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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Die Funktionen von Proteinen der Dynamin-Superfamilie hängen von Konformationsänderungen ab, die mit der GTP-Hydrolyse gekoppelt sind. Es wird ein System beschrieben, das die Einzelmolekül-FRET-Technik (smFRET) verwendet, um die Konformationsdynamik von Dynamin-ähnlichem GTPase-Atlastin in verschiedenen Nukleotid-Beladungszuständen zu überwachen.

Zusammenfassung

Die Starrkörperrotation der dreihelikalen Mitteldomäne (3HB) relativ zur GTPase-Domäne des Dynamin-ähnlichen Proteins Atlastin (ATL) ist ein entscheidender Treiber der homotypischen Membranfusion im endoplasmatischen Retikulum (ER). Störungen in diesem Prozess wurden mit der hereditären spastischen Querschnittslähmung (HSP), einer neurodegenerativen Erkrankung, in Verbindung gebracht. Strukturelle und biochemische Studien deuten darauf hin, dass die Konformationsänderungen in ATL mit der GTP-Hydrolyse zusammenhängen, aber die Echtzeit-Visualisierung dieser Konformationsdynamik während des GTP-Hydrolysezyklus bleibt eine Herausforderung. Um die mechanischen Mechanismen hinter der ATL-Funktion besser zu verstehen, wurde der Einzelmolekül-Förster-Resonanzenergietransfer (smFRET) verwendet. Drei spezifische Strategien wurden angewendet, um die N-terminale zytosolische Region von humanem ATL1 (ATL1cyto) in einer Streptavidin-beschichteten mikrofluidischen Kammer zu immobilisieren, was die Anwendung der intramolekularen und intermolekularen smFRET-Bildgebung erleichtert. Dies ermöglichte eine präzise Überwachung der Proteinkonformationen in verschiedenen Nukleotidbeladungszuständen und ermöglichte so direkte Einblicke in das individuelle molekulare Verhalten. Diese Methode kann auch zur Untersuchung anderer mechanochemischer Proteine angewendet werden.

Einleitung

In eukaryotischen Zellen vermitteln die Proteine der Dynamin-Superfamilie den Umbau biologischer Membranen, einschließlich Membrantubulation, Spaltung und Fusion 1,2,3. Mutationen in diesen Proteinen führen zu einer Vielzahl von menschlichen Krankheiten, wie z. B. neurodegenerativen Erkrankungen. Die Mitglieder der Dynamin-Superfamilie enthalten typischerweise eine GTPase-Domäne, eine mittlere Domäne, die aus helikalen Bündeln besteht, ein Motiv für die Membranbindung und eine GTPase-Effektordomäne (GED). Eine solche Dynamin-ähnliche GTPase ist Atlastin (ATL), das die homotypische Membranfusion des endoplasmatischen Retikulums (ER) katalysiert, um ein Netzwerk zu bilden 4,5,6,7,8,9,10. Bei Säugetieren gibt es drei ATLs (ATL1-3). Das ATL-Molekül besteht aus einer N-terminalen zytosolischen Region (ATL-Zyto), die eine GTPase-Domäne und eine dreihelikale Mitteldomäne (3HB) umfasst, gefolgt von zwei Transmembranregionen, aber es fehlt das typische GED. Alternativ enthält ATL einen C-terminalen Schwanz, der eine entscheidende Rolle bei der Membranfusion spielt 11,12,13.

Es wurde berichtet, dass eine effiziente Membranfusion auf der GTP-Hydrolyse-abhängigen Domänenumlagerung in ATLcyto 14,15,16,17,18,19,20 beruht. Im Vergleich zum SNARE-Komplex, der die Faltungsenergie aus Konformationsänderungen nutzt, um die heterotypische Membranfusionvoranzutreiben 21, bleibt der homotypische Membranfusionsprozess, der durch ATL und andere fusionsspezifische Dynamin-ähnliche Proteine22 vermittelt wird, jedoch schwer fassbar. Drei Kristallstrukturen von humanemATL1-Cyto wurden unter verschiedenen Nukleotidbeladungsbedingungen bestimmt 14,15,16,23. In den Strukturen zeigen die beiden 3HBs im Dimer in unterschiedliche Richtungen, aber ein umfassendes Modell, das erklärt, wie die Konformationsdynamik vonATL-Cyto und seiner GTPase-Aktivität gekoppelt sind, fehlt noch.

Im Vorgängermodell bilden die monomeren ATL-Moleküle GTP-abhängig Dimere über verschiedene Membranen, um die Membranfusion voranzutreiben. Hier werden drei Strategien beschrieben, um den Einzelmolekül-Förster-Resonanzenergietransfer (smFRET) anzuwenden, um das Verhalten einzelner ATL1-Zytomoleküle direkt zu beobachten und genau zu detektieren. smFRET ist eine leistungsstarke Technik, die häufig zur Untersuchung der Konformationsdynamik und der Wechselwirkungen einzelner Biomoleküle in Echtzeit eingesetzt wird, wie z. B. die GPCR-vermittelte Aktivierung von β-Arrestin24, den Chromatin-Umbau durch Snf225 und die Domänenumlagerungen des Dynamin-ähnlichen Proteins MxA in Verbindung mit GTP-Hydrolysezyklen26. Da smFRET nur Abstandsänderungen von ~3 nm bis ~8 nm effektiv nachweisen kann, sind sowohl intermolekulare als auch intramolekulare smFRET-Experimente erforderlich, um die Konformationen vonATL1-Cyto für jeden Nukleotid-Beladungszustand umfassend zu analysieren. Wir erzeugten drei Konstrukte vonATL1-Zytosteinen, bei denen alle nativen Cysteine mit Alaninen substituiert waren und K400 (ATL1Cyto-K) oder das T51/K400-Paar (ATL1Cyto-TK) zu Cystein mutiert waren, um die Fluorophormarkierung zu ermöglichen. Die Strategien zur Immobilisierung desATL1-Zyto-Dimers oder -Monomers in einer Streptavidin-beschichteten mikrofluidischen Kammer (Abbildung 1A) für intermolekulare oder intramolekulare smFRET-Experimente sind in Abbildung 1B-D dargestellt. Diese Methode liefert mehr Details über die Konformationsdynamik von Dynamin-ähnlichen Proteinen in jedem Schritt der GTP-Hydrolyse27.

Protokoll

Die Einzelheiten zu den in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung des modifizierten Deckglases für die Proteinimmobilisierungskammer

  1. Präparat
    1. Bereiten Sie 50 ml Piranha-Lösung vor (bestehend aus konzentrierter Schwefelsäure und Wasserstoffperoxid im Verhältnis 3:1), indem Sie langsam Wasserstoffperoxid zu konzentrierter Schwefelsäure hinzufügen, um übermäßige Temperaturen zu vermeiden. Legen Sie es vorsichtig in einen Abzug.
    2. Bereiten Sie die Natriumethoxidlösung vor. 2 g NaOH in 15 mL ddH2O auflösen, 35 mL absolutes Ethanol zugeben und vollständig mischen. Bei Raumtemperatur stehen lassen.
    3. Bereiten Sie eine Lösung mit hohem Salzgehalt vor (0,1 M NaHCO3 und 0,6 M K2SO4). Vollständig auflösen und 500 μl/Röhrchen aliquotieren. Bei -20 °C lagern.
    4. Aliquot SVA-mPEG und SVA-mPEG-Biotin in etwa 30 mg pro Röhrchen und 3 mg pro Röhrchen. Bei -20 °C lagern.
    5. Passen Sie Objektträger (75 mm × 26 mm × 1 mm) mit 6 Paar Löchern mit einem Durchmesser von 1,2 mm an.
  2. Reinigen der Oberfläche des Deckglases
    1. Nehmen Sie mit einer Pinzette acht Deckgläser auf und legen Sie sie in ein Färbeglas. Fügen Sie Aceton (~50 mL) hinzu, um die Deckgläser zu bedecken, stellen Sie das Färbeglas für 30 Minuten in einen Ultraschallreiniger und spülen Sie die Deckgläser dann dreimal mit ddH2O aus.
    2. Waschen Sie die Deckgläser mit Methanol wie in Schritt 1.2.1 beschrieben.
    3. Die Piranha-Lösung (Schritt 1.1.1) in das Färbeglas geben und in einem 95 °C warmen Wasserkocher im Wasserbad 2 h erhitzen. Nachdem das Färbeglas auf Raumtemperatur abgekühlt ist, spülen Sie die Deckgläser mindestens sechsmal mit ddH2O aus.
    4. Geben Sie die Natronethoxidlösung in das Färbeglas, legen Sie sie 15 min in einen Ultraschallreiniger und spülen Sie sie dann dreimal mit ddH2O aus.
    5. Geben Sie ddH2O in das Färbeglas, um die Deckgläser abzudecken, legen Sie es 15 min in einen Ultraschallreiniger und spülen Sie es anschließend 3 Mal mit ddH2O aus.
  3. Modifikation der Aminosilanisierung der Deckglasoberfläche.
    1. Klemmen Sie die Deckgläser in das Färbeglas auf einer sauberen Bank, trocknen Sie sie mit Stickstoff ab und geben Sie sie in ein anderes (vorher getrocknetes) Färbeglas.
    2. Den Färbebehälter im Trockenofen bei 120 °C 30 min backen und anschließend in einem Exsikkator auf Raumtemperatur abkühlen lassen.
    3. 47,5 ml Methanol, 2,5 ml Essigsäure und 0,5 ml 3-Aminopropyltriethoxysilan (APTES) in das Becherglas geben (vorher getrocknet), gleichmäßig mischen, in das Färbeglas geben und 10 Minuten inkubieren.
    4. Spülen Sie die Deckgläser im Färbeglas mit ddH2O mindestens dreimal aus und beschallen Sie sie 5 Min. lang.
    5. Nehmen Sie die Deckgläser nacheinander heraus, spülen Sie sie mit ddH2O aus, föhnen Sie sie mit Stickstoff und geben Sie sie in eine Petrischale mit einem Durchmesser von 10 cm, um sie für die PEG-Modifikation vorzubereiten.
      HINWEIS: Die APTES-Modifikation muss in einer trockenen Umgebung durchgeführt werden.
  4. Modifikation der Deckglasoberfläche mit SVA-mPEG-Biotin und SVA-mPEG
    HINWEIS: Die Biotin-Modifikation der Deckglasoberfläche hilft, biotinylierte Proteine (oder Proteine, die an Biotin-Anti-His binden) über Streptavidin zu erhalten.
    1. Das verpackte SVA-mPEG und SVA-mPEG-Biotin werden vollständig in der salzreichen Lösung (1 mg entsprechend 10 μl salzreicher Lösung) gelöst. Geben Sie die SVA-mPEG-Biotin-Lösung in einem Verhältnis von 1:100 zur SVA-mPEG-Lösung.
      HINWEIS: Schütteln Sie die Lösung mit einem Wirbel, um sicherzustellen, dass SVA-mPEG oder SVA-mPEG-Biotin vollständig aufgelöst ist. Die wässrige Lösung SVA-mPEG oder SVA-mPEG-Biotin sollte vor der Verwendung hergestellt werden.
    2. Lassen Sie die vorbereitete Mischlösung auf ein Deckglas fallen und decken Sie es mit einem weiteren Deckglas ab. Dieser Prozess soll die Entstehung von Blasen verhindern. Inkubieren Sie Deckgläser vollständig mit entsprechender Luftfeuchtigkeit für mehr als 2 h oder über Nacht.
    3. Trennen Sie die Deckgläser nach Abschluss der Änderung, spülen Sie sie mit ddH2O ab und föhnen Sie sie mit Stickstoff. Markieren Sie die Oberfläche des Deckglases, die nicht mit SVA-mPEG und SVA-mPEG-Biotin modifiziert wurde.
    4. Legen Sie das modifizierte Deckglas vorsichtig in ein 50-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Nach dem Staubsaugen bei -20 °C lagern.
      HINWEIS: Der modifizierte Deckglas kann 1 Monat lang unter Vakuum gelagert werden.

2. Vorbereitung der Objektträger für die Proteinimmobilisierungskammer

  1. Waschen Sie die Objektträger wie bei Deckgläsern in Schritt 1.2 beschrieben.
  2. Pusten Sie die Objektträger mit Stickstoff trocken und geben Sie sie in 50 mL Mikrozentrifugenröhrchen.
  3. Lagern Sie die Objektträger wie in Schritt 1.4.4 beschrieben.

3. Proteinexpression und -reinigung

  1. Präparat
    1. Plasmide: Klonen Sie ein Mitglied der Atlastin-Familie von Interesse oder die pathogene Mutation von Interesse in einen bakteriellen Expressionsvektor, z. B. pET-28a, und fügen Sie einen Avitag27 hinzu. Einführung von Cysteinen an relevanten Positionen durch ortsgerichtete Mutagenese (z. B. T51C und K400C27).
    2. Bereiten Sie die folgenden Puffer vor.
      1. Luria-Bertani (LB) Nährmedium: 10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt und 10 g Natriumchlorid in 1 l ddH2O mischen. Autoklav bei 121 °C für 20 min.
      2. Lysepuffer: Mischen Sie 25 mM HEPES (pH 7,4), 150 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1x vollständigen EDTA-freien Proteasehemmer-Cocktail, 10 mM Imidazol und 0,5 mM TCEP. Bei 4 °C lagern.
      3. Waschpuffer: Mischen Sie 25 mM HEPES (pH 7,4), 150 mM KCl, 5 mM MgCl2, 30 mM Imidazol und 0,5 mM Tris(2-carboxyethyl)phosphinhydrochlorid (TCEP). Bei 4 °C lagern.
      4. Elupuffer: Mischen Sie 25 mM HEPES (pH 7,4), 150 mM KCl, 5 mM MgCl2, 150 mM Imidazol und 0,5 mM TCEP. Bei 4 °C lagern.
      5. Reinigungspuffer: 25 mM HEPES (pH 7,4), 150 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0,5 mM TCEP. Bei 4 °C lagern.
  2. Protein-Aufreinigung
    1. Übertragen Sie die Plasmide27 in Rosetta (DE3) (Biomed) E. coli-Zellen unter Verwendung von Hitzeschockmethoden der bakteriellen Transformation. Die übertragenen Zellen werden in LB-Kulturmedium mit einer Endkonzentration von 50 μg/μl Kanamycin suspendiert.
      1. Kultur bei 37 °C, bis die Absorption des Kulturmediums bei 600 nm 0,6-0,8 beträgt. Fügen Sie Isopropyl-β-D-thiogalactosid (IPTG) in einer Endkonzentration von 50 μM hinzu, um die Proteinexpression bei 16 °C für 20-24 h zu induzieren.
        HINWEIS: Die Wachstumsrate von bakteriellen oder anderen mikrobiellen Zellkulturen kann durch Messung der optischen Dichte (Absorption) der Zellwachstumskultur bei 600 nm überwacht werden.
    2. Die Zellen werden durch Zentrifugation bei 4000 × g für 20 min bei Raumtemperatur geerntet. Entsorgen Sie den Überstand.
    3. Resuspendieren Sie das Zellpellet mit 30 mL Lysepuffer. Brechen Sie die Zellen dreimal mit einem Hochdruck-Zellbrecher auf.
    4. Die Lysate werden durch Zentrifugation bei 2.00.000 × g für 1 h bei 4 °C mit einem Ultrazentrifugenrotor geklärt.
    5. Isolieren Sie das Protein mit einer Ni-NTA-Säule. Waschen Sie die Ni-NTA-Säule mit Waschpuffer für 5 Säulenvolumen. Eluieren Sie Protein mit Elutionspuffer für 1 Säulenvolumen. Sammeln Sie das Eluat und konzentrieren Sie es mit Zentrifugalfiltern auf ~ 500 μl.
    6. Ferner wird das Protein durch Größenausschlusschromatographiegereinigt 27. Sammeln Sie das Eluat (500 μL pro Röhrchen).
    7. Bestätigen Sie das Zielprotein anhand seines Molekulargewichts, das durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)27 bestimmt wird. Sammeln Sie das Zielprotein für weitere Modifikationen.

4. Protein-Biotinylierung

  1. Präparat
    1. Bereiten Sie die folgenden Stammlösungen vor.
      1. Magnesiumacetat-Tetrahydrat (MgOAc·4H2O) in 25 mM HEPES-Puffer (pH 7,7) in einer Konzentration von 100 mM (10×) lösen. Aliquotieren Sie 100 μl pro Röhrchen und lagern Sie es bei -20 °C.
      2. Adenosin-5-triphosphat-Dinatriumsalz (ATP) wird in ddH2O in einer Konzentration von 100 mM (10×) gelöst. Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH auf 7,4 ein. 100 μl pro Röhrchen aliquotieren und bei -80 °C lagern.
      3. d-Biotin wird in ddH2O in einer Konzentration von 500 μM gelöst, 100 μl pro Röhrchen aliquotiert und bei -20 °C gelagert.
      4. Streptavidin wird in ddH2O in einer Konzentration von 1 mg/ml gelöst. 20 μl pro Röhrchen aliquotieren und bei -20 °C lagern.
    2. Protein-Biotinylierungspuffer: Fügen Sie 25 mM HEPES (pH 7,7), 200 mM L-Glutaminsäure-Kalium und 0,5 mM TCEP hinzu. Bei 4 °C lagern.
    3. BirA-Biotin-Ligase aufreinigen und bei -80 °C lagern.
  2. Protein-Biotinylierung
    1. Wechseln Sie den Proteinpuffer zum Proteinbiotinylierungspuffer. Für die Biotinylierung mischen Sie 100 μl 100 mM ATP, 100 μl 100 mM MgOAc, 100 μl 500 μM d-Biotin, 10 μl 100 μM BirA-Biotinligase, 50 μM Protein auf ein Endvolumen von 1 mL und inkubieren über Nacht bei 4 °C.
    2. Entfernen Sie freies D-Biotin mit einem 10 K MWCO-Zentrifugalfilter.
    3. 20 μl biotinyliertes Protein mit 20 μl 15 μM Streptavidin für 20 min auf Eis inkubieren. Nachweis der Effizienz der Proteinbiotinylierung durch SDS-PAGE27.

5. Markierung von Proteinfluorophoren

  1. Präparat
    1. Die Fluorophore LD555 (Donor) und LD655 (Akzeptor) werden in Dimethylsulfoxid (DMSO) auf eine Endkonzentration von 5 mM gelöst. Bei -20 °C lagern.
    2. Bereiten Sie Markierungspuffer vor: Mischen Sie 25 mM HEPES (pH 7,4), 150 mM KCl und 5 mM MgCl2. Bei 4 °C lagern.
    3. Tauschen Sie den Proteinpuffer in den Markierungspuffer um.
  2. Fluorophor-Markierung
    1. Für intramolekulare smFRET-Assays mischen Sie ATL1Cyto-TK mit LD555 und LD655 in einem Verhältnis von 1:1,2:1,2 auf ein Endvolumen von 100 μl (das Gesamtvolumen der Fluorophore sollte 1 μl nicht überschreiten) und inkubieren Sie 5 Stunden lang bei 4 °C.
    2. Für intermolekulare smFRET-Experimente ist ATL1cyto-K oder ATL1cyto-T mit LD555 im Verhältnis 1:1,2 zu inkubieren und gleichzeitig biotinyliertes ATL1cyto-K mit LD655 im Verhältnis 1:1,2 für 5 h bei 4 °C zu inkubieren (gleiches Inkubationsvolumen wie in 5.2.1).
      HINWEIS: Die Co-Inkubation von Protein und Farbstoffen ermöglicht Flexibilität bei der Markierung von LD555 (Donor) und LD655 (Akzeptor). Die Tatsache, dass LD555 mit T51C oder K400C markiert ist, hat keinen Einfluss auf die Ergebnisse des FRET-Experiments. Ein schematisches Diagramm des Spenders, der an der T51C-Stelle markiert wird, ist vorhanden (Abbildung 1C,D).
    3. Überschüssige freie Fluorophore mit 7 K MWCO-Spin-Entsalzungssäulenentfernen 27.
    4. Fügen Sie TCEP zu Fluorophor-markierten Proteinen in einer Endkonzentration von 0,5 mM hinzu.
    5. Ermitteln Sie die Markierungseffizienz von Proteinen mit einem Spektralphotometer. Messen Sie die Proteinabsorption bei 280 nm, die LD555-Absorption bei 555 nm und die LD555-Absorption bei 655 nm und berechnen Sie die molaren Konzentrationen unter Verwendung ihrer Extinktionskoeffizienten. Effizienz der Proteinmarkierung = (molare Konzentration des Fluoreszenzfarbstoffs/molare Konzentration des Proteins) x 100%.

6. Einzelmolekül-FRET-Bildgebung

  1. Präparat
    1. Bereiten Sie den Inkubationspuffer vor: Mischen Sie 25 mM HEPES (pH 7,4), 150 mM KCl und 5 mM MgCl2. Bei 4 °C lagern.
    2. Bereiten Sie 1 mg/ml Streptavidin (gelöst in ddH2O) und 1 mg/ml biotinylierten Anti-His-Antikörper zur Immobilisierung von Proteinen vor.
    3. Bereiten Sie 25 mM Benzoesäure (pH 7,4; gelöst im Puffer wie in 7.1.1 beschrieben) und 100 mM Protocatechuat-3,4-Dioxygenase (PCD) (gelöst in 40%iger Glycerinlösung) vor, um das Photobleichen während der smFRET-Experimente zu minimieren.
    4. 100 mM Guanosin-5'-diphosphat-Natriumsalz (GDP), Guanosin-5'-O-[gamma-thio]triphosphat (GTPγS) und AlCl 3-Stammlösungen, gelöst in ddH2O, herstellen. 1 M NaF-Stammlösung, gelöst in ddH2O, herstellen.
    5. Nehmen Sie das vakuumkonservierte Deckglas und den Objektträger heraus und kleben Sie sie vorsichtig mit individuellem doppelseitigem Klebeband auf einer sauberen Werkbank zusammen. Schläuche und Spitzen sind so zu veranlassen, dass eine mikrofluidische Kammer mit sechs Kanälen27 entsteht.
      HINWEIS: Setzen Sie das modifizierte Deckglas nicht für längere Zeit der Luft aus. Bereiten Sie die mikrofluidische Kammer27 vor, bevor Sie mit den smFRET-Experimenten beginnen.
  2. Mapping-Korrektur
    HINWEIS: Während des Experiments sind Fluoreszenzsignale aus dem Donor- bzw. Akzeptorkanal zu sammeln. Durch den Einsatz von Mikroskopen kann es zu leichten Abweichungen in den Überwachungsfeldern des Donor- und Akzeptorkanals kommen. Um die Abweichung in den Überwachungsfeldern zu reduzieren, muss vor Beginn des Experiments eine Mapping-Kalibrierung durchgeführt werden.
    1. 10% Polystyrolpartikel (Durchmesser 3 μm) gründlich mischen, 10 μl Partikel auf einen Objektträger geben (nicht modifiziert) und mit einem Deckglas abdecken (nicht modifiziert).
    2. Wählen Sie ein Sichtfeld mit möglichst vielen Styroporpartikeln aus. Nehmen Sie ein Video unter einem hellen Feld mit der Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRF) auf.
      HINWEIS: Für die hochauflösende Bildgebung wurde ein Ölimmersionsobjektiv mit hoher numerischer Apertur (100x) verwendet. Für smFRET-Experimente wurden die Signale in Intervallen von 30 ms mit einer EMCCD-Kamera erfasst.
    3. Verwenden Sie ein benutzerdefiniertes Skript, um die mittlere Position desselben Polystyrolpartikels im Donorkanal und im Akzeptorkanal auszurichten, und speichern Sie die Map-Datei als txt-Datei. Der in dieser Studie verwendete benutzerdefinierte MATLAB-Code ist unter https://github.com/yangchenguang-1994/HMM-FRET) verfügbar.
  3. Immobilisierung der Proteine in der Kammer
    1. Für intermolekulare smFRET-Experimente mischen Sie LD555-markiertes ATL1-Cyto-K oder ATL1-Cyto-T und LD655-markiertes ATL1-Cyto-K-Biotin in einem Verhältnis von 1:1 mit einer Endkonzentration von 1 mM GTPγS oder GDP/AlF4- und inkubieren Sie es 1 h lang auf Eis, um das Protein zu dimerisieren.
    2. Für intermolekulare ATL1-Cyto-T- und ATL1-Cyto-K-smFRET-Experimente mischen Sie LD555-markiertes ATL1-Cyto-T und LD655-markiertesATL1-Cyto-K-Biotin in einem Verhältnis von 1:1 mit einer Endkonzentration von 1 mM GTPγS oder GDP/AlF4- und inkubieren Sie 1 h lang auf Eis, um dimerisierte Proteine zu erhalten.
    3. Für intramolekulare smFRET-Assays inkubieren Sie LD555- und LD655-markierteATL1-Cyto-TK mit 1 mM GDP für 1 h auf Eis, bevor Sie die smFRET-Experimente unter GDP-Bedingungen durchführen.
    4. Für intermolekulare smFRET-Experimente inkubieren Sie 10 μg/ml Streptavidin (verdünnt mit 200 μl Inkubationspuffer) für 10 Minuten, um Proteine zu immobilisieren. Für intramolekulare smFRET-Assays fügen Sie 10 μg/ml biotinylierten Anti-His-Antikörper (verdünnt mit 200 μl Inkubationspuffer) hinzu und inkubieren Sie 10 Minuten lang, um Proteine zu immobilisieren. Spülen Sie den Kanal einmal mit einem Inkubationspuffer, bevor Sie jede Lösung hinzufügen.
    5. Verdünnen Sie das ATL1-Dimer auf ~0,3 nM oder das Monomer auf ~1 nM in 200 μl Inkubationspuffer und inkubieren Sie es 10 Minuten lang, um die Proteine im Kanal zu immobilisieren. Spülen Sie den Kanal zweimal mit Inkubationspuffer. Geben Sie Benzoesäure und PCD in einer Endkonzentration von 2,5 mM in den Kanal (verdünnt mit 200 μl Puffer).
      HINWEIS: Um die verschiedenen Stadien von ATL1-Zytomolekülen im GTP-Hydrolyseprozess zu simulieren, wurde Nukleotid (GDP, GTPγS und GDP/AlF4-) in jedem Schritt nach der Immobilisierung des Proteins im Kanal in einer Endkonzentration von 1 mM zu den Puffern hinzugefügt. Die GTPγS-Addition ahmt die GTP-Bindung nach, die GDP/AlF-4-Addition ahmt die GTP-Hydrolyse nach, die GDP-Addition ahmt die Pi-Freisetzung nach und Apo sat stellt die GDP-Freisetzung dar.
  4. smFRET-Bildgebung
    1. Passen Sie die Fokusebene an. Verwenden Sie die Grob- und Feinfokusknöpfe und stellen Sie die Fokusebene ein, um die Probe scharf zu stellen. Hier wurde ein automatisiertes Fokussystem eingesetzt, um den optimalen Fokus zu erreichen.
    2. Richten Sie die Erregungsquelle ein. Verwenden Sie den 532 nm Laser als Anregungslichtquelle. Stellen Sie die Laserleistung auf ein geeignetes Niveau ein, um die Fluorophore anzuregen. Hier kam eine Laserleistung von 20-40 mW zum Einsatz.
    3. Schließen Sie die EMCCD-Kamera an das Mikroskop an. Stellen Sie die Kamera so ein, dass sie in einem Frame-Intervall von 30 ms aufzeichnet. Stellen Sie sicher, dass die Kamera so eingestellt ist, dass sie Bilder im 16-Bit-Modus für hochauflösende Daten aufnimmt.
    4. Nehmen Sie den Film auf und stellen Sie sicher, dass der Fokus während der gesamten Aufnahme konstant bleibt. Verlängern Sie die 532-nm-Laserbestrahlungszeit so lange wie möglich, bis die meisten fluoreszierenden Moleküle bei der Aufzeichnung der Fluoreszenzsignale gelöscht sind.
    5. Speichern Sie die aufgenommenen Filme im 16-Bit-TIFF-Format für die weitere Analyse.

7. Datenerfassung und -analyse

  1. Laden Sie die Map-TXT-Datei zur Korrektur, bevor Sie die FRET-Trajektorien aus den aufgenommenen Filmen extrahieren. Wählen Sie die FRET-Trajektorien aus und speichern Sie alle FRET-Trajektoriendaten im txt-Format für die weitere Analyse.
  2. Extrahieren Sie die Daten aus den txt-Dateien und berechnen Sie die FRET-Werte mit hausgemachten Skripten in Matlab2022a. Der benutzerdefinierte MATLAB-Code ist unter https://github.com/yangchenguang-1994/HMM-FRET verfügbar.
    HINWEIS: Der FRET-Wert wird anhand der Gleichung ILD655/(γILD555+ILD655) berechnet. ILD555 und ILD655 repräsentieren die Fluoreszenzintensitäten LD555 bzw. LD655. γ ist ein Parameter, der sich aus der Formel γ = FA/F D ergibt. FA steht für die Abnahme der Akzeptorintensität und FD für die Erhöhung der Donorintensität.
  3. Passen Sie die smFRET-Daten von GaussAmp in Origin 2022 an, um das Verteilungshistogramm zu erhalten.
    HINWEIS: Für Daten mit mehreren FRET-Zuständen (die Daten unter GTPγS-Bedingung in intermolekularen smFRET oder die Daten der intramolekularen smFRET unter GDP- oder Apo-Bedingungen) kann die Multi-Peak-Anpassung verwendet werden.

Ergebnisse

Die smFRET-Experimente wurden an einem TIRF-Mikroskop durchgeführt, indem die Fluoreszenzintensität von Fluorophoren alle 30 ms erfasst wurde. Repräsentative Bilder von LD555 (Donor) und/oder LD655 (Akzeptor)-markierten ATL1-Cytomolekülen in Abwesenheit oder Anwesenheit verschiedener Nukleotide sind in Abbildung 2A-C dargestellt. Die Fluoreszenzintensitäten der beiden Fluorophore an einzelnen Partikeln wurden...

Diskussion

Die FRET-Technologie basiert auf der Energieübertragung zwischen zwei Fluoreszenzfarbstoffen (Donor und Akzeptor). Im Falle ihrer Nähe zueinander (in der Regel 1-10 nm) überträgt der angeregte Donor seine Energie auf den Akzeptor, was zu einer Abnahme der Donorfluoreszenzintensität und einer Erhöhung der Akzeptorfluoreszenzintensität führt.

In smFRET-Experimenten werden die Moleküle auf sehr niedrige Konzentrationen verdünnt und auf Objektträgern im...

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Danksagungen

X.B. wird unterstützt von der National Natural Science Foundation of China (32371287), den Fundamental Research Funds for the Central Universities (63223043 und 63233053) und dem Talent Training Project an der Nankai University (035-BB042112). Y.L. wird unterstützt von der National Natural Science Foundation of China (12022409 und T2221001) und dem CAS Key Research Program of Frontier Sciences (ZDBS-LY-SLH015). L.M. wird von der National Natural Science Foundation of China (32271274 und 31770812) unterstützt.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
10 K Centrifugal FiltersAmiconUFC901096
3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES) Sigma-Aldrich440140
45 Ti rotor
532-nm laserOlympus
640-nm laserOlympus
7 K MWCO spin desalting columnsThermo Scientific89882
Adenosine 5-triphosphate disodium salt (ATP)Roche11140965001
Benzoic acidSigma-Aldrich242381
Biotin-PEG-SVA-5000Laysan Bio170-124
Biotinylated anti His antibodyBioss Antibodiesbs-0287R-bio
d-biotinSigma-AldrichB4501
EDTA-free protease inhibitor cocktailRoche11873580001
EMCCD cameraAndorIX897
Guanosine 5′-diphosphate sodium salt (GDP)Sigma-Aldrich G7127
Guanosine 5'-O-[gamma-thio]triphosphate (GTPγS)Roche10220647001
High numerical aperture oil immersion objectiveNikonNikon, 100x, N.A. 1.49, oil immersion
ImageJNIHhttps://imagej.net/ij/
Isopropyl-Β-D-ThiogalactosideSigma-AldrichI5502
LD555-MALLumidyne4
LD655-MALLumidyne10
L-glutamic acid potassiumSigma-AldrichG1501
Magnesium acetate tetrahydrateSigma-AldrichM0631
MatlabThe MathWorks, Natick, MAhttps://www.mathworks.com/
Microscope cover glassFisherbrand18834 (24 mm × 60 mm)
Microscope slidesCustomized, (75 mm × 26 mm × 1 mm) with 6 pairs of 1.2 mm diameter through holes
mPEG-SVA-5000Laysan Bio170-106
Ni Sepharose 6 Fast FlowCytiva17531802
OriginOrigin softwarehttps://www.originlab.com/
Polystyrene particlesQDSphereAG1265
Protocatechuate 3,4-dioxygenaseSigma-AldrichP8279
StreptavidinSangon BiotechA610492
Superdex 200 Increase (10/300 GL)Cytiva28990944
TIRF microscopeNikonTi2
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP)Thermo75259

Referenzen

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