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Resumo

As funções das proteínas da superfamília da dinamina dependem de mudanças conformacionais associadas à hidrólise do GTP. Um sistema é descrito usando a técnica FRET de molécula única (smFRET) para monitorar a dinâmica conformacional da GTPase aplastina semelhante à dinamina em diferentes estados de carga de nucleotídeos.

Resumo

A rotação de corpo rígido do domínio médio de três hélices (3HB) em relação ao domínio GTPase da proteína atlastina semelhante à dinamina (ATL) é um fator crucial da fusão da membrana homotípica dentro do retículo endoplasmático (ER). Interrupções nesse processo têm sido associadas à paraplegia espástica hereditária (PHS), um distúrbio neurodegenerativo. Estudos estruturais e bioquímicos sugerem que as mudanças conformacionais na ATL estão ligadas à hidrólise do GTP, mas a visualização em tempo real dessas dinâmicas conformacionais durante o ciclo de hidrólise do GTP permanece um desafio. Para entender melhor os mecanismos mecânicos por trás da função ATL, foi utilizada a transferência de energia de ressonância de Förster de molécula única (smFRET). Três estratégias específicas foram empregadas para imobilizar a região citosólica N-terminal do ATL1 humano (ATL1cyto) em uma câmara microfluídica revestida com estreptavidina, facilitando a aplicação de imagens smFRET intramoleculares e intermoleculares. Isso permitiu o monitoramento preciso das conformações de proteínas em vários estados de carga de nucleotídeos, fornecendo informações diretas sobre comportamentos moleculares individuais. Este método também pode ser aplicado para estudar outras proteínas mecanoquímicas.

Introdução

Em células eucarióticas, as proteínas da superfamília da dinamina medeiam a remodelação de membranas biológicas, incluindo tubulação, fissão e fusão da membrana 1,2,3. Mutações nessas proteínas levam a uma variedade de doenças humanas, como doenças neurodegenerativas. Os membros da superfamília dinamina normalmente contêm um domínio GTPase, um domínio médio que consiste em feixes helicoidais, um motivo para ligação à membrana e um domínio efetor GTPase (GED). Uma dessas GTPase semelhante à dinamina é a alastina (ATL), que catalisa a fusão homotípica da membrana do retículo endoplasmático (RE) para formar uma rede 4,5,6,7,8,9,10. Existem três ATLs (ATL1-3) em mamíferos. A molécula ATL consiste em uma região citosólica N-terminal (ATL cyto), incluindo um domínio GTPase e um domínio médio de três hélices (3HB), seguido por duas regiões transmembrana, mas não possui o GED típico. Alternativamente, o ATL contém uma cauda C-terminal que desempenha um papel crucial na fusão da membrana11 , 12 , 13 .

Foi relatado que a fusão eficiente da membrana depende do rearranjo de domínio dependente da hidrólise de GTP emATL cyto 14,15,16,17,18,19,20. No entanto, em comparação com o complexo SNARE, que usa energia de dobramento de mudanças conformacionais para conduzir a fusão de membrana heterotípica21, o processo de fusão de membrana homotípica mediado por ATL e outras proteínas semelhantes a dinamina específicas de fusão22 permanece indescritível. Três estruturas cristalinas de ATL1citose humano foram determinadas em diferentes condições de carga de nucleotídeos 14,15,16,23. Nas estruturas, os dois 3HBs no dímero apontam em direções diferentes, mas ainda falta um modelo abrangente que explique como a dinâmica conformacional docitoplasma ATL e sua atividade GTPase são acopladas.

No modelo anterior, as moléculas monoméricas de ATL formam dímeros em diferentes membranas de maneira dependente de GTP para impulsionar a fusão da membrana. Aqui, três estratégias são descritas para aplicar a transferência de energia de ressonância de Förster de molécula única (smFRET) para observar diretamente e detectar com precisão o comportamento de moléculasindividuais de citoplasma ATL1. smFRET é uma técnica poderosa amplamente utilizada para investigar a dinâmica conformacional e as interações de biomoléculas individuais em tempo real, como a ativação da β-arrestina mediada por GPCR24, remodelação da cromatina por Snf225 e rearranjos de domínio da proteína semelhante à dinamina MxA juntamente com ciclos de hidrólise de GTP26. Como o smFRET só pode detectar efetivamente mudanças na distância de ~ 3 nm a ~ 8 nm, os experimentos de smFRET intermoleculares e intramoleculares são necessários para analisar de forma abrangente as conformações docitocinto ATL1 para cada estado de carga de nucleotídeo. Geramos três construções decitocina ATL1 com todas as cisteínas nativas substituídas por alaninas e K400 (ATL1cito-K) ou o par T51/K400 (ATL1cito-TK) mutado em cisteína para marcação de fluoróforo. As estratégias para imobilizar o dímero ou monômerode cito ATL1 em uma câmara microfluídica revestida com estreptavidina (Figura 1A) para experimentos de smFRET intermoleculares ou intramoleculares são mostradas na Figura 1B-D. Este método fornece mais detalhes sobre a dinâmica conformacional de proteínas semelhantes à dinamina em cada etapa da hidrólise do GTP27.

Protocolo

Os detalhes dos reagentes e equipamentos usados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação de lamínula modificada para câmara de imobilização de proteínas

  1. Preparação
    1. Prepare 50 mL de solução de piranha (composta de ácido sulfúrico concentrado e peróxido de hidrogênio na proporção de 3:1) adicionando lentamente peróxido de hidrogênio ao ácido sulfúrico concentrado para evitar temperaturas excessivas. Coloque-o cuidadosamente em uma hotte.
    2. Prepare a solução de etóxido de sódio. Dissolva 2 g de NaOH em 15 mL de ddH2O, adicione 35 mL de etanol absoluto e misture completamente. Deixe em temperatura ambiente.
    3. Prepare a solução com alto teor de sal (0,1 M de NaHCO3 e 0,6 M de K2SO4). Dissolver completamente e alíquota 500 μL/tubo. Conservar a -20 °C.
    4. Alíquota SVA-mPEG e SVA-mPEG-biotina em aproximadamente 30 mg por tubo e 3 mg por tubo. Conservar a -20 °C.
    5. Personalize as lâminas do microscópio (75 mm × 26 mm × 1 mm) com 6 pares de orifícios de 1,2 mm de diâmetro.
  2. Limpando a superfície da lamínula
    1. Use uma pinça para pegar oito lamínulas e coloque-as em um frasco de coloração. Adicione acetona (~ 50 mL) para cobrir as lamínulas, coloque o frasco de coloração em um limpador ultrassônico por 30 min e, em seguida, enxágue as lamínulas três vezes com ddH2O.
    2. Lave as lamínulas com metanol como na etapa 1.2.1.
    3. Adicione a solução de piranha (passo 1.1.1) ao frasco de coloração e aqueça-a numa chaleira em banho-maria a 95 °C durante 2 h. Depois que o frasco de coloração esfriar até a temperatura ambiente, lave as lamínulas pelo menos seis vezes com ddH2O.
    4. Adicione a solução de etóxido de sódio no frasco de coloração, coloque-o em um limpador ultrassônico por 15 min e depois enxágue três vezes com ddH2O.
    5. Adicione ddH2O ao frasco de coloração para cobrir as lamínulas, coloque em um limpador ultrassônico por 15 min e, posteriormente, enxágue 3 vezes com ddH2O.
  3. Modificação da aminossilanização da superfície da lamínula.
    1. Prenda as lamínulas no frasco de coloração em uma bancada limpa, seque-as com nitrogênio e coloque-as em outro frasco de coloração (seco com antecedência).
    2. Asse o frasco de coloração em um forno de secagem a 120 ° C por 30 min e depois resfrie até a temperatura ambiente em um dessecador.
    3. Adicione 47,5 mL de metanol, 2,5 mL de ácido acético e 0,5 mL de 3-aminopropiltrietoxissilano (APTES) ao béquer (seco com antecedência), misture uniformemente, adicione ao frasco de coloração e incube por 10 min.
    4. Enxágue as lamínulas no frasco de coloração com ddH2O pelo menos três vezes e sonice por 5 min.
    5. Retire as lamínulas uma a uma, enxágue com ddH2O, seque com nitrogênio e coloque-as em uma placa de Petri de 10 cm de diâmetro para se preparar para a modificação do PEG.
      NOTA: A modificação do APTES deve ser realizada em ambiente seco.
  4. Modificação da superfície da lamínula com SVA-mPEG-Biotina e SVA-mPEG
    NOTA: A modificação da biotina da superfície da lamínula ajuda a reter proteínas biotiniladas (ou proteínas que se ligam à biotina-anti-His) via estreptavidina.
    1. Dissolva completamente o SVA-mPEG e o SVA-mPEG-Biotina embalados na solução com alto teor de sal (1 mg correspondendo a 10 μL de solução com alto teor de sal). Adicione a solução de SVA-mPEG-Biotina à solução de SVA-mPEG na proporção de 1:100.
      NOTA: Use um vórtice para agitar a solução para garantir que SVA-mPEG ou SVA-mPEG-Biotina esteja completamente dissolvido. A solução aquosa SVA-mPEG ou SVA-mPEG-Biotina deve ser preparada antes do uso.
    2. Coloque a solução de mistura preparada em uma lamínula e cubra-a com outra lamínula. Este processo deve evitar a geração de bolhas. Incube as lamínulas totalmente com umidade adequada por mais de 2 h ou durante a noite.
    3. Separe as lamínulas após a conclusão da modificação, enxágue-as com ddH2O e seque com nitrogênio. Marque a superfície da lamínula que não foi modificada com SVA-mPEG e SVA-mPEG-biotina.
    4. Coloque cuidadosamente a lamínula modificada em um tubo de microcentrífuga de 50 mL. Conservar a -20 °C após a aspiração.
      NOTA: A lamínula modificada pode ser armazenada sob vácuo por 1 mês.

2. Preparação de lâminas de microscópio para câmara de imobilização de proteínas

  1. Lave as lâminas do microscópio conforme descrito para lamínulas na etapa 1.2.
  2. Seque as lâminas do microscópio com nitrogênio e coloque-as em tubos de microcentrífuga de 50 mL.
  3. Armazene as lâminas do microscópio conforme descrito na etapa 1.4.4.

3. Expressão e purificação de proteínas

  1. Preparação
    1. Plasmídeos: Clone o membro da família de alastina de interesse ou a mutação patogênica de interesse em um vetor de expressão bacteriana, por exemplo, pET-28a, e adicione um Avitag27. Introduza cisteínas em posições relevantes por mutagênese dirigida ao local (por exemplo, T51C e K400C27).
    2. Prepare os buffers a seguir.
      1. Meio de cultura Luria-Bertani (LB): Misture 10 g de triptona, 5 g de extrato de levedura e 10 g de cloreto de sódio em 1 L de ddH2O. Autoclave a 121 ° C por 20 min.
      2. Tampão de lise: Misture 25 mM de HEPES (pH 7,4), 150 mM de KCl, 5 mM de MgCl2, 1x coquetel completo de inibidor de protease livre de EDTA, 10 mM de imidazol e 0,5 mM de TCEP. Conservar a 4 °C.
      3. Tampão de lavagem: Misture 25 mM de HEPES (pH 7,4), 150 mM de KCl, 5 mM de MgCl2, 30 mM de imidazol e 0,5 mM de cloridrato de Tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP). Conservar a 4 °C.
      4. Tampão de eluição: Misture 25 mM de HEPES (pH 7,4), 150 mM de KCl, 5 mM de MgCl2, 150 mM de imidazol e 0,5 mM de TCEP. Conservar a 4 °C.
      5. Tampão de purificação: 25 mM de HEPES (pH 7,4), 150 mM de KCl, 5 mM de MgCl2, 0,5 mM de TCEP. Conservar a 4 °C.
  2. Purificação de proteínas
    1. Transfira os plasmídeos27 para células de E. coli Rosetta (DE3) (Biomed) usando métodos de choque térmico de transformação bacteriana. Suspender as células transferidas em meio de cultura LB com uma concentração final de 50 μg/μL de canamicina adicionada.
      1. Cultivar a 37 °C até que a absorvância do meio de cultura a 600 nm seja de 0,6-0,8. Adicionar isopropil-β-D-tiogalactosídeo (IPTG) a uma concentração final de 50 μM para induzir a expressão da proteína a 16 °C durante 20-24 h.
        NOTA: A taxa de crescimento de culturas de células bacterianas ou outras culturas de células microbianas pode ser monitorada medindo a densidade óptica (absorbância) da cultura de crescimento celular a 600 nm.
    2. Colha células por centrifugação a 4000 × g por 20 min à temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante.
    3. Ressuspenda o pellet celular com 30 mL de tampão de lise. Interrompa as células três vezes usando um triturador de células de alta pressão.
    4. Clarificar os lisados por centrifugação a 2,00,000 × g durante 1 h a 4 °C, utilizando um rotor de ultracentrifugação.
    5. Isole a proteína usando uma coluna de Ni-NTA. Lave a coluna Ni-NTA com tampão de lavagem para 5 volumes de coluna. Eluir proteína com tampão de eluição para 1 volume de coluna. Coletar o eluído e concentrar usando filtros centrífugos a ~ 500 μL.
    6. Além disso, purifique a proteína por cromatografiade exclusão de tamanho 27. Colete o eluído (500 μL por tubo).
    7. Confirme a proteína-alvo por seu peso molecular determinado por eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida (SDS-PAGE) 27 . Colete a proteína alvo para modificações posteriores.

4. Biotinilação de proteínas

  1. Preparação
    1. Prepare as seguintes soluções de estoque.
      1. Dissolva o acetato de magnésio tetrahidratado (MgOAc · 4H2O) em 25 mM de tampão HEPES (pH 7,7) a uma concentração de 100 mM (10×). Alíquota de 100 μL por tubo e armazenar a -20 °C.
      2. Dissolver o sal dissódico (ATP) de adenosina 5-trifosfato em ddH2O a uma concentração de 100 mM (10×). Ajuste o pH para 7,4 usando NaOH. Alíquota 100 μL por tubo e armazenar a -80 °C.
      3. Dissolver a d-biotina em ddH2O a uma concentração de 500 μM. Alíquota 100 μL por tubo e conservar a -20 °C.
      4. Dissolver a estreptavidina em ddH2O a uma concentração de 1 mg/ml. Alíquota de 20 μL por tubo e armazenar a -20 °C.
    2. Tampão de biotinilação de proteínas: Adicione 25 mM de HEPES (pH 7,7), 200 mM de potássio de ácido L-glutâmico e 0,5 mM de TCEP. Conservar a 4 °C.
    3. Purifique a biotina ligase BirA e armazene a -80 °C.
  2. Biotinilação de proteínas
    1. Mude o tampão de proteína para o tampão de biotinilação de proteína. Para biotinilação, misture 100 μL de 100 mM de ATP, 100 μL de 100 mM de MgOAc, 100 μL de 500 μM de d-biotina, 10 μL de 100 μM de bi-A biotina ligase, 50 μM de proteína até o volume final de 1 mL e incube durante a noite a 4 ° C.
    2. Remova a d-biotina livre usando um filtro centrífugo MWCO de 10 K.
    3. Incubar 20 μL de proteína biotinilada com 20 μL de estreptavidina 15 μM por 20 min no gelo. Detectar a eficiência da biotinilação de proteínas por SDS-PAGE27.

5. Marcação de fluoróforo de proteína

  1. Preparação
    1. Dissolver os fluoróforos LD555 (doador) e LD655 (aceptor) em dimetilsulfóxido (DMSO) até obter uma concentração final de 5 mM. Conservar a -20 °C.
    2. Prepare o tampão de rotulagem: Misture 25 mM de HEPES (pH 7,4), 150 mM de KCl e 5 mM de MgCl2. Conservar a 4 °C.
    3. Troque o tampão de proteína para o tampão de marcação.
  2. Marcação de fluoróforo
    1. Para ensaios intramoleculares de smFRET, misturar ATL1cito-TK com LD555 e LD655 numa proporção de 1:1,2:1,2 para um volume final de 100 μL (o volume total de fluoróforos não deve exceder 1 μL) e incubar durante 5 h a 4 °C.
    2. Para experimentos intermoleculares de smFRET, incubar ATL1cito-K ou ATL1cito-T com LD555 na proporção de 1:1,2 e, simultaneamente, incubar ATL1cito-K biotinilado com LD655 na proporção de 1:1,2, por 5 h a 4 °C (mesmo volume de incubação do ponto 5.2.1).
      NOTA: A co-incubação de proteínas e corantes permite flexibilidade nas posições de rotulagem para LD555 (doador) e LD655 (aceitador). O fato de LD555 ser rotulado como T51C ou K400C não afeta os resultados do experimento FRET. Um diagrama esquemático do doador sendo marcado no local T51C é fornecido (Figura 1C,D).
    3. Remover o excesso de fluoróforos livres utilizando colunas de dessalinização por centrifugação 7 K MWCO27.
    4. Adicione TCEP às proteínas marcadas com fluoróforo a uma concentração final de 0,5 mM.
    5. Detecte a eficiência de marcação de proteínas usando um espectrofotômetro. Meça a absorbância de proteínas a 280 nm, a absorbância de LD555 a 555 nm e a absorbância de LD555 a 655 nm e calcule as concentrações molares usando seus coeficientes de extinção, respectivamente. Eficiência de marcação de proteínas = (concentração molar de corante fluorescente/concentração molar de proteína) x 100%.

6. Imagem FRET de molécula única

  1. Preparação
    1. Prepare o tampão de incubação: Misture 25 mM de HEPES (pH 7,4), 150 mM de KCl e 5 mM de MgCl2. Conservar a 4 °C.
    2. Preparar 1 mg/ml de estreptavidina (dissolvido em ddH2O) e 1 mg/ml de anticorpo anti-His biotinilado para imobilização de proteínas.
    3. Preparar 25 mM de ácido benzóico (pH 7,4; dissolvido no tampão conforme descrito em 7.1.1) e 100 mM de protocatecuato 3,4-dioxigenase (PCD) (dissolvido em solução de glicerina a 40%) para minimizar o fotobranqueamento durante as experiências com smFRET.
    4. Preparar 100 mM de sal de sódio 5'-difosfato de guanosina (GDP), 5'-O-[gama-tio]trifosfato de guanosina (GTPγS) e soluções-mãe de AlCl3 dissolvidas em ddH2O. Preparar 1 M de solução-mãe de NaF dissolvida em ddH2O.
    5. Retire a lamínula e a lâmina do microscópio preservadas a vácuo e cole-as cuidadosamente com fita dupla face personalizada em uma bancada limpa. Instale mangueiras e pontas para formar uma câmara microfluídica com seis canais27.
      NOTA: Não exponha a lamínula modificada ao ar por longos períodos de tempo. Prepare a câmara microfluídica27 antes de iniciar os experimentos smFRET.
  2. Correção de mapeamento
    NOTA: Durante o experimento, os sinais de fluorescência devem ser coletados dos canais doadores e receptores, respectivamente. Devido ao uso de microscópios, pode haver pequenos desvios nos campos de monitoramento dos canais doadores e receptores. Para reduzir o desvio nos campos de monitoramento, a calibração do mapeamento deve ser realizada antes de iniciar o experimento.
    1. Misture bem 10% de partículas de poliestireno (diâmetro 3 μm), adicione 10 μL de partículas a uma lâmina de microscópio (não modificada) e cubra com uma lamínula (não modificada).
    2. Selecione um campo de visão com o maior número possível de partículas de poliestireno. Capture um vídeo em um campo claro usando microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRF).
      NOTA: Uma objetiva de imersão em óleo de alta abertura numérica (100x) foi usada para imagens de alta resolução. Para experimentos smFRET, os sinais foram capturados em intervalos de quadros de 30 ms usando uma câmera EMCCD.
    3. Use um script personalizado para alinhar a localização central da mesma partícula de poliestireno no canal doador e no canal aceitador e salve o arquivo de mapa como um arquivo txt. O código MATLAB personalizado usado neste estudo está disponível em https://github.com/yangchenguang-1994/HMM-FRET).
  3. Imobilizando as proteínas na câmara
    1. Para experimentos intermoleculares de smFRET, misture ATL1cito-K ou ATL1cito-T marcado com LD555 e ATL1cito-K-biotina marcado com LD655 em uma proporção de 1:1 com uma concentração final de 1 mM de GTPγS ou GDP/AlF4-, e incube por 1 h em gelo para dimerizar a proteína.
    2. Para experimentos de smFRET intermoleculares ATL1cito-T e ATL1cito-K , misture ATL1cito-T marcado com LD555 e ATL1cito-K-biotina marcado com LD655 na proporção de 1:1 com uma concentração final de 1 mM de GTPγS ou GDP/AlF4-, e incube por 1 h em gelo para obter proteínas dimerizadas.
    3. Para ensaios intramoleculares de smFRET, incubar ocito-TK ATL1 marcado com LD555 e LD655 com 1 mM de GDP por 1 h em gelo antes de realizar os experimentos de smFRET em condições de GDP.
    4. Para experimentos intermoleculares de smFRET, incube 10 μg / mL de estreptavidina (dilua com 200 μL de tampão de incubação) por 10 min para imobilizar proteínas. Para ensaios intramoleculares de smFRET, adicione 10 μg/mL de anticorpo anti-His biotinilado (diluído com 200 μL de tampão de incubação) e incube por 10 min para imobilizar as proteínas. Limpe o canal uma vez com um tampão de incubação antes de adicionar cada solução.
    5. Dilua o dímero ATL1 a ~ 0,3 nM ou monômero a ~ 1 nM em tampão de incubação de 200 μL e incube por 10 min para imobilizar proteínas no canal. Lave o canal com buffer de incubação duas vezes. Adicione ácido benzóico e PCD ao canal a uma concentração final de 2,5 mM (diluído com 200 μL de tampão).
      NOTA: Para simular os diferentes estágiosdas citomoléculas ATL1 no processo de hidrólise do GTP, o nucleotídeo (GDP, GTPγS e GDP / AlF4-) foi adicionado a uma concentração final de 1 mM aos tampões em cada etapa após a imobilização da proteína no canal. A adição de GTPγS imita a ligação de GTP, a adição deGDP / AlF 4- imita a hidrólise de GTP, a adição de GDP imita a liberação de Pi e o aposato representa a liberação de GDP.
  4. Imagens smFRET
    1. Ajuste o plano focal. Use os botões de foco grosso e fino, ajuste o plano focal para colocar a amostra em foco nítido. Aqui, um sistema de foco automatizado foi usado para obter o foco ideal.
    2. Configure a fonte de excitação. Use o laser de 532 nm como fonte de luz de excitação. Ajuste a potência do laser para um nível adequado para excitar os fluoróforos. Aqui, uma potência de laser de 20-40 mW foi usada.
    3. Conecte a câmera EMCCD ao microscópio. Configure a câmera para gravar em um intervalo de quadros de 30 ms. Certifique-se de que a câmera esteja configurada para capturar imagens no modo de 16 bits para dados de alta resolução.
    4. Grave o filme, garantindo que o foco permaneça estável durante toda a aquisição. Estenda o tempo de irradiação do laser de 532 nm o máximo possível até que a maioria das moléculas fluorescentes seja extinta ao registrar os sinais de fluorescência.
    5. Salve os filmes gravados no formato TIFF de 16 bits para análise posterior.

7. Aquisição e análise de dados

  1. Carregue o arquivo txt do mapa para correção antes de extrair as trajetórias FRET dos filmes gravados. Selecione as trajetórias FRET e salve todos os dados de trajetória FRET no formato txt para análise posterior.
  2. Extraia os dados dos arquivos txt e calcule os valores de FRET usando scripts caseiros no Matlab2022a. O código MATLAB personalizado está disponível em https://github.com/yangchenguang-1994/HMM-FRET.
    NOTA: O valor FRET é calculado usando a equação ILD655 / (γILD555 + ILD655). ILD555 e ILD655 representam as intensidades de fluorescência LD555 e LD655, respectivamente. γ é um parâmetro obtido pela fórmula γ = FA/FD. FA representa o decréscimo da intensidade do aceptor e FD é o incremento da intensidade do doador.
  3. Ajuste os dados smFRET do GaussAmp no Origin 2022 para obter o histograma de distribuição.
    NOTA: Para dados com vários estados FRET (os dados sob a condição GTPγS em smFRET intermolecular ou os dados de smFRET intramolecular sob condição GDP ou Apo), o ajuste multipico pode ser usado.

Resultados

Os experimentos smFRET foram realizados em um microscópio TIRF, capturando a intensidade de fluorescência dos fluoróforos a cada 30 ms. Imagens representativas de moléculasde citoplasma ATL1 marcadas com LD555 (doador) e/ou LD655 (aceptor) na ausência ou presença de diferentes nucleotídeos são mostradas na Figura 2A-C. As intensidades de fluorescência dos dois fluoróforos em partículas individuais foram...

Discussão

A tecnologia FRET é baseada na transferência de energia entre dois corantes fluorescentes (doador e aceitador). No caso de sua proximidade entre si (geralmente 1-10 nm), o doador excitado transfere sua energia para o receptor, resultando em uma diminuição na intensidade de fluorescência do doador e um aumento na intensidade de fluorescência do aceptor.

Em experimentos smFRET, as moléculas são diluídas a concentrações muito baixas e imobilizadas em l...

Divulgações

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

O X.B. é apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (32371287), pelos Fundos de Pesquisa Fundamental para as Universidades Centrais (63223043 e 63233053) e pelo Projeto de Treinamento de Talentos da Universidade de Nankai (035-BB042112). A YL é apoiada pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (12022409 e T2221001) e pelo Programa de Pesquisa Chave de Ciências de Fronteira do CAS (ZDBS-LY-SLH015). L.M. é apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (32271274 e 31770812).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
10 K Centrifugal FiltersAmiconUFC901096
3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES) Sigma-Aldrich440140
45 Ti rotor
532-nm laserOlympus
640-nm laserOlympus
7 K MWCO spin desalting columnsThermo Scientific89882
Adenosine 5-triphosphate disodium salt (ATP)Roche11140965001
Benzoic acidSigma-Aldrich242381
Biotin-PEG-SVA-5000Laysan Bio170-124
Biotinylated anti His antibodyBioss Antibodiesbs-0287R-bio
d-biotinSigma-AldrichB4501
EDTA-free protease inhibitor cocktailRoche11873580001
EMCCD cameraAndorIX897
Guanosine 5′-diphosphate sodium salt (GDP)Sigma-Aldrich G7127
Guanosine 5'-O-[gamma-thio]triphosphate (GTPγS)Roche10220647001
High numerical aperture oil immersion objectiveNikonNikon, 100x, N.A. 1.49, oil immersion
ImageJNIHhttps://imagej.net/ij/
Isopropyl-Β-D-ThiogalactosideSigma-AldrichI5502
LD555-MALLumidyne4
LD655-MALLumidyne10
L-glutamic acid potassiumSigma-AldrichG1501
Magnesium acetate tetrahydrateSigma-AldrichM0631
MatlabThe MathWorks, Natick, MAhttps://www.mathworks.com/
Microscope cover glassFisherbrand18834 (24 mm × 60 mm)
Microscope slidesCustomized, (75 mm × 26 mm × 1 mm) with 6 pairs of 1.2 mm diameter through holes
mPEG-SVA-5000Laysan Bio170-106
Ni Sepharose 6 Fast FlowCytiva17531802
OriginOrigin softwarehttps://www.originlab.com/
Polystyrene particlesQDSphereAG1265
Protocatechuate 3,4-dioxygenaseSigma-AldrichP8279
StreptavidinSangon BiotechA610492
Superdex 200 Increase (10/300 GL)Cytiva28990944
TIRF microscopeNikonTi2
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP)Thermo75259

Referências

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