JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Dinamin süper aile proteinlerinin işlevleri, GTP hidrolizi ile birleşen konformasyonel değişikliklere bağlıdır. Farklı nükleotid yükleme durumlarında dinnamin benzeri GTPaz atlastininin konformasyonel dinamiklerini izlemek için tek moleküllü FRET (smFRET) tekniği kullanılarak bir sistem tanımlanmıştır.

Özet

Dinamin benzeri protein atlastinin (ATL) GTPaz alanına göre üç sarmal orta alanın (3HB) sert cisim rotasyonu, endoplazmik retikulum (ER) içindeki homotipik membran füzyonunun çok önemli bir itici gücüdür. Bu süreçteki aksaklıklar, nörodejeneratif bir bozukluk olan kalıtsal spastik parapleji (HSP) ile ilişkilendirilmiştir. Yapısal ve biyokimyasal çalışmalar, ATL'deki konformasyonel değişikliklerin GTP hidrolizi ile bağlantılı olduğunu göstermektedir, ancak GTP hidroliz döngüsü sırasında bu konformasyonel dinamiklerin gerçek zamanlı görselleştirilmesi zor olmaya devam etmektedir. ATL fonksiyonunun arkasındaki mekanik mekanizmaları daha iyi anlamak için, tek moleküllü Förster rezonans enerji transferi (smFRET) kullanıldı. İnsan ATL1'in (ATL1cyto) N-terminal sitozolik bölgesini streptavidin kaplı bir mikroakışkan odada hareketsiz hale getirmek için üç spesifik strateji kullanıldı ve molekül içi ve moleküller arası smFRET görüntülemenin uygulanmasını kolaylaştırdı. Bu, çeşitli nükleotid yükleme durumlarında protein konformasyonlarının hassas bir şekilde izlenmesine izin vererek, bireysel moleküler davranışlar hakkında doğrudan bilgi sağladı. Bu yöntem, diğer mekanokimyasal proteinleri incelemek için de uygulanabilir.

Giriş

Ökaryotik hücrelerde, dinamin süper ailesi proteinleri, membran tübülasyonu, fisyon ve füzyon 1,2,3 dahil olmak üzere biyolojik zarların yeniden şekillenmesine aracılık eder. Bu proteinlerdeki mutasyonlar, nörodejeneratif hastalıklar gibi çeşitli insan hastalıklarına yol açar. Dinamin süper ailesinin üyeleri tipik olarak bir GTPase alanı, sarmal demetlerden oluşan bir orta alan, zar bağlama için bir motif ve bir GTPaz efektör alanı (GED) içerir. Böyle bir dinamik benzeri GTPaz, endoplazmik retikulumun (ER) homotipik membran füzyonunukatalize eden atlastindir (ATL) 4,5,6,7,8,9,10. Memelilerde üç ATL (ATL1-3) vardır. ATL molekülü, bir GTPaz alanı ve üç sarmal bir orta alan (3HB) dahil olmak üzere bir N-terminalsitozolik bölgeden (ATL sito) oluşur, ardından iki transmembran bölgesi gelir, ancak tipik GED'den yoksundur. Alternatif olarak, ATL, membran füzyonunda çok önemli bir rol oynayan bir C-terminal kuyruğu içerir 11,12,13.

Verimli membran füzyonunun, ATLcyto 14,15,16,17,18,19,20'deki GTP hidrolizine bağlı alan yeniden düzenlemesine dayandığı bildirilmiştir. Bununla birlikte, heterotipik membran füzyonunu21 sürmek için konformasyonel değişikliklerden katlanma enerjisini kullanan SNARE kompleksi ile karşılaştırıldığında, ATL ve diğer füzyona özgü dinamin benzeri proteinlerin22 aracılık ettiği homotipik membran füzyon süreci belirsizliğini korumaktadır. Farklı nükleotid yükleme koşullarında insan ATL1sitosunun üç kristal yapısı belirlenmiştir 14,15,16,23. Yapılarda, dimerdeki iki 3HB farklı yönlere işaret eder, ancak ATLsito'nun konformasyonel dinamiklerinin ve GTPaz aktivitesinin nasıl birleştirildiğini açıklayan kapsamlı bir model hala eksiktir.

Önceki modelde, monomerik ATL molekülleri, membran füzyonunu sağlamak için GTP'ye bağlı bir şekilde farklı zarlar boyunca dimerler oluşturur. Burada, tek tek ATL1sito moleküllerinin davranışını doğrudan gözlemlemek ve doğru bir şekilde tespit etmek için tek moleküllü Förster rezonans enerji transferini (smFRET) uygulamak için üç strateji açıklanmaktadır. smFRET, GPCR aracılı β-arrestin aktivasyonu24, Snf225 ile kromatinin yeniden şekillenmesi ve GTP hidroliz döngüleri26 ile birleştirilmiş dinnamin benzeri protein MxA'nın alan yeniden düzenlemeleri gibi tek tek biyomoleküllerin konformasyonel dinamiklerini ve etkileşimlerini gerçek zamanlı olarak araştırmak için yaygın olarak kullanılan güçlü bir tekniktir. smFRET yalnızca ~ 3 nm ila ~ 8 nm arasındaki mesafedeki değişiklikleri etkili bir şekilde tespit edebildiğinden, her nükleotid yükleme durumu için ATL1sito'nun konformasyonlarını kapsamlı bir şekilde analiz etmek için hem moleküller arası hem de molekül içi smFRET deneyleri gereklidir. Alaninler ve K400 (ATL1cyto-K) veya T51 / K400 çifti (ATL1cyto-TK) ile ikame edilmiş tüm doğal sisteinlerin florofor etiketlemesi için sisteine mutasyona uğradığı üç ATL1sito yapısı oluşturduk. Moleküller arası veya molekül içi smFRET deneyleri için STREPTAVIDIN kaplı bir mikroakışkan odada (Şekil 1A) ATL1sito dimer veya monomeri hareketsiz hale getirme stratejileri Şekil 1B-D'de gösterilmiştir. Bu yöntem, GTP hidrolizi27'nin her adımında dinamin benzeri proteinlerin konformasyonel dinamikleri hakkında daha fazla ayrıntı sağlar.

Protokol

Bu çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Protein immobilizasyon odası için modifiye lamel hazırlanması

  1. Hazırlık
    1. Aşırı sıcaklıkları önlemek için konsantre sülfürik aside yavaşça hidrojen peroksit ekleyerek 50 mL piranha çözeltisi (3: 1 oranında konsantre sülfürik asit ve hidrojen peroksitten oluşur) hazırlayın. Çeker ocak içine dikkatlice yerleştirin.
    2. Sodyum etoksit çözeltisi hazırlayın. 2 g NaOH'yi 15 mL ddH2O içinde çözün, 35 mL mutlak etanol ekleyin ve tamamen karıştırın. Oda sıcaklığında bırakın.
    3. Yüksek tuzlu çözelti hazırlayın (0.1 M NaHCO3 ve 0.6 MK2 S04). Tamamen çözün ve 500 μL/tüp alikotlayın. -20 °C'de saklayın.
    4. SVA-mPEG ve SVA-mPEG-biotin'i tüp başına yaklaşık 30 mg ve tüp başına 3 mg olarak aliquot. -20 °C'de saklayın.
    5. Mikroskop slaytlarını (75 mm × 26 mm × 1 mm) 6 çift 1,2 mm çapında deliklerle özelleştirin.
  2. Lamel yüzeyinin temizlenmesi
    1. Sekiz lamel almak için cımbız kullanın ve bunları bir boyama kavanozuna koyun. Lamelleri örtmek için aseton (~ 50 mL) ekleyin, boyama kavanozunu 30 dakika boyunca ultrasonik bir temizleyiciye koyun ve ardından lamelleri ddH2O ile üç kez durulayın.
    2. Lamelleri adım 1.2.1'deki gibi metanol ile yıkayın.
    3. Piranha çözeltisini (adım 1.1.1) boyama kavanozuna ekleyin ve 95 ° C'lik bir su banyosu su ısıtıcısında 2 saat ısıtın. Boyama kavanozu oda sıcaklığına soğuduktan sonra, lamelleri ddH2O ile en az altı kez durulayın.
    4. Sodyum etoksit çözeltisini boyama kavanozuna ekleyin, 15 dakika boyunca ultrasonik bir temizleyiciye koyun ve ardından ddH2O ile üç kez durulayın.
    5. Lamelleri örtmek için boyama kavanozuna ddH2O ekleyin, 15 dakika ultrasonik bir temizleyiciye koyun ve ardından ddH2O ile 3 kez durulayın.
  3. Lamel yüzeyinin aminosilanizasyon modifikasyonu.
    1. Lamelleri boyama kavanozuna temiz bir tezgah üzerine sıkıştırın, nitrojenle kurulayın ve başka bir boyama kavanozuna koyun (önceden kurutulmuş).
    2. Boyama kavanozunu 120 °C'de kurutma fırınında 30 dakika pişirin ve ardından bir desikatörde oda sıcaklığına soğutun.
    3. Behere 47.5 mL metanol, 2.5 mL asetik asit ve 0.5 mL 3-Aminopropiltrietoksisilan (APTES) ekleyin (önceden kurutulmuş), eşit şekilde karıştırın, boyama kavanozuna ekleyin ve 10 dakika inkübe edin.
    4. Boyama kavanozundaki lamelleri ddH2O ile en az üç kez durulayın ve 5 dakika boyunca sonikasyon yapın.
    5. Lamelleri tek tek çıkarın, ddH2O ile durulayın, nitrojen ile kurutun ve PEG modifikasyonuna hazırlanmak için 10 cm çapında bir Petri kabına koyun.
      NOT: APTES modifikasyonu kuru bir ortamda yapılmalıdır.
  4. Lamel yüzeyinin SVA-mPEG-Biotin ve SVA-mPEG ile modifikasyonu
    NOT: Lamel yüzeyinin biyotin modifikasyonu, streptavidin yoluyla biyotinile proteinlerin (veya biyotin-anti-His'e bağlanan proteinlerin) korunmasına yardımcı olur.
    1. Paketlenmiş SVA-mPEG ve SVA-mPEG-Biotin'i yüksek tuzlu çözeltide (10 μL yüksek tuzlu çözeltiye karşılık gelen 1 mg) tamamen çözün. SVA-mPEG-Biotin solüsyonunu SVA-mPEG solüsyonuna 1:100 oranında ekleyin.
      NOT: SVA-MPEG veya SVA-mPEG-Biotin'in tamamen çözüldüğünden emin olmak için çözeltiyi sallamak için bir girdap kullanın. SVA-mPEG veya SVA-mPEG-Biotin sulu çözeltisi kullanımdan önce hazırlanmalıdır.
    2. Hazırlanan karışım çözeltisini bir lamel üzerine bırakın ve başka bir lamel ile örtün. Bu işlem kabarcık oluşumunu önlemelidir. Lamelleri 2 saatten fazla veya gece boyunca uygun nemde tamamen inkübe edin.
    3. Modifikasyon tamamlandıktan sonra lamelleri ayırın, ddH2O ile durulayın ve nitrojen ile kurutun. SVA-mPEG ve SVA-mPEG-biotin ile modifiye edilmemiş lamel yüzeyini işaretleyin.
    4. Modifiye edilmiş lamel dikkatlice 50 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. Süpürdükten sonra -20 °C'de saklayınız.
      NOT: Modifiye edilmiş lamel 1 ay boyunca vakum altında saklanabilir.

2. Protein immobilizasyon odası için mikroskop slaytlarının hazırlanması

  1. Mikroskop slaytlarını adım 1.2'deki lameller için açıklandığı gibi yıkayın.
  2. Mikroskop slaytlarını nitrojen ile kurulayın ve 50 mL mikrosantrifüj tüplerine koyun.
  3. Mikroskop slaytlarını adım 1.4.4'te açıklandığı gibi saklayın.

3. Protein ekspresyonu ve saflaştırılması

  1. Hazırlık
    1. Plazmitler: İlgilenilen atlastin ailesi üyesini veya ilgilenilen patojenik mutasyonu bir bakteri ekspresyon vektörüne, örneğin pET-28a'ya klonlayın ve bir Avitag27 ekleyin. Sisteinleri bölgeye yönelik mutajenez ile ilgili pozisyonlarda tanıtın (örneğin, T51C ve K400C27).
    2. Aşağıdaki arabellekleri hazırlayın.
      1. Luria-Bertani (LB) kültür ortamı: 10 g tripton, 5 g maya özü ve 10 g sodyum klorürü 1 L ddH2O'da karıştırın. 121 ° C'de 20 dakika boyunca otoklav.
      2. Lizis tamponu: 25 mM HEPES (pH 7.4), 150 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1x tam EDTA içermeyen proteaz inhibitör kokteyli, 10 mM imidazol ve 0.5 mM TCEP'i karıştırın. 4 °C'de saklayın.
      3. Yıkama tamponu: 25 mM HEPES (pH 7.4), 150 mM KCl, 5 mM MgCl2, 30 mM imidazol ve 0.5 mM Tris(2-karboksietil)fosfin hidroklorür (TCEP) karıştırın. 4 °C'de saklayın.
      4. Elute tamponu: 25 mM HEPES (pH 7.4), 150 mM KCl, 5 mM MgCl2, 150 mM imidazol ve 0.5 mM TCEP'i karıştırın. 4 °C'de saklayın.
      5. Saflaştırma tamponu: 25 mM HEPES (pH 7.4), 150 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0.5 mM TCEP. 4 °C'de saklayın.
  2. Protein saflaştırma
    1. Plazmitleri27 Bakteriyel transformasyon ısı şoku yöntemlerini kullanarak Rosetta (DE3) (Biomed) E. coli hücrelerine aktarın. Transfer edilen hücreleri, 50 μg / μL kanamisin ilave edilmiş nihai konsantrasyon ile LB kültür ortamında askıya alın.
      1. 600 nm'de kültür ortamının emilimi 0.6-0.8 olana kadar 37 ° C'de kültür. Protein ekspresyonunu 20-24 saat boyunca 16 ° C'de indüklemek için 50 μM'lik bir nihai konsantrasyonda izopropil-β-D-tiyogalaktozit (IPTG) ekleyin.
        NOT: Bakteriyel veya diğer mikrobiyal hücre kültürlerinin büyüme hızı, 600 nm'de hücre büyüme kültürünün optik yoğunluğu (absorbans) ölçülerek izlenebilir.
    2. Hücreleri oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 4000 × g'da santrifüjleme ile hasat edin. Süpernatanı atın.
    3. Hücre peletini 30 mL lizis tamponu ile yeniden süspanse edin. Yüksek basınçlı bir hücre kırıcı kullanarak hücreleri üç kez parçalayın.
    4. Lizatları, bir ultrasantrifüj rotoru kullanarak 2,00,000 ° C'de 1 saat boyunca 4 × g'da santrifüjleme yoluyla berraklaştırın.
    5. Bir Ni-NTA sütunu kullanarak proteini izole edin. Ni-NTA kolonunu 5 kolon hacmi için yıkama tamponu ile yıkayın. 1 sütun hacmi için elüsyon tamponu ile elute proteini. Elüatı toplayın ve santrifüjlü filtreler kullanarak ~ 500 μL'ye konsantre edin.
    6. Ayrıca, proteini boyut dışlama kromatografisi27 ile saflaştırın. Elüatı toplayın (tüp başına 500 μL).
    7. Hedef proteini, sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE)27 ile belirlenen moleküler ağırlığı ile onaylayın. Daha fazla modifikasyon için hedef proteini toplayın.

4. Protein biyotinilasyonu

  1. Hazırlık
    1. Aşağıdaki stok çözeltilerini hazırlayın.
      1. Magnezyum Asetat Tetrahidratı (MgOAc·4H2O) 25 mM HEPES tamponunda (pH 7.7) 100 mM (10×) konsantrasyonda çözün. Tüp başına 100 μL ekleyin ve -20 °C'de saklayın.
      2. Adenozin 5-trifosfat disodyum tuzunu (ATP)ddH2O'da100 mM (10×) konsantrasyonda çözün. NaOH kullanarak pH'ı 7.4'e ayarlayın. Tüp başına 100 μL ekleyin ve -80 °C'de saklayın.
      3. D-biotin'i ddH2O'da 500 μM konsantrasyonda çözün. Aliquot tüp başına 100 μL ve -20 ° C'de saklayın.
      4. Streptavidini 1 mg / mL'lik bir konsantrasyonda ddH2O'da çözün. Tüp başına 20 μL ekleyin ve -20 °C'de saklayın.
    2. Protein biyotinilasyon tamponu: 25 mM HEPES (pH 7.7), 200 mM L-glutamik asit potasyum ve 0.5 mM TCEP ekleyin. 4 °C'de saklayın.
    3. BirA biotin ligazını saflaştırın ve -80 °C'de saklayın.
  2. Protein biyotinilasyonu
    1. Protein tamponunu protein biyotinilasyon tamponuna değiştirin. Biyotinilasyon için 100 μL 100 mM ATP, 100 μL 100 mM MgOAc, 100 μL 500 μM d-biotin, 10 μL 100 μM BirA biotin ligaz, 50 μM proteini 1 mL'lik nihai hacme karıştırın ve gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
    2. 10 K MWCO santrifüj filtre kullanarak serbest d-biotin'i çıkarın.
    3. 20 μL biyotinile proteini 20 μL 15 μM streptavidin ile buz üzerinde 20 dakika inkübe edin. SDS-PAGE27 ile protein biyotinilasyonunun etkinliğini tespit edin.

5. Protein florofor etiketleme

  1. Hazırlık
    1. LD555 (verici) ve LD655 (alıcı) floroforlarını dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 5 mM'lik bir nihai konsantrasyona çözün. -20 °C'de saklayın.
    2. Etiketleme tamponunu hazırlayın: 25 mM HEPES (pH 7.4), 150 mM KCl ve 5 mM MgCl2'yikarıştırın. 4 °C'de saklayın.
    3. Protein tamponunu etiketleme tamponu olarak değiştirin.
  2. Florofor etiketleme
    1. Molekül içi smFRET testleri için, ATL1sito-TK'yi LD555 ve LD655 ile 1: 1.2: 1.2 oranında 100 μL'lik bir nihai hacme karıştırın (toplam florofor hacmi 1 μL'yi geçmemelidir) ve 4 ° C'de 5 saat inkübe edin.
    2. Moleküller arası smFRET deneyleri için, ATL1cyto-K veya ATL1cyto-T'yi LD555 ile 1: 1.2 oranında inkübe edin ve aynı anda biyotinile ATL1cyto-K'yi LD655 ile 1: 1.2 oranında inkübe edin, 4 ° C'de 5 saat boyunca (5.2.1'deki ile aynı inkübasyon hacmi).
      NOT: Protein ve boyaların birlikte inkübasyonu, LD555 (verici) ve LD655 (alıcı) için etiketleme konumlarında esneklik sağlar. LD555'in T51C veya K400C olarak etiketlenmiş olması, FRET deneyinin sonuçlarını etkilemez. T51C bölgesinde etiketlenen donörün şematik bir diyagramı sağlanmıştır (Şekil 1C,D).
    3. 7 K MWCO spin tuz giderme kolonları27 kullanarak fazla serbest floroforları çıkarın.
    4. TCEP'yi florofor etiketli proteinlere 0.5 mM'lik bir nihai konsantrasyonda ekleyin.
    5. Bir spektrofotometre kullanarak proteinlerin etiketleme verimliliğini tespit edin. 280 nm'de protein emilimini, 555 nm'de LD555 emilimini ve 655 nm'de LD555 emilimini ölçün ve sırasıyla yok olma katsayılarını kullanarak molar konsantrasyonları hesaplayın. Protein etiketleme verimliliği = (floresan boyanın molar konsantrasyonu / proteinin molar konsantrasyonu) x% 100.

6. Tek moleküllü FRET görüntüleme

  1. Hazırlık
    1. Kuluçka tamponunu hazırlayın: 25 mM HEPES (pH 7.4), 150 mM KCl ve 5 mMMgCl2'yi karıştırın. 4 °C'de saklayın.
    2. Proteinlerin immobilizasyonu için 1 mg / mL streptavidin (ddH2O içinde çözülmüş) ve 1 mg / mL biyotinile anti-He antikoru hazırlayın.
    3. SmFRET deneyleri sırasında fotoağartmayı en aza indirmek için 25 mM benzoik asit (pH 7.4; 7.1.1'de tarif edildiği gibi tamponda çözülür) ve 100 mM protokatekuat 3,4-dioksijenaz (PCD) (% 40 gliserin çözeltisi içinde çözülür) hazırlayın.
    4. 100 mM Guanozin 5'-difosfat sodyum tuzu (GDP), Guanozin 5'-O- [gama-tiyo]trifosfat (GTPγS) ve ddH2O içinde çözünmüş AlCl3 stok çözeltileri hazırlayın. ddH2O içinde çözünmüş 1 M NaF stok çözeltisi hazırlayın.
    5. Vakumla korunmuş lamel ve mikroskop lamını çıkarın ve temiz bir tezgah üzerinde özelleştirilmiş çift taraflı bantla dikkatlice birbirine yapıştırın. Altı kanallı bir mikroakışkan oda oluşturmak için hortumları ve uçlarıtakın 27.
      NOT: Değiştirilmiş lamel uzun süre havaya maruz bırakmayın. smFRET deneylerine başlamadan önce mikroakışkan odasını27 hazırlayın.
  2. Eşleme düzeltmesi
    NOT: Deney sırasında, floresan sinyalleri sırasıyla verici ve alıcı kanallardan toplanmalıdır. Mikroskop kullanımına bağlı olarak, verici ve alıcı kanalların izleme alanlarında hafif sapmalar olabilir. İzleme alanlarındaki sapmayı azaltmak için, deneye başlamadan önce haritalama kalibrasyonu yapılmalıdır.
    1. % 10 polistiren parçacıklarını (çap 3 μm) iyice karıştırın, bir mikroskop lamına (değiştirilmemiş) 10 μL parçacık ekleyin ve bir lamel (değiştirilmemiş) ile örtün.
    2. Mümkün olduğunca çok sayıda polistiren parçacığı içeren bir görüş alanı seçin. Toplam dahili yansıma floresan (TIRF) mikroskobunu kullanarak parlak bir alan altında video çekin.
      NOT: Yüksek çözünürlüklü görüntüleme için yüksek sayısal açıklıklı yağa daldırma objektifi (100x) kullanılmıştır. smFRET deneyleri için, sinyaller bir EMCCD kamera kullanılarak 30 ms kare aralıklarla yakalandı.
    3. Donör kanalındaki ve alıcı kanaldaki aynı polistiren parçacığının merkez konumunu hizalamak için özel bir komut dosyası kullanın ve harita dosyasını bir txt dosyası olarak kaydedin. Bu çalışmada kullanılan özel MATLAB kodu https://github.com/yangchenguang-1994/HMM-FRET) adresinde mevcuttur.
  3. Odadaki proteinlerin hareketsiz hale getirilmesi
    1. Moleküller arası smFRET deneyleri için, LD555 etiketli ATL1sito-K veya ATL1sito-T ve LD655 etiketli ATL1sito-K-biyotin'i 1: 1 oranında 1 mM GTPγS veya GDP/AlF4- nihai konsantrasyonu ile karıştırın ve proteini dimerize etmek için buz üzerinde 1 saat inkübe edin.
    2. ATL1sito-T ve ATL1sito-K moleküller arası smFRET deneyleri için, LD555 etiketli ATL1sito-T ve LD655 etiketli ATL1sito-K-biyotin'i 1: 1 oranında 1 mM GTPγS veya GDP/AlF4- nihai konsantrasyonu ile karıştırın ve dimerize proteinler elde etmek için buz üzerinde 1 saat inkübe edin.
    3. Molekül içi smFRET tahlilleri için, GSYİH koşulları altında smFRET deneylerini gerçekleştirmeden önce LD555 ve LD655 etiketli ATL1sito-TK'yi 1 mM GDP ile buz üzerinde 1 saat inkübe edin.
    4. Moleküller arası smFRET deneyleri için, proteinleri hareketsiz hale getirmek için 10 μg / mL streptavidin (200 μL inkübasyon tamponu ile seyreltin) 10 dakika inkübe edin. Molekül içi smFRET testleri için, 10 μg / mL biyotinile anti-His antikoru (200 μL inkübasyon tamponu ile seyreltilmiş) ekleyin ve proteinleri hareketsiz hale getirmek için 10 dakika inkübe edin. Her bir çözeltiyi eklemeden önce kanalı bir inkübasyon tamponu ile bir kez yıkayın.
    5. 200 μL inkübasyon tamponunda ATL1 dimerini ~ 0.3 nM'ye veya monomeri ~ 1 nM'ye seyreltin ve kanaldaki proteinleri hareketsiz hale getirmek için 10 dakika inkübe edin. Kanalı inkübasyon tamponu ile iki kez yıkayın. Kanala 2.5 mM'lik bir nihai konsantrasyonda (200 μL tampon ile seyreltilmiş) benzoik asit ve PCD ekleyin.
      NOT: GTP hidroliz işleminde ATL1sito moleküllerinin farklı aşamalarını simüle etmek için, proteini kanalda hareketsiz hale getirdikten sonra her adımda tamponlara 1 mM'lik bir nihai konsantrasyonda nükleotid (GDP, GTPγS ve GDP/AlF4-) ilave edildi. GTPγS ilavesi GTP bağlanmasını taklit eder, GDP/AlF4 ilavesi GTP hidrolizini taklit eder, GDP ilavesi Pi salınımını taklit eder ve apo sat GSYİH salınımını temsil eder.
  4. smFRET görüntüleme
    1. Odak düzlemini ayarlayın. Kaba ve ince odak düğmelerini kullanın, örneği keskin odağa getirmek için odak düzlemini ayarlayın. Burada, optimum odaklamayı elde etmek için otomatik bir odaklama sistemi kullanıldı.
    2. Uyarma kaynağını ayarlayın. Uyarma ışık kaynağı olarak 532 nm lazeri kullanın. Floroforları uyarmak için lazer gücünü uygun bir seviyeye ayarlayın. Burada 20-40 mW'lık bir lazer gücü kullanıldı.
    3. EMCCD kamerayı mikroskoba bağlayın. Kamerayı 30 ms'lik bir kare aralığında kayıt yapacak şekilde ayarlayın. Kameranın, yüksek çözünürlüklü veriler için 16 bit modunda görüntü çekecek şekilde ayarlandığından emin olun.
    4. Filmi kaydedin ve çekim boyunca odağın sabit kalmasını sağlayın. Floresan sinyallerini kaydederken floresan moleküllerinin çoğu söndürülene kadar 532nm lazer ışınlama süresini mümkün olduğu kadar uzatın.
    5. Daha fazla analiz için kaydedilen filmleri 16 bit TIFF formatında kaydedin.

7. Veri toplama ve analizi

  1. Kaydedilen filmlerden FRET yörüngelerini çıkarmadan önce düzeltme için harita txt dosyasını yükleyin. FRET yörüngelerini seçin ve daha fazla analiz için her FRET yörünge verisini txt formatında kaydedin.
  2. Verileri txt dosyalarından çıkarın ve Matlab2022a'da ev yapımı komut dosyalarını kullanarak FRET değerlerini hesaplayın. Özel MATLAB kodu https://github.com/yangchenguang-1994/HMM-FRET'da mevcuttur.
    NOT: FRET değeri, ILD655/(γILD555+ILD655) denklemi kullanılarak hesaplanır. ILD555 ve ILD655 , sırasıyla LD555 ve LD655 floresan yoğunluklarını temsil eder. γ, γ = FA/F D formülüyle elde edilen bir parametredir. FA, alıcı yoğunluğunun azalmasını temsil ederve FD, donör yoğunluğunun artışıdır.
  3. Dağılım histogramını elde etmek için smFRET verilerini GaussAmp ile Origin 2022'ye sığdırın.
    NOT: Birden fazla FRET durumuna sahip veriler için (moleküller arası smFRET'te GTPγS koşulu altındaki veriler veya GDP veya Apo koşulu altında molekül içi smFRET verileri), çok tepeli bağlantı kullanılabilir.

Sonuçlar

SmFRET deneyleri, her 30 ms'de bir floroforların floresan yoğunluğu yakalanarak bir TIRF mikroskobu üzerinde gerçekleştirildi. Farklı nükleotidlerin yokluğunda veya varlığında LD555 (verici) ve/veya LD655 (alıcı) etiketli ATL1sito moleküllerinin temsili görüntüleri Şekil 2A-C'de gösterilmektedir. İki floroforun tek tek parçacıklar üzerindeki floresan yoğunlukları kaydedildi ve tipik tek m...

Tartışmalar

FRET teknolojisi, iki floresan boya (verici ve alıcı) arasındaki enerji transferine dayanır. Birbirlerine yakınlıkları durumunda (genellikle 1-10 nm), uyarılmış donör enerjisini alıcıya aktarır, bu da donör floresan yoğunluğunda bir azalmaya ve alıcı floresan yoğunluğunda bir artışa neden olur.

smFRET deneylerinde, moleküller çok düşük konsantrasyonlara seyreltilir ve slaytlar üzerinde hareketsiz hale getirilir ve tek tek moleküll...

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

X.B., Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (32371287), Merkezi Üniversiteler için Temel Araştırma Fonları (63223043 ve 63233053) ve Nankai Üniversitesi'ndeki Yetenek Eğitimi Projesi (035-BB042112) tarafından desteklenmektedir. YL, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (12022409 ve T2221001) ve CAS Sınır Bilimleri Anahtar Araştırma Programı (ZDBS-LY-SLH015) tarafından desteklenmektedir. LM, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (32271274 ve 31770812) tarafından desteklenmektedir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
10 K Centrifugal FiltersAmiconUFC901096
3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES) Sigma-Aldrich440140
45 Ti rotor
532-nm laserOlympus
640-nm laserOlympus
7 K MWCO spin desalting columnsThermo Scientific89882
Adenosine 5-triphosphate disodium salt (ATP)Roche11140965001
Benzoic acidSigma-Aldrich242381
Biotin-PEG-SVA-5000Laysan Bio170-124
Biotinylated anti His antibodyBioss Antibodiesbs-0287R-bio
d-biotinSigma-AldrichB4501
EDTA-free protease inhibitor cocktailRoche11873580001
EMCCD cameraAndorIX897
Guanosine 5′-diphosphate sodium salt (GDP)Sigma-Aldrich G7127
Guanosine 5'-O-[gamma-thio]triphosphate (GTPγS)Roche10220647001
High numerical aperture oil immersion objectiveNikonNikon, 100x, N.A. 1.49, oil immersion
ImageJNIHhttps://imagej.net/ij/
Isopropyl-Β-D-ThiogalactosideSigma-AldrichI5502
LD555-MALLumidyne4
LD655-MALLumidyne10
L-glutamic acid potassiumSigma-AldrichG1501
Magnesium acetate tetrahydrateSigma-AldrichM0631
MatlabThe MathWorks, Natick, MAhttps://www.mathworks.com/
Microscope cover glassFisherbrand18834 (24 mm × 60 mm)
Microscope slidesCustomized, (75 mm × 26 mm × 1 mm) with 6 pairs of 1.2 mm diameter through holes
mPEG-SVA-5000Laysan Bio170-106
Ni Sepharose 6 Fast FlowCytiva17531802
OriginOrigin softwarehttps://www.originlab.com/
Polystyrene particlesQDSphereAG1265
Protocatechuate 3,4-dioxygenaseSigma-AldrichP8279
StreptavidinSangon BiotechA610492
Superdex 200 Increase (10/300 GL)Cytiva28990944
TIRF microscopeNikonTi2
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP)Thermo75259

Referanslar

  1. Jimah, J. R., Hinshaw, J. E. Structural insights into the mechanism of dynamin superfamily proteins. Trends Cell Biol. 29 (3), 257-273 (2019).
  2. Kalia, R., Frost, A. Open and cut: Allosteric motion and membrane fission by dynamin superfamily proteins. Mol Biol Cell. 30 (17), 2097-2104 (2019).
  3. Ramachandran, R., Schmid, S. L. The dynamin superfamily. Curr Biol. 28 (8), R411-R416 (2018).
  4. Bryce, S., et al. Human atlastin-3 is a constitutive ER membrane fusion catalyst. J Cell Biol. 222 (7), e202211021 (2023).
  5. Crosby, D., et al. Reconstitution of human atlastin fusion activity reveals autoinhibition by the C terminus. J Cell Biol. 221 (2), e202107070 (2022).
  6. Hu, J., et al. A class of dynamin-like GTPases involved in the generation of the tubular er network. Cell. 138 (3), 549-561 (2009).
  7. Jang, E., et al. Human atlastins are sufficient to drive the fusion of liposomes with a physiological lipid composition. J Cell Biol. 222 (4), e202109090 (2023).
  8. Liu, X., et al. Atlastin-1 regulates morphology and function of endoplasmic reticulum in dendrites. Nat Commun. 10 (1), 568 (2019).
  9. Orso, G., et al. Homotypic fusion of ER membranes requires the dynamin-like gtpase atlastin. Nature. 460 (7258), 978-983 (2009).
  10. Rismanchi, N., Soderblom, C., Stadler, J., Zhu, P. P., Blackstone, C. Atlastin GTPases are required for Golgi apparatus and er morphogenesis. Hum Mol Genet. 17 (11), 1591-1604 (2008).
  11. Faust, J. E., et al. The atlastin C-terminal tail is an amphipathic helix that perturbs the bilayer structure during endoplasmic reticulum homotypic fusion. J Biol Chem. 290 (8), 4772-4783 (2015).
  12. Liu, T. Y., et al. Lipid interaction of the c terminus and association of the transmembrane segments facilitate atlastin-mediated homotypic endoplasmic reticulum fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (32), E2146-E2154 (2012).
  13. Moss, T. J., Andreazza, C., Verma, A., Daga, A., Mcnew, J. A. Membrane fusion by the GTPase atlastin requires a conserved c-terminal cytoplasmic tail and dimerization through the middle domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (27), 11133-11138 (2011).
  14. Bian, X., et al. Structures of the atlastin GTpase provide insight into homotypic fusion of endoplasmic reticulum membranes. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (10), 3976-3981 (2011).
  15. Byrnes, L. J., et al. Structural basis for conformational switching and GTP loading of the large g protein atlastin. EMBO J. 32 (3), 369-384 (2013).
  16. Byrnes, L. J., Sondermann, H. Structural basis for the nucleotide-dependent dimerization of the large g protein atlastin-1/spg3a. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (6), 2216-2221 (2011).
  17. Morin-Leisk, J., et al. An intramolecular salt bridge drives the soluble domain of gtp-bound atlastin into the postfusion conformation. J Cell Biol. 195 (4), 605-615 (2011).
  18. Pendin, D., et al. GTP-dependent packing of a three-helix bundle is required for atlastin-mediated fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (39), 16283-16288 (2011).
  19. Winsor, J., Hackney, D. D., Lee, T. H. The crossover conformational shift of the GTPase atlastin provides the energy driving ER fusion. J Cell Biol. 216 (5), 1321-1335 (2017).
  20. Yan, L., et al. Structures of the yeast dynamin-like GTPase sey1p provide insight into homotypic er fusion. J Cell Biol. 210 (6), 961-972 (2015).
  21. Rizo, J. Molecular mechanisms underlying neurotransmitter release. Annu Rev Biophys. 51, 377-408 (2022).
  22. Gao, S., Hu, J. Mitochondrial fusion: The machineries in and out. Trends Cell Biol. 31 (1), 62-74 (2021).
  23. Kelly, C. M., Byrnes, L. J., Neela, N., Sondermann, H., O'donnell, J. P. The hypervariable region of atlastin-1 is a site for intrinsic and extrinsic regulation. J Cell Biol. 220 (11), e202104128 (2021).
  24. Asher, W. B., et al. GPCR-mediated beta-arrestin activation deconvoluted with single-molecule precision. Cell. 185 (10), 1661-1675.e16 (2022).
  25. Li, M., et al. Mechanism of DNA translocation underlying chromatin remodelling by snf2. Nature. 567 (7748), 409-413 (2019).
  26. Chen, Y., et al. Conformational dynamics of dynamin-like MXA revealed by single-molecule fret. Nat Commun. 8, 15744 (2017).
  27. Shi, L., et al. Dissecting the mechanism of atlastin-mediated homotypic membrane fusion at the single-molecule level. Nat Commun. 15 (1), 2488 (2024).
  28. Guelly, C., et al. Targeted high-throughput sequencing identifies mutations in atlastin-1 as a cause of hereditary sensory neuropathy type i. Am J Hum Genet. 88 (1), 99-105 (2011).
  29. Montagna, A., Vajente, N., Pendin, D., Daga, A. In vivo analysis of CRISPR/Cas9 induced atlastin pathological mutations in drosophila. Front Neurosci. 14, 547746 (2020).
  30. Ulengin, I., Park, J. J., Lee, T. H. ER network formation and membrane fusion by atlastin1/spg3a disease variants. Mol Biol Cell. 26 (9), 1616-1628 (2015).
  31. Zhao, X., et al. Mutations in a newly identified GTPase gene cause autosomal dominant hereditary spastic paraplegia. Nat Genet. 29 (3), 326-331 (2001).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyokimyaSay 215Dinamin Benzeri GTPazAtlastinHomotipik Membran F zyonuEndoplazmik RetikulumKal tsal Spastik ParaplejiGTP HidroliziSmFRET G r nt lemeN terminal Sitozolik B lgeProtein KonformasyonlarN kleotid Y kleme DurumlarMekanokimyasal Proteinler

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır