الغطاء الذي لم يتم تعديله باستخدام SVA-mPEG و SVA-mPEG-biotin.
    4. ضع الغطاء المعدل بعناية في أنبوب جهاز طرد مركزي دقيق سعة 50 مل. يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية بعد التنظيف بالمكنسة الكهربائية.
      ملاحظة: يمكن تخزين الغطاء المعدل تحت الفراغ لمدة 1 شهر.

2. تحضير شرائح المجهر لغرفة تثبيت البروتين

  1. اغسل شرائح المجهر كما هو موضح للغطية في الخطوة 1.2.
  2. انفخ شرائح المجهر تجف بالنيتروجين وضعها في أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة سعة 50 مل.
  3. قم بتخزين شرائح المجهر كما هو موضح في الخطوة 1.4.4.

3. التعبير عن البروتين وتنقية

  1. اعداد
    1. البلازميدات: استنساخ عضو عائلة أتلاستين محل الاهتمام أو الطفرة المسببة للأمراض ذات الأهمية في ناقل التعبير البكتيري ، على سبيل المثال ، pET-28a ، وإضافة Avitag27. أدخل السيستين في المواضع ذات الصلة عن طريق الطفرات الموجهة للموقع (على سبيل المثال ، T51C و K400C27).
    2. قم بإعداد المخازن المؤقتة التالية.
      1. وسط استزراع لوريا بيرتاني (LB): اخلطي 10 جم من التربتون و 5 جم من مستخلص الخميرة و 10 جم من كلوريد الصوديوم في 1 لتر من ddH2O. الأوتوكلاف عند 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
      2. مخزن التحلل: امزج 25 ملي مولار من HEPES (درجة الحموضة 7.4) ، و 150 ملي مولار من KCl ، و 5 ملي من MgCl2 ، و 1x كوكتيل مثبط البروتياز الخالي من EDTA ، و 10 ملي مولار من الإيميدازول ، و 0.5 ملي مولار من TCEP. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
      3. محلول الغسيل: امزج 25 ملي مولار من HEPES (درجة الحموضة 7.4) ، و 150 ملي مولار من KCl ، و 5 ملي من MgCl2 ، و 30 ملي مولار من إيميدازول ، و 0.5 ملي من تريس (2-كربوكسي إيثيل) هيدروكلوريد الفوسفين (TCEP). يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
      4. المخزن المؤقت Elute : امزج 25 ملي مولار من HEPES (درجة الحموضة 7.4) ، و 150 ملي مولار من KCl ، و 5 ملي من MgCl2 ، و 150 ملي مولار من إيميدازول ، و 0.5 ملي مولار من TCEP. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
      5. مخزن التنقية: 25 ملي مولار من HEPES (الرقم الهيدروجيني 7.4) ، 150 ملي مولار من KCl ، 5 ملي مولار من MgCl2 ، 0.5 ملي مولار من TCEP. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  2. تنقية البروتين
    1. انقل البلازميدات27 إلى خلايا الإشريكية القولونية Rosetta (DE3) (Biomed) باستخدام طرق الصدمة الحرارية للتحول البكتيري. قم بتعليق الخلايا المنقولة في وسط زراعة LB بتركيز نهائي قدره 50 ميكروغرام / ميكرولتر من الكاناميسين المضاف.
      1. استزراع عند 37 درجة مئوية حتى امتصاص وسط الاستزراع عند 600 نانومتر هو 0.6-0.8. أضف الأيزوبروبيل-β-د-ثيوغالاكتوسيد (IPTG) بتركيز نهائي قدره 50 ميكرومتر للحث على تعبير البروتين عند 16 درجة مئوية لمدة 20-24 ساعة.
        ملاحظة: يمكن مراقبة معدل نمو مزارع الخلايا البكتيرية أو الميكروبية الأخرى عن طريق قياس الكثافة البصرية (الامتصاص) لثقافة نمو الخلية عند 600 نانومتر.
    2. حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 4000 × جم لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الطافية.
    3. أعد تعليق حبيبات الخلية ب 30 مل من المخزن المؤقت للتحلل. قم بتعطيل الخلايا ثلاث مرات باستخدام كسارة خلوية عالية الضغط.
    4. قم بتوضيح المحللات عن طريق الطرد المركزي عند 2،00،000 × جم لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية باستخدام دوار جهاز طرد مركزي فائق.
    5. اعزل البروتين باستخدام عمود Ni-NTA. اغسل عمود Ni-NTA بمخزن مؤقت للغسيل لمدة 5 أحجام أعمدة. بروتين الشطف مع المخزن المؤقت للشطف لحجم عمود واحد. اجمع التحفيص والتركيز باستخدام مرشحات الطرد المركزي إلى ~ 500 ميكرولتر.
    6. علاوة على ذلك ، قم بتنقية البروتين حسب حجم استبعاد الكروماتوغرافيا27. اجمع المصف (500 ميكرولتر لكل أنبوب).
    7. تأكد من البروتين المستهدف من خلال وزنه الجزيئي الذي يحدده الرحلان الكهربائي لجل دوديسيل كبريتات الصوديوم - بولي أكريلاميد (SDS-PAGE) 27. اجمع البروتين المستهدف لمزيد من التعديل.

4. بروتين البيوتينيل

  1. اعداد
    1. قم بإعداد حلول المخزون التالية.
      1. قم بإذابة أسيتات المغنيسيوم رباعي هيدرات (MgOAc · 4 ساعة2O) في 25 ملي مولار من محلول HEPES (الرقم الهيدروجيني 7.7) بتركيز 100 ملي مولار (10×). Aliquot 100 ميكرولتر لكل أنبوب وتخزينه في -20 درجة مئوية.
      2. قم بإذابة ملح ثنائي الصوديوم الأدينوزين 5-ثلاثي الفوسفات (ATP) في ddH2O بتركيز 100 ملي مولار (10×). اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم. Aliquot 100 ميكرولتر لكل أنبوب وتخزينها في -80 درجة مئوية.
      3. قم بإذابة d-biotin في ddH2O بتركيز 500 ميكرومتر. Aliquot 100 ميكرولتر لكل أنبوب وتخزينه عند -20 درجة مئوية.
      4. قم بإذابة الستربتافيدين في ddH2O بتركيز 1 مجم / مل. Aliquot 20 ميكرولتر لكل أنبوب وتخزينه عند -20 درجة مئوية.
    2. المخزن المؤقت لبيوتينيل البروتين: أضف 25 ملي مولار من HEPES (درجة الحموضة 7.7) ، و 200 ملي مولار من حمض الجلوتاميك البوتاسيوم ، و 0.5 ملي مولار من TCEP. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
    3. تنقية بير أ بيوتين ليجاز وتخزينها في -80 درجة مئوية.
  2. بيوتينيل البروتين
    1. قم بتغيير المخزن المؤقت للبروتين إلى المخزن المؤقت للبروتين الحيوي. للبيوتينيل ، امزج 100 ميكرولتر من 100 ملي مولار ATP ، 100 ميكرولتر من 100 ملي مولار MgOAc ، 100 ميكرولتر من 500 ميكرومتر d-biotin ، 10 ميكرولتر من 100 ميكرومتر من BirA biotin ligase ، 50 ميكرومتر من البروتين إلى الحجم النهائي البالغ 1 مل واحتضانه طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
    2. قم بإزالة d-biotin الحر باستخدام مرشح طرد مركزي 10 K MWCO.
    3. احتضان 20 ميكرولتر من البروتين الحيوي مع 20 ميكرولتر 15 ميكرومتر من الستربتافيدين لمدة 20 دقيقة على الثلج. الكشف عن كفاءة بيوتينيل البروتين بواسطة SDS-PAGE27.

5. وضع العلامات على بروتين فلوروفور

  1. اعداد
    1. قم بإذابة الفلوروفورات LD555 (المانح) و LD655 (المتقبل) في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) إلى تركيز نهائي يبلغ 5 ملي مولار. يحفظ في -20 درجة مئوية.
    2. تحضير المخزن المؤقت لوضع العلامات: امزج 25 ملي مولار من HEPES (درجة الحموضة 7.4) ، و 150 ملم من KCl ، و 5 ملي من MgCl2. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
    3. قم بتغيير المخزن المؤقت للبروتين إلى المخزن المؤقت لوضع العلامات.
  2. وضع العلامات على الفلوروفور
    1. بالنسبة لمقايسات smFRET داخل الجزيئات ، قم بخلط ATL1cyto-TK مع LD555 و LD655 بنسبة 1: 1.2: 1.2 إلى حجم نهائي قدره 100 ميكرولتر (يجب ألا يتجاوز الحجم الإجمالي للفلوروفورات 1 ميكرولتر) ، واحتضانه لمدة 5 ساعات عند 4 درجات مئوية.
    2. بالنسبة لتجارب smFRET بين الجزيئات ، احتضان ATL1cyto-K أو ATL1cyto-T مع LD555 بنسبة 1: 1.2 ، وفي نفس الوقت احتضان ATL1cyto-K الحيوي مع LD655 بنسبة 1: 1.2 ، لمدة 5 ساعات عند 4 درجات مئوية (نفس حجم الحضانة كما في 5.2.1).
      ملاحظة: يسمح الحضانة المشتركة للبروتين والأصباغ بالمرونة في وضع العلامات ل LD555 (المانح) و LD655 (المتقبل). حقيقة أن LD555 تم تصنيفه على T51C أو K400C لا يؤثر على نتائج تجربة FRET. يتم توفير رسم تخطيطي للمتبرع الذي يتم تصنيفه في موقع T51C (الشكل 1C ، D).
    3. قم بإزالة الفلوروفورات الحرة الزائدة باستخدام أعمدة تحلية المياه 7 K MWCO27.
    4. أضف TCEP إلى البروتينات المسماة بالفلوروفور بتركيز نهائي قدره 0.5 مليمتر.
    5. الكشف عن كفاءة وضع العلامات على البروتينات باستخدام مقياس الطيف الضوئي. قم بقياس امتصاص البروتين عند 280 نانومتر ، وامتصاص LD555 عند 555 نانومتر ، وامتصاص LD555 عند 655 نانومتر ، واحسب التركيزات المولية باستخدام معاملات الانقراض ، على التوالي. كفاءة وضع العلامات على البروتين = (التركيز المولي للصبغة الفلورية / التركيز المولي للبروتين) × 100٪.

6. تصوير FRET أحادي الجزيء

  1. اعداد
    1. تحضير مخزن الحضانة: امزج 25 ملي مولار من HEPES (درجة الحموضة 7.4) ، و 150 ملي مولار من KCl ، و 5 ملي من MgCl2. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
    2. تحضير 1 مجم / مل ستربتافيدين (مذاب في ddH2O) و 1 مجم / مل من الجسم المضاد المضاد للبيوتينيل ل His لتثبيت البروتينات.
    3. تحضير 25 ملي مولار من حمض البنزويك (الرقم الهيدروجيني 7.4 ؛ مذاب في المخزن المؤقت كما هو موضح في 7.1.1) و 100 ملي مولار من البروتوكاتشوات 3،4-ثنائي الأكسجين (PCD) (مذاب في محلول 40٪ من الجلسرين) لتقليل التبييض الضوئي أثناء تجارب smFRET.
    4. تحضير 100 ملي مولار من ملح الصوديوم Guanosine 5'-diphosphate (GDP) ، Guanosine 5'-O- [gamma-thio] ثلاثي الفوسفات (GTPγS) ، ومحاليل مخزون AlCl3 المذابة في ddH2O. تحضير 1 م من محلول مخزون NaF المذاب في ddH2O.
    5. أخرج شريحة الغطاء والمجهر المحفوظة بالفراغ ، وألصقها بعناية بشريط مخصص على الوجهين على مقعد نظيف. قم بتثبيت الخراطيم والنصائح لتشكيل غرفة ميكروفلويديك بست قنوات27.
      ملاحظة: لا تعرض الغطاء المعدل للهواء لفترات طويلة من الوقت. قم بإعداد غرفة الموائع الدقيقة27 قبل البدء في تجارب smFRET.
  2. تصحيح الخرائط
    ملاحظة: أثناء التجربة ، يجب جمع إشارات التألق من القنوات المانحة والمستقبلة ، على التوالي. بسبب استخدام المجاهر ، قد تكون هناك انحرافات طفيفة في مجالات المراقبة للقنوات المانحة والمستقبلة. من أجل تقليل الانحراف في حقول المراقبة ، يجب إجراء معايرة رسم الخرائط قبل بدء التجربة.
    1. امزج 10٪ من جزيئات البوليسترين (قطرها 3 ميكرومتر) جيدا ، وأضف 10 ميكرولتر من الجسيمات إلى شريحة المجهر (غير معدلة) ، وقم بتغطيتها بغطاء (غير معدل).
    2. حدد مجال رؤية يحتوي على أكبر عدد ممكن من جزيئات البوليسترين. التقط مقطع فيديو تحت مجال ساطع باستخدام الفحص المجهري الفلوري للانعكاس الداخلي الكلي (TIRF).
      ملاحظة: تم استخدام هدف غمر الزيت بفتحة عددية عالية (100x) للتصوير عالي الدقة. بالنسبة لتجارب smFRET ، تم التقاط الإشارات على فترات إطار تبلغ 30 مللي ثانية باستخدام كاميرا EMCCD.
    3. استخدم برنامجا نصيا مخصصا لمحاذاة الموقع المركزي لنفس جسيم البوليسترين في القناة المانحة وقناة المستقبل وحفظ ملف الخريطة كملف txt. يتوفر رمز MATLAB المخصص المستخدم في هذه الدراسة في https://github.com/yangchenguang-1994/HMM-FRET).
  3. شل حركة البروتينات في الغرفة
    1. بالنسبة لتجارب smFRET بين الجزيئات ، قم بخلط ATL1cyto-K أو ATL1cyto-T المسمى LD555 و ATL1cyto-K-biotin المسمى LD655 بنسبة 1: 1 مع تركيز نهائي يبلغ 1 ملي مولار من GTPγS أو الناتج المحلي الإجمالي / AlF4- ، واحتضانه لمدة ساعة واحدة على الجليد لتضليل البروتين.
    2. بالنسبة لتجارب ATL1cyto-T و ATL1cyto-K بين الجزيئات smFRET ، امزج ATL1cyto-T المسمى LD555 و ATL1cyto-K-biotin المسمى LD655 بنسبة 1: 1 مع تركيز نهائي قدره 1 ملي مولار من GTPγS أو الناتج المحلي الإجمالي / AlF4- ، واحتضن لمدة ساعة واحدة على الجليد للحصول على بروتينات مختتة.
    3. بالنسبة لمقايسات smFRET داخل الجزيئات ، احتضان LD555 و LD655 ATL1cyto-TK المسمى ب 1 ملي مولار من الناتج المحلي الإجمالي لمدة ساعة واحدة على الجليد قبل إجراء تجارب smFRET في ظل ظروف الناتج المحلي الإجمالي.
    4. بالنسبة لتجارب smFRET بين الجزيئات ، احتضن 10 ميكروغرام / مل من الستربتافيدين (مخفف بمخزن مؤقت حضانة 200 ميكرولتر) لمدة 10 دقائق لتثبيت البروتينات. بالنسبة لمقايسات smFRET داخل الجزيئات ، أضف 10 ميكروغرام / مل من الجسم المضاد للبيوتينيل المضاد له (مخفف بمخزن مؤقت حضانة 200 ميكرولتر) واحتضنه لمدة 10 دقائق لشل حركة البروتينات. امسح القناة مرة واحدة باستخدام مخزن مؤقت للحضانة قبل إضافة كل محلول.
    5. قم بتخفيف ثنائي ATL1 إلى ~ 0.3 نانومتر أو المونومر إلى ~ 1 نانومتر في مخزن مؤقت حضانة 200 ميكرولتر ، واحتضانه لمدة 10 دقائق لتثبيت البروتينات في القناة. امسح القناة بمخزن مؤقت للحضانة مرتين. أضف حمض البنزويك و PCD إلى القناة بتركيز نهائي قدره 2.5 ملي مولار (مخفف بمحلول 200 ميكرولتر).
      ملاحظة: لمحاكاة المراحل المختلفة لجزيئاتATL1 cyto في عملية التحلل المائي GTP ، تمت إضافة النيوكليوتيدات (الناتج المحلي الإجمالي ، GTPγS ، والناتج المحلي الإجمالي / AlF4-) بتركيز نهائي قدره 1 ملي مولار إلى المخازن المؤقتة في كل خطوة بعد تثبيت البروتين في القناة. تحاكي إضافة GTPγS ربط GTP ، وتحاكي إضافة الناتج المحلي الإجمالي / AlF4- التحلل المائي GTP ، وإضافة الناتج المحلي الإجمالي تحاكي إصدار Pi ، ويمثل apo sate إصدار الناتج المحلي الإجمالي.
  4. تصوير smFRET
    1. اضبط المستوى البؤري. استخدم مقابض التركيز البؤري الخشنة والدقيقة، واضبط المستوى البؤري لجعل العينة في تركيز بؤري حاد. هنا ، تم استخدام نظام التركيز الآلي لتحقيق التركيز الأمثل.
    2. قم بإعداد مصدر الإثارة. استخدم ليزر 532 نانومتر كمصدر لضوء الإثارة. اضبط طاقة الليزر على مستوى مناسب لإثارة الفلوروفور. هنا ، تم استخدام طاقة ليزر من 20-40 ميجاوات.
    3. قم بتوصيل كاميرا EMCCD بالمجهر. اضبط الكاميرا على التسجيل بفاصل إطار يبلغ 30 مللي ثانية. تأكد من ضبط الكاميرا لالتقاط الصور في وضع 16 بت للحصول على بيانات عالية الدقة.
    4. سجل الفيلم ، مع التأكد من أن التركيز يظل ثابتا طوال فترة الاستحواذ. قم بتمديد وقت تشعيع الليزر 532 نانومتر لأطول فترة ممكنة حتى يتم إخماد معظم جزيئات الفلورسنت عند تسجيل إشارات الفلورة.
    5. احفظ الأفلام المسجلة بتنسيق TIFF 16 بت لمزيد من التحليل.

7. الحصول على البيانات وتحليلها

  1. قم بتحميل ملف txt للخريطة للتصحيح قبل استخراج مسارات FRET من الأفلام المسجلة. حدد مسارات FRET واحفظ كل بيانات مسار FRET بتنسيق txt لمزيد من التحليل.
  2. استخرج البيانات من ملفات txt واحسب قيم FRET باستخدام البرامج النصية محلية الصنع في Matlab2022a. كود MATLAB المخصص متاح في https://github.com/yangchenguang-1994/HMM-FRET.
    ملاحظة: يتم حساب قيمة FRET باستخدام المعادلة ILD655 / (γILD555 + ILD655). يمثل ILD555 و ILD655 شدة التألق LD555 و LD655 ، على التوالي. γ هي معلمة تم الحصول عليها بواسطة الصيغة γ = FA / FD. يمثل FA انخفاض شدة المستقبل ، و FD هو زيادة شدة المانح.
  3. قم بتركيب بيانات smFRET بواسطة GaussAmp في Origin 2022 للحصول على الرسم البياني للتوزيع.
    ملاحظة: بالنسبة للبيانات ذات حالات FRET المتعددة (البيانات الموجودة في حالة GTPγS في smFRET بين الجزيئات أو بيانات smFRET داخل الجزيئات في ظل ظروف الناتج المحلي الإجمالي أو Apo) ، يمكن استخدام التركيب متعدد الذروة.

النتائج

تم إجراء تجارب smFRET على مجهر TIRF عن طريق التقاط شدة مضان الفلوروفورات كل 30 مللي ثانية. تظهر الصور التمثيلية لجزيئاتسيتو ATL1 المسماة LD555 (المانح) و / أو LD655 (المتقبل) في غياب أو وجود نيوكليوتيدات مختلفة في الشكل 2A-C. تم تسجيل شدة التألق لل?...

Discussion

تعتمد تقنية FRET على نقل الطاقة بين أصباغتين الفلورية (المانحة والمتقبلة). في حالة قربها من بعضها البعض (عادة 1-10 نانومتر) ، ينقل المتبرع المتحمس طاقته إلى المستقبل ، مما يؤدي إلى انخفاض في شدة مضان المتبرع وزيادة في شدة مضان المستقبل.

في تجارب smFRET ، يتم تخفيف ?...

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

يتم دعم X.B. من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (32371287) ، وصناديق البحوث الأساسية للجامعات المركزية (63223043 و 63233053) ، ومشروع تدريب المواهب في جامعة نانكاي (035-BB042112). Y.L. مدعومة من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (12022409 و T2221001) وبرنامج CAS Key Research Sciences (ZDBS-LY-SLH015). LM مدعومة من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (32271274 و 31770812).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10 K Centrifugal FiltersAmiconUFC901096
3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES) Sigma-Aldrich440140
45 Ti rotor
532-nm laserOlympus
640-nm laserOlympus
7 K MWCO spin desalting columnsThermo Scientific89882
Adenosine 5-triphosphate disodium salt (ATP)Roche11140965001
Benzoic acidSigma-Aldrich242381
Biotin-PEG-SVA-5000Laysan Bio170-124
Biotinylated anti His antibodyBioss Antibodiesbs-0287R-bio
d-biotinSigma-AldrichB4501
EDTA-free protease inhibitor cocktailRoche11873580001
EMCCD cameraAndorIX897
Guanosine 5′-diphosphate sodium salt (GDP)Sigma-Aldrich G7127
Guanosine 5'-O-[gamma-thio]triphosphate (GTPγS)Roche10220647001
High numerical aperture oil immersion objectiveNikonNikon, 100x, N.A. 1.49, oil immersion
ImageJNIHhttps://imagej.net/ij/
Isopropyl-Β-D-ThiogalactosideSigma-AldrichI5502
LD555-MALLumidyne4
LD655-MALLumidyne10
L-glutamic acid potassiumSigma-AldrichG1501
Magnesium acetate tetrahydrateSigma-AldrichM0631
MatlabThe MathWorks, Natick, MAhttps://www.mathworks.com/
Microscope cover glassFisherbrand18834 (24 mm × 60 mm)
Microscope slidesCustomized, (75 mm × 26 mm × 1 mm) with 6 pairs of 1.2 mm diameter through holes
mPEG-SVA-5000Laysan Bio170-106
Ni Sepharose 6 Fast FlowCytiva17531802
OriginOrigin softwarehttps://www.originlab.com/
Polystyrene particlesQDSphereAG1265
Protocatechuate 3,4-dioxygenaseSigma-AldrichP8279
StreptavidinSangon BiotechA610492
Superdex 200 Increase (10/300 GL)Cytiva28990944
TIRF microscopeNikonTi2
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP)Thermo75259

References

  1. Jimah, J. R., Hinshaw, J. E. Structural insights into the mechanism of dynamin superfamily proteins. Trends Cell Biol. 29 (3), 257-273 (2019).
  2. Kalia, R., Frost, A. Open and cut: Allosteric motion and membrane fission by dynamin superfamily proteins. Mol Biol Cell. 30 (17), 2097-2104 (2019).
  3. Ramachandran, R., Schmid, S. L. The dynamin superfamily. Curr Biol. 28 (8), R411-R416 (2018).
  4. Bryce, S., et al. Human atlastin-3 is a constitutive ER membrane fusion catalyst. J Cell Biol. 222 (7), e202211021 (2023).
  5. Crosby, D., et al. Reconstitution of human atlastin fusion activity reveals autoinhibition by the C terminus. J Cell Biol. 221 (2), e202107070 (2022).
  6. Hu, J., et al. A class of dynamin-like GTPases involved in the generation of the tubular er network. Cell. 138 (3), 549-561 (2009).
  7. Jang, E., et al. Human atlastins are sufficient to drive the fusion of liposomes with a physiological lipid composition. J Cell Biol. 222 (4), e202109090 (2023).
  8. Liu, X., et al. Atlastin-1 regulates morphology and function of endoplasmic reticulum in dendrites. Nat Commun. 10 (1), 568 (2019).
  9. Orso, G., et al. Homotypic fusion of ER membranes requires the dynamin-like gtpase atlastin. Nature. 460 (7258), 978-983 (2009).
  10. Rismanchi, N., Soderblom, C., Stadler, J., Zhu, P. P., Blackstone, C. Atlastin GTPases are required for Golgi apparatus and er morphogenesis. Hum Mol Genet. 17 (11), 1591-1604 (2008).
  11. Faust, J. E., et al. The atlastin C-terminal tail is an amphipathic helix that perturbs the bilayer structure during endoplasmic reticulum homotypic fusion. J Biol Chem. 290 (8), 4772-4783 (2015).
  12. Liu, T. Y., et al. Lipid interaction of the c terminus and association of the transmembrane segments facilitate atlastin-mediated homotypic endoplasmic reticulum fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (32), E2146-E2154 (2012).
  13. Moss, T. J., Andreazza, C., Verma, A., Daga, A., Mcnew, J. A. Membrane fusion by the GTPase atlastin requires a conserved c-terminal cytoplasmic tail and dimerization through the middle domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (27), 11133-11138 (2011).
  14. Bian, X., et al. Structures of the atlastin GTpase provide insight into homotypic fusion of endoplasmic reticulum membranes. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (10), 3976-3981 (2011).
  15. Byrnes, L. J., et al. Structural basis for conformational switching and GTP loading of the large g protein atlastin. EMBO J. 32 (3), 369-384 (2013).
  16. Byrnes, L. J., Sondermann, H. Structural basis for the nucleotide-dependent dimerization of the large g protein atlastin-1/spg3a. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (6), 2216-2221 (2011).
  17. Morin-Leisk, J., et al. An intramolecular salt bridge drives the soluble domain of gtp-bound atlastin into the postfusion conformation. J Cell Biol. 195 (4), 605-615 (2011).
  18. Pendin, D., et al. GTP-dependent packing of a three-helix bundle is required for atlastin-mediated fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (39), 16283-16288 (2011).
  19. Winsor, J., Hackney, D. D., Lee, T. H. The crossover conformational shift of the GTPase atlastin provides the energy driving ER fusion. J Cell Biol. 216 (5), 1321-1335 (2017).
  20. Yan, L., et al. Structures of the yeast dynamin-like GTPase sey1p provide insight into homotypic er fusion. J Cell Biol. 210 (6), 961-972 (2015).
  21. Rizo, J. Molecular mechanisms underlying neurotransmitter release. Annu Rev Biophys. 51, 377-408 (2022).
  22. Gao, S., Hu, J. Mitochondrial fusion: The machineries in and out. Trends Cell Biol. 31 (1), 62-74 (2021).
  23. Kelly, C. M., Byrnes, L. J., Neela, N., Sondermann, H., O'donnell, J. P. The hypervariable region of atlastin-1 is a site for intrinsic and extrinsic regulation. J Cell Biol. 220 (11), e202104128 (2021).
  24. Asher, W. B., et al. GPCR-mediated beta-arrestin activation deconvoluted with single-molecule precision. Cell. 185 (10), 1661-1675.e16 (2022).
  25. Li, M., et al. Mechanism of DNA translocation underlying chromatin remodelling by snf2. Nature. 567 (7748), 409-413 (2019).
  26. Chen, Y., et al. Conformational dynamics of dynamin-like MXA revealed by single-molecule fret. Nat Commun. 8, 15744 (2017).
  27. Shi, L., et al. Dissecting the mechanism of atlastin-mediated homotypic membrane fusion at the single-molecule level. Nat Commun. 15 (1), 2488 (2024).
  28. Guelly, C., et al. Targeted high-throughput sequencing identifies mutations in atlastin-1 as a cause of hereditary sensory neuropathy type i. Am J Hum Genet. 88 (1), 99-105 (2011).
  29. Montagna, A., Vajente, N., Pendin, D., Daga, A. In vivo analysis of CRISPR/Cas9 induced atlastin pathological mutations in drosophila. Front Neurosci. 14, 547746 (2020).
  30. Ulengin, I., Park, J. J., Lee, T. H. ER network formation and membrane fusion by atlastin1/spg3a disease variants. Mol Biol Cell. 26 (9), 1616-1628 (2015).
  31. Zhao, X., et al. Mutations in a newly identified GTPase gene cause autosomal dominant hereditary spastic paraplegia. Nat Genet. 29 (3), 326-331 (2001).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

215 GTPase Atlastin GTP SmFRET N

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved